Analysis of Protein Complex Formation at Micromolar Concentrations by Coupling Microfluidics with Mass Photometry

Myndert Claasen; Zornitsa Kofinova; Matteo Contino; Weston B. Struwe

doi:10.3791/65772

JoVE Journal > Biochemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

생화학

Analyse van de vorming van eiwitcomplexen bij micromolaire concentraties door microfluïdica te koppelen aan massafotometrie

Published: January 26, 2024

doi:

10.3791/65772

Myndert Claasen¹, Zornitsa Kofinova¹, Matteo Contino², Weston B. Struwe^3,4

¹Refeyn Ltd., ²Adaptix Ltd., ³Physical and Theoretical Chemistry Laboratory, Department of Chemistry,University of Oxford, ⁴The Kavli Institute for Nanoscience Discovery,University of Oxford

Summary

Dit protocol combineert massafotometrie met een nieuw microfluïdica-systeem om eiwit-eiwitinteracties met een lage affiniteit te onderzoeken. Deze aanpak is gebaseerd op de snelle verdunning van sterk geconcentreerde complexen in oplossing, wat metingen met een lage affiniteit mogelijk maakt en de toepasbaarheid van massafotometrie verbreedt.

Abstract

Massafotometrie is een veelzijdige massameettechnologie die de studie van biomoleculaire interacties en complexe vorming in oplossing zonder labels mogelijk maakt. Massafotometrie is over het algemeen geschikt voor het analyseren van monsters in het concentratiebereik van 100 pM-100 nM. In veel biologische systemen is het echter nodig om meer geconcentreerde monsters te meten om interacties met een lage affiniteit of voorbijgaande interacties te bestuderen. Hier demonstreren we een methode die het bereik van monsterconcentraties die kunnen worden geanalyseerd door massafotometrie effectief uitbreidt van nanomolair tot tientallen micromolairen.

In dit protocol wordt massafotometrie gecombineerd met een nieuw microfluïdisch systeem om de vorming van eiwitcomplexen in oplossing in het micromolaire concentratiebereik te onderzoeken. Met het microfluïdica-systeem kunnen gebruikers een monster op een gewenste hogere concentratie houden, gevolgd door verdunning tot het nanomolaire bereik – enkele milliseconden voorafgaand aan de massafotometriemeting. Vanwege de snelheid van de verdunning worden gegevens verkregen voordat het evenwicht van het monster is verschoven (d.w.z. dissociatie van het complex).

De techniek wordt toegepast om interacties te meten tussen een immunoglobuline G (IgG) antilichaam en de neonatale Fc-receptor, waarbij de vorming van complexen van hoge orde wordt aangetoond die niet kwantificeerbaar waren met statische massafotometriemetingen.

Concluderend maakt de combinatie van massafotometrie en microfluïdica het mogelijk om monsters in het micromolaire concentratiebereik te karakteriseren en is het bedreven in het meten van biomoleculaire interacties met zwakkere affiniteiten. Deze mogelijkheden kunnen worden toegepast in een reeks contexten – waaronder de ontwikkeling en het ontwerp van biotherapeutica – waardoor een grondige karakterisering van diverse eiwit-eiwitinteracties mogelijk wordt.

Introduction

Eiwit-eiwitinteracties onderstrepen de meeste cellulaire functies, van immuunregulatie tot DNA-replicatie en translatie. Als gevolg hiervan is er in de levenswetenschappen een fundamentele behoefte om een breed scala aan interacties te onderzoeken tussen verschillende heterogene complexen die vaak worden gevormd. Hun detectie, karakterisering en kwantificering zijn echter vaak een uitdaging, met name voor interacties met een lage affiniteit¹.

Immunoprecipitatietesten worden vaak gebruikt om interacties met hoge affiniteit te detecteren, maar voor interacties met lage affiniteit en voorbijgaande interacties is detectie grotendeels onhaalbaar. Fluorescentietechnieken kunnen ook worden gebruikt, maar vereisen de potentieel storende toevoeging van fluorescerende labels². Cryo-EM kan een structurele momentopname en een ensemble-uitlezing bieden van de gevormde eiwitcomplexen met een hoge ruimtelijke resolutie, maar vereist doorgaans ook werken met concentraties die te laag zijn voor beeldvorming van interacties met een lage affiniteit. Cryo-EM brengt ook uitdagingen met zich mee op het gebied van kosten, toegankelijkheid, monstervoorbereiding en analysetijd³.

Bovendien is oppervlakteplasmonresonantie (SPR) een populaire manier geworden om eiwit-eiwitinteracties te kwantificeren, hoewel het eiwitimmobilisatie vereist, wat het bindingsevenwicht kan beïnvloeden en kan resulteren in variabele on-rates, waardoor de meetnauwkeurigheid wordt verminderd ^4,5. Het omvat ook verschillende teststappen voorafgaand aan het verzamelen en analyseren van gegevens⁶.

Massafotometrie is een techniek met één molecuul die is gebruikt om eiwit-eiwitinteracties te analyseren ^5,6,7. Het werkt door de massa van afzonderlijke moleculen of complexen te meten op basis van het licht dat ze verstrooien wanneer ze op het oppervlak van een glazen dekglaasje landen⁸. Massafotometriemetingen zijn gebruikt om bindingsaffiniteiten te kwantificeren uit de relatieve overvloed aan bindingspartners en de complexen die ze vormen⁵. Niettemin moet de concentratie van het te meten monster, net als bij andere technieken met één molecuul, doorgaans minder dan 100 nM zijn. Als de concentratie hoger is, zullen de moleculen die op het glasoppervlak landen elkaar ruimtelijk overlappen, wat resulteert in een slechte gegevenskwaliteit⁷. Bijgevolg kunnen zwakkere interacties (K_D ~ micromolaren), die bij deze lagere concentraties dissociëren, niet betrouwbaar worden gemeten, aangezien het niet mogelijk is om het noodzakelijke mengsel van ongebonden en gebonden soorten⁵ waar te nemen.

