Sinyal yollarının optogenetik manipülasyonu, gelişim, rejenerasyon, homeostaz ve hastalıkta sinyalleşmenin nasıl çözüldüğünü araştırmak için güçlü bir strateji olabilir. Bu protokol, erken zebra balığı embriyosunda ışık-oksijen-voltaj algılama alanı tabanlı Nodal ve kemik morfojenik protein (BMP) sinyal aktivatörlerinin kullanılması için pratik yönergeler sağlar.
Sinyal yolları, gelişim, rejenerasyon, homeostaz ve hastalık dahil olmak üzere temel biyolojik süreçleri düzenler. Sinyalleşmenin bu geniş kapsamlı bağlamlarda nasıl yorumlandığını anlamak için sinyallemeyi deneysel olarak manipüle etme yöntemleri gereklidir. Moleküler optogenetik araçlar, yüksek derecede uzay-zamansal kontrol ile sinyal yolu aktivitesinin tersine çevrilebilir, ayarlanabilir manipülasyonlarını sağlayabilir ve in vitro, ex vivo ve in vivo olarak uygulanmıştır. Bu araçlar, mavi ışık homojenleştirici ışık-oksijen-voltaj algılama (LOV) alanı gibi ışığa duyarlı protein alanlarını, sinyalleme üzerinde ışığa bağlı deneysel kontrol sağlamak için sinyal efektörleri ile birleştirir. Bu protokol, optik olarak erişilebilir erken zebra balığı embriyosunda LOV tabanlı kemik morfogenetik proteini (BMP) ve Nodal sinyal aktivatörleri bOpto-BMP ve bOpto-Nodal’ın kullanımı için pratik kılavuzlar sağlar. İki kontrol deneyini açıklar: Uygun deney koşullarını belirlemek için hızlı bir fenotip testi ve sinyallemeyi doğrudan değerlendirmek için bir immünofloresan testi. Birlikte, bu kontrol deneyleri, erken zebra balığı embriyolarında optogenetik araçları kullanmak için bir boru hattı oluşturmaya yardımcı olabilir. Bu stratejiler, sinyalleşmenin gelişim, sağlık ve fizyolojideki rollerini araştırmak için güçlü bir platform sağlar.
Sinyal yolları, hücrelerin çevrelerine yanıt vermelerine ve doku ve organizma çapında ölçeklerde aktiviteleri koordine etmelerine olanak tanır. Embriyonik gelişim için çok önemli olan sinyaller arasında TGF-beta süper aile üyeleri kemik morfogenetik proteini (BMP) ve Nodal 1,2,3 bulunur. Embriyogenez sırasında, bu sinyaller ve diğerleri tarafından düzenlenen yollar, çeşitli doku ve organların düzgün bir şekilde gelişmesini ve arayüz oluşturmasını sağlamak için gen ekspresyonunu ve ek süreçleri kontrol ederek vücut planını şekillendirir. Doğum kusurları ve kanser de dahil olmak üzere patolojiler, sinyalleşme veya sinyalleşmeye verilen tepkiler bozulduğunda ortaya çıkabilir 4,5,6,7. Sinyalizasyonla ilgili titiz araştırmalara rağmen, seviyelerin ve dinamiklerin çeşitli bağlamlarda nasıl çözüldüğü hakkında keşfedilecek çok daha fazla şey var 8,9,10,11, özellikle geliştirme sırasında 12,13,14,15,16,17,18,19.
Sinyalleşmenin nasıl çözüldüğünü anlamak için ideal bir deney, sinyal seviyelerini, zamanlamayı ve/veya dinamikleri – yüksek derecede uzamsal ve zamansal kontrol ile – manipüle etmek ve sonuçları değerlendirmek olacaktır. Örneğin, gelişmekte olan dokuları modellemek için hassas uzamsal sinyal gradyanları önerilmektedir20,21. Sinyal gradyan uzamsal dağılımlarını değiştirmek, bu hipotezi test etmeye yardımcı olacaktır22. Ek olarak, çeşitli hücresel tepkiler oluşturmada sinyal dinamiklerinin önemi daha net hale geliyor: Aynı sinyal yolu, hücrelere sinyal frekansına bağlı olarak farklılaşma veya çoğalma talimatı verebilir, örneğin 9,23. Sinyal dinamiğinin kolayca manipüle edilebileceği deneysel paradigmalar, dinamikler ve hücre kaderi kararları arasındaki ilişkiyi araştırmak için değerli olacaktır8,12,13,14,15.