Hier beschrijven we een aanpak die deze beperking overwint op basis van een nieuw gekoppeld microfluïdisch massafotometrie-apparaat. In het bijzonder wordt een microfluïdisch systeem gebruikt in combinatie met de massafotometer om het scala aan interacties dat kan worden gekwantificeerd door massafotometrie effectief uit te breiden. Van microfluïdica is aangetoond dat het een scala aan mogelijkheden biedt voor het onderzoeken van eiwit-eiwitinteracties, waaronder snelle verdunning om zwakke interacties te detecteren ^1,9. Het hierin beschreven systeem werkt door het monster snel tot 10.000 keer te verdunnen op een microfluïdische chip en het onmiddellijk over het observatiegebied van de chip te laten stromen, waardoor de massafotometriemeting kan beginnen binnen 50 ms vanaf het moment dat de moleculen het verdunningsproces begonnen¹⁰. De verdunning vindt plaats wanneer het monster en de buffer worden gecombineerd in een omgekeerde Tesla-klepmixer op de chip, waarbij de relatieve stroomsnelheden van de twee oplossingen de hoeveelheid verdunning bepalen die optreedt (zie protocolstap 8). Het debiet is regelbaar met de microfluïdische regelsoftware. Het veranderen van de stroomsnelheid kan de relatieve populatie van de soort veranderen, omdat dit van invloed kan zijn op het aantal landingsgebeurtenissen op het oppervlak van het glas, wat wordt gemeten door de massafotometer.

De snelheid van het proces is hoog genoeg om de meting af te ronden voordat de integriteit van de interactie is verstoord (voor meer details, zie ook de Discussie). Dit kan worden begrepen door een korte blik te werpen op de theorie van eerste-orde reacties, waar . De voorwaartse (associatie) snelheidsconstante is k_f, de achterwaartse (dissociatie) snelheidsconstante is k_b en de evenwichtsdissociatieconstante (K_D) wordt gedefinieerd als

K_D= k_b/ k_f

Voor eiwitbinding wordt k_fover het algemeen beperkt door de diffusie van de reactanten¹¹ en is dus beperkt tot het bereik van 10 6-10⁷ ^M-1·^s-1. Omdat het bereik van beperkt is, zal een reactie met een lage affiniteit (K_D~micromolaren) k_b≈ 1 ^s-1 hebben. Dat wil zeggen, k_b= k_f · K_D= (10⁶ ^M-1·^s-1) (^10-6 M) = 1 ^s-1, met een halfwaardetijd van het complex rond 0,7 s^11,12.

Ons voorbeeldsysteem is de binding van het IgG monoklonale antilichaam trastuzumab aan het oplosbare domein van de IgG neonatale Fc-receptor (FcRn), waarvan bekend is dat ze op elkaar inwerkende partners^{zijn 13}. Eerder gepubliceerde gegevens verkregen met behulp van conventionele massafotometrie alleen (d.w.z. met handmatige verdunning van monsters) toonden aan dat de eiwitten meerdere soorten vormen. FcRn-monomeren, FcRn-dimeren en ongebonden IgG waren duidelijk zichtbaar, terwijl IgG-FcRn-complexen (in verhoudingen van 1:1 en 1:2) ook werden gedetecteerd (bij pH 5,0), maar alleen met een zeer lage abundantie⁵. Deze waarneming roept de vraag op of de vorming van het IgG-FcRn-complex duidelijker kan worden gedetecteerd als het bij een hogere concentratie wordt gemeten. Inderdaad, het combineren van massafotometrie met een gekoppelde snelle verdunningsbenadering die hier wordt beschreven, leverde robuuster bewijs van complexe vorming door een toename van hun gemeten deeltjes.

Het hier beschreven protocol voor massafotometrie en microfluïdica maakt het mogelijk om de vorming van complexen met een K_D tot aan het micromolaire bereik te karakteriseren. Een empirische bepaling van de K_D vereist verdere verbeteringen op het gebied van de nauwkeurigheid van de flowsensor, de stabiliteit van de pomp, chip-to-chip-variaties en de meetlocatie binnen het observatievenster, aangezien al deze factoren van invloed zijn op de tijd vanaf het moment dat het monster wordt verdund tot het moment dat het wordt gemeten.

Dezelfde benadering zou kunnen worden toegepast om de binding tussen oplosbare eiwitten te onderzoeken, op voorwaarde dat ze verschillende molecuulgewichten hebben (gescheiden door ten minste 25 kDa) die binnen het bereik vallen dat geschikt is voor analyse met een massafotometer (30 kDa tot 6 MDa). De verkregen inzichten kunnen nuttig zijn voor studies in verschillende contexten – van het verkrijgen van een mechanistisch begrip van cellulaire functies tot het ontwerp van nieuwe biotherapeutische geneesmiddelen.

Protocol

1. Voorbereiding van de instrumenten en lancering van de software Schakel de massafotometer in en laat deze ten minste 1 uur aan staan voordat u met metingen begint.OPMERKING: Dit komt omdat het instrument een constante temperatuur moet bereiken. Als u de massafotometer 1 uur niet aan laat staan, kan dit leiden tot een massaverschuiving en dus tot onnauwkeurige resultaten. Schakel de anti-vibratietafel in door de stroom in te schakelen en op de isolatieknop (onder de massafotometer) te drukken. Trillingen beperken de prestaties van het massafotometrie-instrument, dus de anti-vibratietafel is belangrijk om een maximale gevoeligheid van het instrument te garanderen. Zet de microfluïdica-box aan. Start de data-acquisitiesoftware en de microfluïdische besturingssoftware. Zet de luchtcompressor aan. 2. Bereiding van eiwitmonsters, buffer- en reinigingsoplossingen Voeg 200 ml PBS-buffer (pH 7,4) toe aan een schone fles van 200 ml en 200 ml PBS-buffer (pH 5,0) aan een tweede fles van 200 ml.NOTITIE: De flessen van 200 ml moeten in de volgende stappen worden aangesloten op de “L” Flow Unit Sensor. Gebruik een pH 7,4 PBS-buffer voor de kalibratiemeting en een pH 5,0 PBS-buffer voor de monstermeting. Meng in een centrifugebuis van 0,5 ml IgG (2 μM) en FcRn (20 μM) in een verhouding van 1:10 voor een totaal volume van 60 μl.De voorraadoplossingen voor FcRn en IgG zijn respectievelijk 91,9 μM en 13,5 μM. Bereid de reactie voor door 9 μL voorraad IgG + 13 μL bouillon FcRn + 38 μL PBS (pH 5,0, kamertemperatuur [RT]) te mengen in een centrifugebuis voor een totaal volume van 60 μL. De uiteindelijke concentraties voor de twee reactanten waren 2 μM voor IgG en 20 μM voor FcRn. Houd alle eiwitvoorraden tijdens dit proces op ijs. Doseer in een andere centrifugebuis van 0,5 ml 20 μl van het β-amylase-calibrant met een concentratie van 20 μM.Voor de bereiding van de hier gebruikte β-amylase-calibrant volgt u bijvoorbeeld de procedure die is beschreven in de punten 2.3.1.1-2.3.1.2.Resuspendeer 20 mg β-Amylase-poeder in de injectieflacon in 3,57 ml PBS (5% glycerol), overeenkomend met 5,6 mg/ml en een molaire concentratie van 100 μM (aangezien het molecuulgewicht 56 kDa is). Om te verdunnen tot 20 μM, combineert u 200 μL van de 100 μM-voorraad met 800 μL PBS (pH 7,4, RT) in een centrifugebuis van 1 ml. Incubeer de monsters bij RT gedurende ten minste 30 minuten.OPMERKING: Begin met het voorbereiden van de monster- en calibrantverdunningen na het inschakelen van de massafotometer. Voor dit experiment werden de monsters gedurende 120 minuten geïncubeerd. In drie centrifugebuisjes van 50 ml, aliquot: 50 ml PBS (pH 7,4) – reinigingsoplossing 1 (CS1), 50 ml 0,5 M NaOH – reinigingsoplossing 2 (CS2) en 50 ml 100% IPA – reinigingsoplossing 3 (CS3). 3. Experimentele opzet Om het monster en de remklauw te laden, plaatst u de calibrantcentrifugebuis op positie 4 en de monstercentrifugebuis op positie 5 van de microfluïdica-doos (Figuur 1). Om de reinigingsoplossingen te laden, plaatst u CS1, CS2 en CS3 op posities 1, 2 en 3 van de microfluïdica-doos (Figuur 1).NOTITIE: Het monster, de remklauw en de reinigingsoplossingen zijn aangesloten op de multischakelaar (m-schakelaar). De m-schakelaar is verbonden met de sensor van de “S”-flow-eenheid. Schroef de dop die op de bufferleiding is aangesloten op de bufferfles van 200 ml (pH 7,4).NOTITIE: De bufferleiding is aangesloten op een afsluitklep, die is aangesloten op de sensor van de “L”-floweenheid. De afsluiter voorkomt heveleffecten die kunnen optreden wanneer de bufferstroom wordt gestopt. Overhevelen kan leiden tot vervuiling van de buffer door de verdunde restvloeistof die terugkeert naar het bufferreservoir. Plaats de microfluïdica-chip op een voorbereidingsplaat.Duw het andere buisuiteinde van de sensor van de “S”-floweenheid in de “Monsterinlaat” van het eerste kanaal in de microfluïdica-chip (Figuur 1). De monsterregel is compleet. Duw het andere buisuiteinde van de sensor van de “L”-floweenheid in de “Bufferinlaat” van het eerste kanaal in de microfluïdica-chip (Figuur 1). De bufferlijn is compleet. Om de uitstroom op te vangen, duwt u een buis naar de “Outlet” van het eerste kanaal in de microfluïdica-chip; plaats het andere uiteinde zo dat het uitmondt in een opvangbak voor afval in een kolf of bekerglas (Figuur 1). 4. Het monster en de bufferlijnen vullen met buffer Open de handmatige afsluiter op de bufferleiding. Stel in de microfluïdische besturingssoftware het debiet van de bufferleiding in op 1000 μL/min en zorg ervoor dat de druk van de bufferleiding niet hoger is dan 110 mbar (Figuur 2). De stroom start automatisch in de bufferlijn (Figuur 1).NOTITIE: Als de druk van de bufferleiding hoger is dan 110 mbar, kan dit te wijten zijn aan lucht die door de stroomsensor stroomt. Als de druk niet binnen enkele seconden weer normaal is, is er mogelijk een verstopping (meestal als gevolg van beknelde slangen bij de aansluitingen). Stop in dat geval de stroom en controleer de aansluitingen in de bufferleiding, te beginnen bij de afsluiter. Selecteer in de microfluïdische besturingssoftware positie 1 van de m-schakelaar (overeenkomend met de PBS-buffer), stel vervolgens het debiet van de bemonsteringsleiding in op 8 μl/min en zorg ervoor dat de druk van de bemonsteringsleiding niet hoger is dan 350 mbar. De stroom start automatisch in de monsterregel (Figuur 1). Gebruik een pipetpunt (of een ander zacht plastic onderdeel) om lichte druk van bovenaf uit te oefenen in de buurt van de bel(s) die in de chip zitten om luchtbellen los te maken en ervoor te zorgen dat ze via de uitlaat worden verwijderd.OPMERKING: Zorg ervoor dat u alle luchtbellen in de secties ‘mixer’ en ‘observatiegebied’ (Figuur 1) van het gebruikte kanaal verwijdert. Zorg ervoor dat u niet te hard duwt, omdat dit de chip kan beschadigen. 