Tarihsel olarak, gelişimsel bağlamlarda sinyalleşmeyi manipüle etmek için birden fazla yöntem kullanılmış ve bu da temel keşiflereyol açmıştır 1,2,3. Sinyalleşme, fonksiyon kaybı mutantları, ektopik inhibitör ekspresyonu veya antagonist ilaçlar kullanılarak bloke edilebilir. Sinyallemeyi aktive etme yöntemleri arasında agonist ilaçlar, rekombinant ligandlar, ligandların veya yapısal olarak aktif reseptörlerin ektopik ekspresyonu ve yol inhibitörü fonksiyon kaybı mutantları bulunur. Bu yöntemler, deneysel kontrolün sürekliliği boyunca değişir. Örneğin, mutantlar ve ektopik ekspresyon sürekliliğin balyoz tarafına düşebilir: Bu yaklaşımlarla, yol aktivitesindeki dramatik, sistemik değişiklikler erken ölüme neden olabilir ve daha sonraki aşamalarda araştırmaları engelleyebilir veya zamanla çözülmesi zor olan pleiotropik etkilere neden olabilir. Ek olarak, seviye veya süre gibi bir seferde bir sinyal özelliğini bağımsız olarak manipüle etmek genellikle zordur. Sürekliliğin diğer ucuna doğru, numuneleri ilaçlara veya zamansal ve bazen uzamsal kontrole sahip rekombinant proteinlere maruz bırakan mikroakışkan cihazlar gibi bazı yöntemlerdaha hassas deneysel kontrol sunar 18,24,25 veya benzer faydalar sağlayabilen ısı şoku ile indüklenebilir ve dokuya özgü promotörler dahil olmak üzere genetik yöntemler16,26,27. Ancak, bu yöntemlerin yürütülmesi zor olabilir, geri döndürülemeyebilir, nispeten yavaş kinetiklere veya düşük çözünürlüğe sahip olabilir ve bazı model sistemlerde kullanılamayabilir.
Moleküler optogenetik yaklaşımlar bu araç setine güçlü bir katkı sağlar. Bu yaklaşımlar,sinyal 8,12,13,14,15 dahil olmak üzere biyolojik süreçleri manipüle etmek için farklı ışık dalga boylarına yanıt veren proteinleri kullanır ve hücre kültüründen bütün hayvanlara kadar çeşitli sistemlerde kullanılmak üzere onlarca yıldır geliştirilmiştir12,13,28. Tarihsel yaklaşımlarla karşılaştırıldığında, moleküler optogenetik genellikle biyolojik süreçler üzerinde daha yüksek derecede uzay-zamansal kontrol sunabilir: Optogenetik sistemlerdeki kontrolör ışıktır ve ışık dalga boyu, yoğunluğu, süresi ve maruz kalma sıklığının kontrolü nispeten basittir. Konfokal ve iki fotonlu mikroskoplar gibi gelişmiş sistemlerle, hücre altı aralıkta uzamsal kontrol mümkündür 29,30,31. Sinyalleri optogenetik olarak manipüle etmek için araçlar geliştirilmiş ve Johnson ve ark.22, Čapek ve ark.32, Krishnamurthy ve ark.33 ve Huang ve ark.34’te açıklananlar dahil olmak üzere çeşitli sistemlerde uygulanmıştır. Örneğin, optogenetiğin sağladığı uzamsal kontrolden yararlanan bu strateji, yakın zamanda Drosophila embriyolarında bir sinyal gradyanını değiştirmek için kullanıldı ve sinek embriyogenezinin bu gradyandaki değişikliklere şaşırtıcı derecede sağlam olduğunu gösterdi22. Optogenetik sinyal aktivatörlerinin tersine çevrilebilirliği ve hızlı açma/kapama kinetiği, onları sinyal dinamikleri 8,12,13,14,15,34,35,36’nın kodunun çözülmesini araştırmak için çekici araçlar haline getirmiştir.
Erken zebra balığı embriyosu, optogenetik çalışmalar için çok uygun bir in vivo sistemdir, çünkü dışarıdan döllenmiş, şeffaf, mikroskopi dostu ve genetik olarak izlenebilirdir. Işığa maruz kalmanın annenin dışında gelişen embriyolara verilmesi daha kolaydır, ışık opak olmayan dokularına nüfuz edebilir ve bunlara erişebilir, canlı zebra balığı embriyoları görüntülemeyi iyi tolere eder (şeffaf olmanın yanı sıra) ve mevcut genetik yöntemler, yararlı transgeniklerin geliştirilmesine ek olarak, yıkım ve aşırı ekspresyon deneyleri için basit fırsatlar sağlar37.