5. Het plaatsen van de microfluïdische chip op de massafotometer en het vinden van de focus Breng een druppel microscoop-immersieolie aan op het objectief van de massafotometer. Plaats de microfluïdica-chip op de houder van de massafotometer met de “Sample Inlet” naar boven gericht en houd deze bevestigd aan de objecttafel clamps (Figuur 1). Zorg ervoor dat alle slangaansluitingen bevestigd blijven. Verplaats de werktafel met behulp van de data-acquisitiesoftware om ervoor te zorgen dat het “Observatiegebied” van kanaal 1 is uitgelijnd met het doel (Figuur 1). Sluit het deksel van de massafotometer en druk op de optie Druppelverdunning Find Focus in de data-acquisitiesoftware. Controleer de witte scherpstelring in de linkerbenedenhoek van de data-acquisitiesoftware (Figuur 3). Openingen in de ring duiden op de aanwezigheid van een luchtbel in de immersieolie; Verwijder dit door de snelheid van het werkstuk tot het maximum te verhogen en het werkstuk voorzichtig zijwaarts te bewegen. Nadat het scherpstellen is voltooid, wacht u 2-3 minuten voordat u de eerste opname maakt. Druk vervolgens op Opnemen om een meting van 1 minuut op te nemen en zorg ervoor (door de meting te observeren) dat er geen onzuiverheden verschijnen.OPMERKING: Onzuiverheden kunnen zich op het glasoppervlak of in de buffer bevinden. De scherptewaarde in de data-acquisitiesoftware moet boven de 4,5% liggen. 6. Kalibratie van massafotometrie Zet in de microfluïdische besturingssoftware de m-schakelaar in stand 4 (overeenkomend met de remklauw) en zorg ervoor dat de stroomsnelheid van de bemonsteringsleiding is ingesteld op 8 μl/min en dat de druk van de bemonsteringsleiding niet hoger is dan 350 mbar (Figuur 2).De calibrant begint de stroom door de chip. Wacht ongeveer 1,5-2,5 minuut (of totdat de calibrant consequent wordt gezien op de data-acquisitiesoftware). De tijd kan variëren afhankelijk van de lengte van de monsterleiding. Zodra de calibrant consistent wordt gezien (d.w.z. het aantal gebeurtenissen is voldoende voor een nauwkeurige massafotometriemeting), verlaagt u in de microfluïdische besturingssoftware de stroomsnelheid tot 0,5 μL/min – het beoogde verdunningsniveau voor dit experiment.OPMERKING: Door te beginnen met een hoger debiet wordt de tijd die het calibrant nodig heeft om de chip te bereiken gewoon verkort. Zorg ervoor dat er niet “te weinig” of “te veel” moleculen op het meetoppervlak terechtkomen (Figuur 4).Als de dichtheid van de landingsgebeurtenis niet “ideaal” is (Figuur 4), wijzigt u de stroomsnelheid in de microfluïdische besturingssoftware. Als de dichtheid van de gebeurtenissen te laag is, verhoog dan de stroomsnelheid van het monster totdat goed gescheiden landingsgebeurtenissen worden waargenomen (maar niet hoger zijn dan 8 μl/min). Als het te hoog is, verlaag dan de monsterstroomsnelheid (maar ga niet onder de 0,1 μL/min). Als het volume van het calibrant in de monsterbuis bijna op is, verander dan de stand van de m-schakelaar in de PBS pH 7.4-lijn (positie 1) om te voorkomen dat er lucht wordt geïnjecteerd. Druk op Opnemen en voer een meting van 60 s uit. Sla het bestand op in een gekozen map.OPMERKING: De software voor gegevensverzameling produceert bestanden met .mp als extensie. 7. Reinigen van de monsterleiding en stoppen van de stroom Schakel in de microfluïdische besturingssoftware naar positie 2 van de m-schakelaar en verander de monsterdruk naar 800 mbar (Figuur 2). Spoel het systeem door met CS2 (NaOH) gedurende 4 minuten. Schakel naar stand 3 van de m-schakelaar en spoel het systeem gedurende 4 minuten door met CS3 (IPA). Schakel naar stand 1 van de m-schakelaar en spoel het systeem gedurende 4 minuten door met CS1 (PBS). In de microfluïdische besturingssoftware stopt u alle stroom door de druk van de monsterleiding en de bufferleiding op 0 in te stellen en de bufferklep af te sluiten. Koppel de chip los van de tafel en plaats deze terug op de voorbereidingsplaat. Koppel alle slangen los en plaats het uiteinde van de monsterslang in een afvalfles. Reinig het objectief met isopropanol en doekjes. 8. Het meten van het massafotometriemonster Draai de dop los die is aangesloten op de bufferfles van 200 ml (pH 7,4) en schroef deze op de bufferfles van 200 ml (pH 5,0). Herhaal stap 3.4-5.6, maar gebruik het tweede kanaal van de chip in plaats van het eerste. Zet in de microfluïdische besturingssoftware de m-schakelaar in stand 5 (overeenkomend met het monster), stel het debiet van de monsterleiding in op 8 μL/min en zorg ervoor dat de druk van de monsterleiding niet hoger is dan 350 mbar (Figuur 2). Herhaal stap 6.2-6.4 om het monster te meten.Om de te gebruiken stroomsnelheden te berekenen, moet u ervoor zorgen dat het vouwverschil in stroomsnelheid overeenkomt met de gewenste monsterverdunningsfactor. Om hier bijvoorbeeld de verdunning van 2000x te bereiken, verschillen de stroomsnelheden met een factor 2000; de bufferstroomsnelheid is 1000 μL/min en de bemonsteringsstroomsnelheid is 0,5 μL/min. Laat aan het einde van een experiment de lijnen altijd schoon door het reinigingsprotocol te volgen. 9. Analyse van de gegevens Zodra het verzamelen van gegevens is voltooid, start u de gegevensanalysesoftware (Afbeelding 5). Klik op het plusje (+) linksboven en selecteer het .mp calibrant bestand. De software begint met het analyseren van het geladen bestand. Afhankelijk van de grootte en het aantal metingen kan dit enkele minuten durenAnalyseer geen .mp-bestanden in de gegevensanalysesoftware tijdens het verzamelen van gegevens met gegevensverzamelingssoftware, omdat dit de kwaliteit van de verkregen gegevens kan verminderen. Druk op de knop Massakalibratie maken (rechtsonder). Er wordt een dialoogvenster geopend met een tabel die is gevuld met de contrastwaarden van de aangebrachte pieken. Wijzig de waarden in de bekende massawaarden voor de gemonteerde pieken (voor β-amylase zijn deze waarden 56 kDa, 112 kDa en 224 kDa) en druk op Opslaan. Het nieuw gemaakte kalibratiebestand (.mc-extensie) verschijnt op het paneel Massakalibratie (linksonder in de gegevensanalysesoftware) (Afbeelding 6). Klik op het pluspictogram (+) in de linkerbovenhoek en selecteer het .mp-voorbeeldbestand. Om een massahistogram te maken, zoals weergegeven in afbeelding 5, gaat u naar het tabblad Analyse , selecteert u de histogrammodus en de optie Massaplot . Pas de breedte van de opslaglocatie, massalimieten en andere parameters indien nodig aan. Pas de plot desgewenst verder aan in het tabblad Figuren voordat u cijfers exporteert en/of de hele werkruimte opslaat als een .dmp bestand.

Representative Results

Massafotometrie werd gebruikt om de interactie tussen het IgG monoklonale antilichaam trastuzumab en het oplosbare domein van de IgG neonatale Fc-receptor (FcRn) te meten. Een 1:10 mengsel van de twee eiwitten (bij 2 μM voor IgG en 20 μM voor FcRn) werd handmatig verdund tot respectievelijk 10 nM en 20 nM in PBS. De verdunningsstap is nodig omdat massafotometrie, een techniek voor massameting met één molecuul, alleen monsters in het bereik van 100 pM-100 nm kan analyseren. Pogingen om monsters te meten met concentraties buiten dit bereik kunnen de nauwkeurigheid van de resultaten in gevaar brengen (Figuur 4). Dit experiment is niet opgenomen in dit protocol, zoals het eerder is beschreven 5,6. In de massahistogrammen die in een massafotometrie-experiment worden geproduceerd, wordt de sterkte van het verstrooiingssignaal (of ‘contrast’) voor elke landingsgebeurtenis uitgezet op de x-as en wordt deze omgezet in moleculaire massa via de massa-contrastkalibratiestap. Ondertussen geeft de y-as het aantal moleculen aan dat met een bepaalde massa (of contrast) wordt geteld. Daarom geeft een piek de aanwezigheid aan van een populatie moleculen binnen het bereik van molecuulgewichten weergegeven op de x-as. Het aantal gebeurtenissen (tellingen) waaruit de piek bestaat, weerspiegelt de omvang van die populatie. De massafotometriemeting met handmatige verdunning resulteerde in een massahistogram waarbij de twee grootste pieken, gebaseerd op het verwachte molecuulgewicht van de eiwitten, overeenkwamen met ongebonden FcRn-monomeren (~50 kDa) en IgG-antilichaammonomeren (~150 kDa) (Figuur 7). Net als in de eerder gepubliceerde massafotometriegegevens5 waren de ongebonden soorten prominent aanwezig, terwijl pieken in de massabereiken die zouden overeenkomen met complexen veel minder duidelijk waren. Het experiment werd herhaald met behulp van een microfluïdica-systeem met snelle verdunning om het mengsel onmiddellijk voorafgaand aan de massafotometriemeting te verdunnen tot de noodzakelijke concentratie. Deze aanpak maakte de detectie mogelijk van extra complexen met een lage affiniteit, die mogelijk zijn gedissocieerd tijdens de handmatige verdunningsstap. Om dezelfde verdunningsfactor van 2000x te bereiken die tijdens het handmatige verdunningsexperiment werd gebruikt, werd het 1:10 monstermengsel (met een concentratie van 2 μM voor IgG en 20 μM voor FcRn) op de microfluïdische chip gestroomd met een snelheid van 0,5 μL/min, samen met PBS-buffer (pH 5,0) met een stroomsnelheid van 1 ml/min. Om ervoor te zorgen dat de eiwitten niet werden afgebroken op het moment van de meting, werden IgG (2 μM) en FcRn (20 μM) gemeten onder stroom met het microfluïdica-systeem na 120 minuten incubatie van de monsters. Individuele controlemetingen toonden geen eiwitafbraak (aanvullende figuur 1) Voor het monster dat een snelle verdunning onderging, konden de pieken die overeenkomen met FcRn-monomeren (53 kDa), FcRn-dimeren (97 kDa) en IgG-monomeren (148 kDa) opnieuw worden waargenomen. Ook werden duidelijk twee extra pieken waargenomen bij 196 kDa en 251 kDa, wat overeenkomt met IgG-FcRn-complexen met 1:1 en 1:2 stoichiometrieën (Figuur 7). De verwachte massa’s voor deze twee complexen waren respectievelijk 200 kDa en 250 kDa. De variabiliteit in de massameting ligt binnen de meetfout voor de massafotometer die in dit onderzoek is gebruikt en is ±5 (2% voor het 1:1-complex en 0,4% voor het 1:2-complex). De aanwezigheid van deze complexen in alleen het snel verdunde monster komt overeen met het idee dat ze de neiging hebben om te dissociëren bij lagere concentraties, met een snelheid die snel is ten opzichte van een handmatig verdunningsproces, maar langzaam ten opzichte van het proces van snelle verdunning dat wordt bereikt met het microfluïdica-systeem15. Figuur 1: Combinatie van microfluïdica met massafotometrie. (A,B) De microfluïdica-box die in dit protocol wordt gebruikt, gezien vanaf de (A) voorkant en (B) bovenkant. De reinigingsoplossingen worden op de posities 1-3 geplaatst en de monsters en calibranten op de posities 4-6. Alle oplossingen zijn aangesloten op de m-schakelaar, die is aangesloten op de sensor van de “Small” flow-unit. (C) Overzicht van het gehele systeem. De computer (linksboven) is aangesloten op de microfluïdica-box (afgebeeld naast de buffer en monsterbuisjes) en de massafotometer (rechtsonder), waar de microfluïdica-chip zich bevindt. De kleine debietmonitor (FRMS) bewaakt de stroom door de bemonsteringsleiding, terwijl de grote debietmonitor (FRML) de bufferstroom bewaakt. De monster- en bufferleidingslang worden aangesloten op een kanaal op de microfluïdica-chip, die in de massafotometer is geplaatst. (D) Elke chip heeft drie kanalen. Het FRMS is aangesloten op de monsterinlaat en FRML op de bufferinlaat. In het menggebied vindt een snelle monsterverdunning plaats, terwijl in het observatiegebied de massafotometriemetingen worden uitgevoerd. De uitlaat wordt bewaakt door een extra flowsensor om ervoor te zorgen dat er geen lekken in de chip zijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: De besturingssoftware voor microfluïdica. Met deze software kunt u de stroomsnelheden, de drukleidingen van het microfluïdica-systeem en de positie van de multischakelaar (m-schakelaar) instellen en bewaken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Identificatie van de aanwezigheid van luchtbellen in de olie. De voorbeelden uit de data-acquisitiesoftware tonen een heldere, ononderbroken scherpstelring (links) en een ‘kapotte’ ring, wat wijst op de aanwezigheid van luchtbellen in de dompelolie (rechts). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Representatieve voorbeelden van monsterconcentraties waarbij het aantal molecuullandingsgebeurtenissen te weinig, ideaal of te veel is. Moleculen die op het oppervlak van het observatiegebied in de microfluïdica-chip landen, verschijnen als donkere vlekken in de ratiometrische weergave van het massafotometriebeeld. Optimaal moet de gewenste concentratie het mogelijk maken om een ideale dichtheid van landingsgebeurtenissen te laten plaatsvinden tijdens het verzamelen van gegevens (midden). Als de dichtheid van de landingsgebeurtenis te laag is (boven, ‘Te weinig’), kan een nauwkeurige statistische analyse van de massafotometriegegevens niet worden voltooid. Als het te hoog is (onderkant, ‘Te veel’), zullen de landingsmoleculen elkaar ruimtelijk overlappen, wat zal resulteren in een slechte datakwaliteit. Deze beelden werden vastgelegd met de data-acquisitiesoftware met behulp van een massafotometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5: Een schermopname van de data-analysesoftware voor massafotometrie. Hier kunnen de .mp-bestanden die uit de data-acquisitiesoftware zijn geëxporteerd, worden geladen om de gegevens te analyseren. Uit de verwerkte gegevens kunnen cijfers worden gegenereerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 6: Een schermopname van de massa-contrastkalibratie voor dit experiment. De gebruikte calibrant was β-Amylase, waarvan bekend is dat het drie soorten vormt: monomeer (56 kDa), dimeer (112 kDa) en tetrameer (224 kDa). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 7: Massahistogrammen laten complexe vorming pas zien na snelle monsterverdunning. Massahistogrammen en bijbehorende best passende Gauss-verdelingen worden getoond voor metingen van monsters die IgG en FcRn bevatten na handmatige verdunning (oranje) of snelle verdunning via het microfluïdischeHC-systeem (blauw). De massalabels geven aan dat de gemiddelde waarden van de Gauss-curven overeenkomen met de massahistogrammen gemeten na snelle verdunning. Na handmatige verdunning werden pieken waargenomen die overeenkomen met FcRn-monomeren (52 kDa, gemeten met handmatige verdunning) en IgG-monomeren (152 kDa). Na snelle verdunning werden naast de FcRn- en IgG-monomeren ook duidelijk pieken waargenomen die overeenkomen met FcRn-dimeren en IgG-FcRn-complexen met 1:1 en 1:2 stoichiometrie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Aanvullende gegevens Figuur 1: Massafotometriemetingen van controlemonsters na snelle verdunning laten geen eiwitafbraak zien. (A) Massahistogram en de best passende Gauss-verdeling voor de steekproef met alleen FcRn. De initiële monsterconcentratie vóór de snelle verdunning was 20 μM en het debiet werd ingesteld op 0,5 μl/min. Massapieken die overeenkomen met FcRn-monomeren (53 kDa) en FcRn-dimeren (97 kDa) konden worden waargenomen. (B) Massahistogram en de best passende Gauss-verdeling voor het monster dat alleen IgG (Herceptin) is. De initiële monsterconcentratie voorafgaand aan de snelle verdunning was 2 μM en de stroomsnelheid werd ingesteld op 1 μL/min. Een enkele massapiek die overeenkomt met IgG-monomeer (155 kDa) kon worden waargenomen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Het hier beschreven protocol biedt een methode voor het detecteren en kwantificeren van eiwit-eiwitinteracties met een lage affiniteit. Het maakt gebruik van een massafotometer die is gekoppeld aan een microfluïdicasysteem met snelle verdunning. Massafotometrie is een labelvrij, bioanalytisch hulpmiddel dat op betrouwbare wijze de moleculaire massa in oplossing kan meten voor biomoleculen¹⁶, voor die binnen het bereik van 30 kDa tot 6 MDa. Aangezien massafotometrie een techniek met één molecuul is die monsters één voor één analyseert, is deze over het algemeen beperkt tot monsters in het concentratiebereik van 100 pM-100 nM. Boven dit bereik zullen de moleculen die op het glasoppervlak landen elkaar ruimtelijk overlappen, wat resulteert in een slechte gegevenskwaliteit; Onder dit bereik worden te weinig gegevens verkregen om een robuuste analyse uit te voeren⁷. Een belangrijk gevolg is dat het onderzoek naar eiwitinteracties kan worden beperkt tot die welke een mengsel vormen van gebonden en ongebonden soorten binnen dat bereik.