Son zamanlarda, mavi ışığa maruz kalan zebra balığı embriyolarında BMP38 ve Nodal39 sinyalini aktive etmek için optogenetik araçlar geliştirilmiştir (Şekil 1). Bu araçları bOpto-BMP ve bOpto-Nodal (mavi ışıkla aktive edilen b ve optogenetik için Opto) olarak adlandırıyoruz. bOpto-BMP/Nodal, benzer yol aktivasyon mekanizmalarına dayanmaktadır. BMP veya Nodal ligandlarının ilgili reseptör serin-treonin kinazlarına bağlanması, sinyal efektörlerinin fosforilasyonuna yol açan reseptör kinaz alanı etkileşimlerini yönlendirir (BMP için Smad1/5/9 ve Nodal için Smad2/3). Fosforile sinyal efektörleri daha sonra çekirdeğe translokasyon yapar ve hedef gen ekspresyonunudüzenler 3 (Şekil 1A, D). Bu reseptör kinaz etkileşimleri, reseptör kinazların ışığa duyarlı dimerize edici proteinlere bağlanmasıyla ışığa duyarlı hale getirilebilir: Işığa maruz kaldığında, bu kimerik proteinler dimerize olmalı ve reseptör kinaz alanlarının etkileşime girmesine ve sinyalleşmeyi aktive etmesine neden olmalıdır (Şekil 1B, C, E, F). Önemli olarak, endojen reseptörlerin aksine, bOpto-BMP / Nodal, liganddan bağımsız aktivite sağlayan hücre dışı ligand bağlama alanları içermez (Şekil 1C, F). Bu optogenetik aktivasyon stratejisi ilk olarak reseptör tirozin kinazlar40,41,42 ile sağlanmış ve daha sonra reseptör serin-treonin kinazlara uygulanmıştır.
bOpto-BMP/Nodal, Vaucheria fridiga AUREO43,44 alglerinden mavi ışığa duyarlı (~450 nm) homodimerize edici ışık-oksijen-voltaj algılama (LOV) alanını kullanır. Bu yapılar, bir LOV alanına kaynaşmış BMP veya Nodal reseptör kinaz alanlarını takip eden bir membran hedefleme miristoilasyon motifinden oluşur (Şekil 1B, E). Mavi ışığa maruz kalma, ilgili Smad fosforilasyonuna ve yol aktivasyonuna yol açan reseptör kinaz alanı etkileşimlerine neden olan LOV homodimerizasyonuna neden olmalıdır (Şekil 1C, F). bOpto-BMP için, Acvr1l (Alk8 olarak da bilinir) ve BMPR1aa’dan (Alk3 olarak da bilinir) tip I reseptör kinaz alanları ve BMPR2a’dan tip II reseptör kinaz alanı ile yapıların bir kombinasyonunun sinyal38’i en iyi şekilde aktive ettiği bulunmuştur (Addgene #207614, #207615 ve #207616). BOpto-Nodal için, Acvr1ba’dan tip I reseptör kinaz alanı ve Acvr2ba’dan tip II reseptör kinaz alanı ile yapıların bir kombinasyonu kullanılır39.
bOpto-BMP/Nodal, tek hücreli aşamada mRNA enjekte edilerek erken zebra balığı embriyolarına dahil edildi ve Nodal yorumunda39 sinyal süresinin rolünü araştırmak, zebra balıklarının Nodal45’e yanıt verme yeteneğini neden kaybettiğini belirlemek ve BMP hedef genlerinin farklı BMP sinyal seviyelerine nasıl tepki verdiğini incelemek içinkullanıldı 38. Bu araçların gelecekteki çeşitli araştırmalarda faydalı olmaya devam etmesi muhtemeldir. Bununla birlikte, optogenetik sinyal aktivatörlerinin gücü aynı zamanda zayıflıklarıdır: ışığa duyarlı numuneler, yanlışlıkla ektopik sinyal aktivitesini önlemek için dikkatli bir şekilde tedavi edilmelidir. Oda ışığına veya güneş ışığına maruz kalmak bOpto-BMP/Nodal’ı etkinleştirebilir.