Hier hebben we een stapsgewijs protocol uitgewerkt voor het gebruik van een microfluïdisch systeem met snelle verdunning om het bereik van monsterconcentraties die vatbaar zijn voor massafotometrie effectief uit te breiden. Door het monster op de microfluïdische chip te verdunnen en het vervolgens binnen 50 ms over het observatievenster van de detector te laten stromen, vangt het systeem de complexen op die aanwezig zijn in het onverdunde monster voordat het interactie-evenwicht verschuift. Het monster wordt tijdens individuele metingen continu aan de detector geleverd. Onder deze omstandigheden blijft 95% van het complex intact wanneer het monster wordt gemeten, zelfs voor interacties met een lage affiniteit – met een K_Din de orde van micromolaren en dissociatiepercentages zo snel als 1 ^s-1.

Dit kan als volgt worden berekend: Voor een reactie met een voorwaartse snelheid k_fen een achterwaartse snelheid k_b,

Bij evenwicht blijven de concentraties van alle drie de soorten (A, B en het complex AB) constant, dus en . Onder de conservatieve veronderstelling dat de verstoring (verdunning, in dit geval) het complex kan doen dissociëren, maar de voorwaartse (associatie) reactie niet verloopt, kan de term k_f[A] [B] als verwaarloosbaar worden beschouwd, en kan de volgende vereenvoudiging worden gemaakt:

Integreren geeft de volgende uitdrukking voor de concentratie van complex op het moment na de verstoring van het evenwicht:

De fractie van het complex die op tijdstip t na de verstoring van het evenwicht gebonden blijft, is dus:

Bij = 50 ms, voor een reactie met k_b≈ 1 ^s-1, is de breuk gebonden 0,95, of 95%^11,12.

Massafotometrie werd hier en eerder⁵ gebruikt om de binding van het IgG monoklonale antilichaam trastuzumab aan het oplosbare domein van de FcRn te onderzoeken. Van de twee bindingspartners is gemeld dat ze binden met nanomolaire affiniteit bij zure pH¹⁷. Massafotometrie werd gebruikt om de overvloed van de gevormde complexen kwalitatief te beoordelen terwijl de bindingspartners een pH van 5,0 hadden, en de monsters werden snel verdund via een extra microfluïdisch systeem. De procedure werd geoptimaliseerd voor de specifieke eiwit-eiwitinteractie op basis van eerder gerapporteerde resultaten⁵. Dezelfde procedure kan worden gebruikt om andere interacties te bestuderen, op voorwaarde dat de gebruikers voorkennis hebben of de experimentele omstandigheden voor het betreffende systeem optimaliseren, zoals welke buffers moeten worden gebruikt, de initiële eiwitconcentratie, de verwachte stoichiometrie en de hoeveelheid incubatie die nodig is om de interactie een evenwicht te laten bereiken.

Toen het IgG-FcRn-mengsel handmatig werd verdund, was het moeilijk om de aanwezigheid van IgG-FcRn-complexen te detecteren, hoewel bekend is dat deze^{eiwitten interageren} 5. Dit artikel laat zien dat de snelle verdunningsbenadering resulteert in een aanzienlijk verhoogde hoeveelheid van deze complexen. Voor hetzelfde monster, wanneer snelle verdunning werd gebruikt, werden 1:1 FcRn-IgG-complexen en 2:1 FcRn-IgG-complexen beide duidelijk waargenomen. Deze verschillen in complexe vorming tonen het belang aan van het bestuderen van biomoleculaire interactiesystemen over een breed scala aan concentraties.

Bovendien tonen deze resultaten ook aan dat het eenvoudig is om microfluïdica te gebruiken met analyse van één molecuul om zwakke interacties vast te leggen – waarmee een aanzienlijke leemte in de methode wordt opgevuld. De combinatie van microfluïdica met snelle verdunning met massafotometrie biedt aantrekkelijke voordelen vanwege de voordelen van massafotometrie als analytische techniek. Dat wil zeggen, massafotometrie vereist geen labels, omvat minimale monstervoorbereiding en de metingen worden in oplossing uitgevoerd. Voor dit protocol is een ander belangrijk voordeel van massafotometrie het vermogen om alle gevormde soorten te onderscheiden en te kwantificeren (op voorwaarde dat ze een duidelijke massa van >30 kDa) hebben). Dit in tegenstelling tot bijvoorbeeld SPR, dat de bindings- en ontbindingssnelheden kan meten, maar niet gemakkelijk stoichiometrie-informatie kan verstrekken⁸.

Voor dit protocol, maar ook voor massafotometrie-experimenten in het algemeen, zijn verschillende overwegingen nuttig. Ten eerste moet de uiteindelijke eiwitconcentratie binnen de limiet liggen van wat massafotometrie kan meten (100 pM-100 nM). De startincubatieconcentratie moet ook binnen het bereik van het microfluïdische systeem liggen (tot 90 μM) en moet volgens de theorie boven de werkelijke K_D van de interactie^{liggen 10}. Het aanbevolen uitgangspunt is een concentratiemengverhouding van 1:1 tussen de op elkaar inwerkende soorten bij een μM-concentratie. De verhouding kan dan worden gevarieerd tot 1:2, 1:5 of, zoals in het geval van deze interactie, 1:10. Als er geen eerdere informatie is over de eiwitinteracties, zou de gebruiker het experiment moeten optimaliseren, te beginnen met een hoge concentratie (aanbevolen 20 μM) voor elke partner om te bepalen of de affiniteit van de componenten binnen het concentratiebereik ligt dat wordt ondersteund door de gepresenteerde methode (d.w.z. complexen worden gevormd). Optimalisatie kan ook bestaan uit het kiezen van andere buffercondities om de interacties te bevorderen of titratie van een van de interactiecomponenten om de juiste mengverhouding te bepalen. Zodra deze zijn bepaald, is het mogelijk om concentraties en stromen te optimaliseren om optimale omstandigheden voor de studie en methode mogelijk te maken, bijvoorbeeld door de concentraties te verlagen om een betere piekresolutie mogelijk te maken.

Ten tweede, om dit experiment met succes te repliceren, moeten onzuiverheden tot een minimum worden beperkt. Veel voorkomende bronnen van onzuiverheden waarvan bekend is dat ze massafotometriemetingen nadelig beïnvloeden, zijn onder meer andere eiwitten of cellulair afval dat overblijft na zuivering, ongefilterde buffers, micellenvormende reinigingsmiddelen (indien aanwezig in een te hoge concentratie) en buffers die hoge concentraties zout, glycerol of andere componenten bevatten. Zoals besproken in het protocol hierboven, moeten luchtbellen in het microfluïdica-systeem worden verwijderd. Er kunnen zich luchtbellen vormen in het slangsysteem of als monsters een hoge oppervlaktespanning hebben en vatbaar zijn voor schuimvorming. Er kunnen zich ook luchtbellen vormen in de immersieolie, die kunnen worden gedetecteerd via de scherpstelring (Figuur 3). Als luchtbellen niet kunnen worden verwijderd met behulp van de stappen die in het protocol worden beschreven, is een andere oplossing om het monster te ontgassen met behulp van een exsiccator en een vacuümpomp, waarbij het monster enkele minuten onder verminderde druk wordt gelaten. Vortexen of schudden van sterk geconcentreerde eiwitoplossingen wordt niet aanbevolen, omdat deze acties de vorming van luchtbellen kunnen bevorderen.

Hoewel de meting van één specifieke eiwit-eiwitinteractie hier wordt gedemonstreerd, kan hetzelfde protocol zonder significante wijzigingen worden toegepast op andere eiwit-eiwitinteractiesystemen. Een verdere toekomstige richting van dit protocol zou zijn om de metingen te gebruiken om_KD-waarden voor de geïdentificeerde complexen te berekenen, zoals elders is beschreven in de context van massafotometrie ^5,7. Hoewel in de eerdere studies gegevens werden gebruikt van experimenten met handmatige verdunning en sterkere interacties, zou het analyseprincipe in deze context gemakkelijk kunnen worden toegepast – op voorwaarde dat verdere verbeteringen in het microfluïdische apparaat worden geïmplementeerd (zoals verhoogde nauwkeurigheid van de flowsensor en pompstabiliteit).

Naast eiwit-eiwitinteracties zullen er waarschijnlijk bredere toepassingen zijn voor de gecombineerde massafotometrie en snelle verdunningsmicrofluïdische benadering. Massafotometrie kan worden gebruikt om de zuiverheid, aggregatie en homogeniteit van het monster te beoordelen^18,19; studie eiwitoligomerisatie²⁰, macromoleculaire assemblage²¹ of polymerisatie²²; en op andere gebieden. Massafotometrie-analyse gaat ook verder dan eiwitten; Het is gebruikt om interacties tussen nucleïnezuren en eiwitten²³, virale deeltjes²⁴ en nanodeeltjes²⁵ te onderzoeken. Dit protocol beschrijft dus een belangrijke toepassing van een gecombineerd massafotometrie microfluïdica-systeem – het maakt de directe meting van zwakke eiwit-eiwitinteracties op het niveau van individuele moleculen en complexen mogelijk. De waarde van de huidige toepassing is hoog, omdat het de mogelijkheid opent om interacties die over het algemeen moeilijk te bestuderen waren – met relevantie voor kritieke therapeutische gebieden rechttoe rechtaan te karakteriseren. Deze gecombineerde aanpak zou ook als basis kunnen dienen voor een breder scala aan onderzoeken naar monsters met concentraties tot tientallen micromolairen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

W.S. wordt ondersteund door een UKRI Future Leaders Fellowship [MR/V02213X/1]. De tekst en de grafiek van het manuscript werden opgesteld met de steun van leden van het wetenschappelijke communicatieteam van Refeyn (Panagiota Paganopoulou, Neus Torres Tamarit en Catherine Lichten). We erkennen ook waardevolle feedback van Camille Hetez, Sofia Ferreira en Matthias Langhorst.

Materials

2-Propanol (Isopropanol)	VWR International LLC	20880.320
Data acquisition software	Refeyn	AcquireMP (v2022 R1)
Data analysis software	Refeyn	DiscoverMP (v2022 R1)
FCRN, His-Tag	Sigma	SRP0624
Herceptin (IgG)	Cambridge Bioscience	HY-P9907-1mg
Mass photometer	Refeyn	TwoMP
Microfluidics box	Refeyn	MassFluidix HC system
Microfluidics chip	Refeyn	MassFluidix HC chip
Microfluidics control software	Fluigent	OxyGEN
Phosphate Buffered Saline (PBS), 1x Ultra Pure	VWR International LLC	K812
Sodium Hydroxide (NaOH)	Sigma	S2770
β-Amylase, from sweet potato	Sigma	A8781

References

Arter, W. E., Levin, A., Krainer, G., Knowles, T. P. J. Microfluidic approaches for the analysis of protein-protein interactions in solution. Biophysical Reviews. 12 (2), 575-585 (2020).
Hellenkamp, B., Thurn, J., Stadlmeier, M., Hugel, T. Kinetics of transient protein complexes determined via diffusion-independent microfluidic mixing and fluorescence stoichiometry. The Journal of Physical Chemistry. B. 122 (49), 11554-11560 (2018).
Li, Z. Editorial: Methods in structural biology: Cryo-electron microscopy. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 1041386 (2022).
Herling, T. W., et al. A microfluidic platform for real-time detection and quantification of protein-ligand interactions. Biophysical Journal. 110 (9), 1957-1966 (2016).
Soltermann, F., et al. Quantifying protein-protein interactions by molecular counting with mass photometry. Angewandte Chemie International Edition. 59 (27), 10774-10779 (2020).
Wu, D., Piszczek, G. Rapid determination of antibody-antigen affinity by mass photometry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 168, 61784 (2021).
Wu, D., Piszczek, G. Measuring the affinity of protein-protein interactions on a single-molecule level by mass photometry. Analytical Biochemistry. 592, 113575 (2020).
Young, G., et al. Quantitative mass imaging of single biological macromolecules. Science. 360 (6387), 423-427 (2018).
Zijlstra, N., et al. Rapid microfluidic dilution for single-molecule spectroscopy of low-affinity biomolecular complexes. Angewandte Chemie International Edition. 56 (25), 7126-7129 (2017).
MassFluidix® HC system for rapid dilution via microfluidics. Available from: https://www.refeyn.com/massfluidix-hc-system (2023)
Pollard, T. D. A guide to simple and informative binding assays. Molecular Biology of the Cell. 21 (23), 4061-4067 (2010).
Jarmoskaite, I., AlSadhan, I., Vaidyanathan, P. P., Herschlag, D. How to measure and evaluate binding affinities. eLife. 9, e57264 (2020).
Monnet, C., et al. Selection of IgG variants with increased FcRn binding using random and directed mutagenesis: Impact on effector functions. Frontiers in Immunology. 6, 39 (2015).
. Refeyn TwoMP: Transforming biomolecular characterisation Available from: https://www.refeyn.com/twomp-mass-photometer (2022)
Lai, S. -. H., Tamara, S., Heck, A. J. R. Single-particle mass analysis of intact ribosomes by mass photometry and Orbitrap-based charge detection mass spectrometry. iScience. 24 (11), 103211 (2021).
Wu, D., Piszczek, G. Standard protocol for mass photometry experiments. European Biophysics Journal. 50 (3-4), 403-409 (2021).
Vaughn, D. E., Bjorkman, P. J. Structural basis of pH-dependent antibody binding by the neonatal Fc receptor. Structure. 6 (1), 63-73 (1998).
Niebling, S., et al. Biophysical screening pipeline for Cryo-EM grid preparation of membrane proteins. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 882288 (2022).
Paul, S. S., Lyons, A., Kirchner, R., Woodside, M. T. Quantifying oligomer populations in real time during protein aggregation using single-molecule mass photometry. ACS Nano. 16 (10), 16462-16470 (2022).
Schulz, L., et al. Evolution of increased complexity and specificity at the dawn of form I Rubiscos. Science. 378 (6616), 155-160 (2022).
Malay, A. D., et al. An ultra-stable gold-coordinated protein cage displaying reversible assembly. Nature. 569 (7756), 438-442 (2019).
Hundt, N., Cole, D., Hantke, M. F., Miller, J. J., Struwe, W. B., Kukura, P. Direct observation of the molecular mechanism underlying protein polymerization. Science Advances. 8 (35), eabm7935 (2022).
Acharya, A., et al. Distinct RPA domains promote recruitment and the helicase-nuclease activities of Dna2. Nature Communications. 12, 6521 (2021).
Ebberink, E. H. T. M., Ruisinger, A., Nuebel, M., Thomann, M., Heck, A. J. R. Assessing production variability in empty and filled adeno-associated viruses by single molecule mass analyses. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 27, 491-501 (2022).
Melo, L., et al. Size distributions of gold nanoparticles in solution measured by single-particle mass photometry. The Journal of Physical Chemistry B. 125 (45), 12466-12475 (2021).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Claasen, M., Kofinova, Z., Contino, M., Struwe, W. B. Analysis of Protein Complex Formation at Micromolar Concentrations by Coupling Microfluidics with Mass Photometry. J. Vis. Exp. (203), e65772, doi:10.3791/65772 (2024).