Bu protokol, erken zebra balığı embriyolarında mRNA kodlu LOV tabanlı BMP ve Nodal aktivatörlerin kullanılması için pratik öneriler sunar. Tek tip ışığa maruz kalmayı ve sıcaklığı kontrol etmek için bir ışık kutusu oluşturmak için bir stratejiyi detaylandırarak başlar (Şekil 2, Ek Dosya 1, Ek Dosya 2, Ek Dosya 3, Ek Dosya 4, Ek Dosya 5, Ek Dosya 6, Ek Dosya 7, Ek Dosya 8). Daha sonra, bir optogenetik sinyal aktivatörünün beklendiği gibi davranıp davranmadığını, yani yalnızca ışığa maruz kaldığında yol aktivitesini aktive edip etmediğini belirleyen iki temel kontrol deneyini açıklar (Şekil 3). İlk kontrol testi, ışığa maruz kalan ve maruz kalmayan embriyolarda döllenmeden bir gün sonra fenotiplerin incelenmesini içerir (Şekil 3A). mRNA enjekte edilen ışığa maruz kalan embriyolar, ancak maruz kalmayan embriyolar fenoskopi BMP veya Nodal aşırı ekspresyonu olmalıdır (Şekil 4A,B; Özellikle BMP fenotipleri bu zaman noktasında açıkça ayırt edilebilir46). Bu tahlil, hızlı bir aktivite okuması sağlar. İkinci kontrol tahlilinde, fenotiplerin spesifik olarak aşırı BMP veya Nodal sinyallemeden kaynaklanıp kaynaklanmadığını belirlemek ve sinyal seviyelerindeki değişikliği doğrudan gözlemlemek için, fosforile sinyal efektörlerini tespit etmek için immünofloresan boyama kullanılır (sırasıyla pSmad1/5/9 veya pSmad2/3) geç blastula / erken gastrulasyon evresi civarında 20 dakikalık bir ışığa maruz kaldıktan sonra, sinyal aktivitesi iyi tanımlandığında12, 16,17,47,48,49,50 (Şekil 3B ve Şekil 4C). (Hem bOpto-BMP38 hem de bOpto-Nodal39 için uzamsal olarak lokalize aktivasyon gösterilmiş olmasına rağmen, bu protokolün yalnızca tek tip ışığa maruz kalma ve sinyal aktivasyon stratejilerini tanımladığını unutmayın.) İdeal yerel deney koşullarını belirlemek için belirli araştırma sorularına bOpto-BMP/Nodal uygulamadan önce bu kontrol deneylerinin yapılması tavsiye edilir.
mRNA enjeksiyonu, zebra balığı embriyolarına bOpto-BMP/Nodal vermek için mevcut stratejidir. Bu yöntemin birkaç dezavantajı vardır. İlk olarak, uygun mRNA miktarı laboratuvarlar arasında değişir. Kullanılan miktar, ışığa maruz kalarak sinyalleşmeyi sağlam bir şekilde etkinleştirmek için yeterli olmalıdır, ancak yanlışlıkla karanlık aktivasyon olmadan. Optimal mRNA seviyelerini bulmak için birkaç miktarı test etmek iyi bir fikirdir ve bir kez kurulduktan sonra, aynı miktarda mRNA’yı tekrarlanabilir bir şekilde eklemek için bir ana karışımın alikotlarını oluşturun. İkincisi, enjekte edilen mRNA’nın eşit olmayan dağılımı, eşit olmayan sinyal aktivasyonuna yol açabilir. Hücrenin merkezine (yumurta sarısına değil) enjekte edilmesinin mRNA dağılımını bile desteklediği düşünülmektedir. Son olarak, enjekte edilen mRNA zamanla bozulduğundan, bu yaklaşım daha yaşlı embriyolarda yapılan deneyler için uygun olmayabilir. Gelecekte, bu problemler, maternal veya ilaca bağlı bir promotör ile her yerde bOpto-BMP / Nodal eksprese eden transgenik zebra balığı hatları ile ele alınabilir. Potansiyel olarak ışığa duyarlı yetişkin zebra balığı ile çalışmak bu bağlamda zor olsa da, optogenetik araçları barındıran zebra balığı 61,62 ve Drosophila 22,34,35,63 transgenikler başarıyla geliştirilmiştir.
İstenmeyen fotoaktivasyondan kaçınmak, optogenetik araçlarla ilgili genel bir zorluktur. Basitlik için, 1.5 hpf’den daha eski enjekte edilen embriyoları ışığa duyarlı olarak tedavi edin. Yanlışlıkla ışığa maruz kalma, genellikle plakaları veya tabakları alüminyum folyo ile sararak önlenebilir. Bununla birlikte, 1.5 hpf’den daha eski canlı embriyoların görsel gözlemini gerektiren deneyler için, kırmızı ışık kaynaklarını kullanmak veya beyaz ışık kaynaklarını LOV-dimerize dalga boylarını bloke eden ucuz jel filtre kağıdı ile kaplamak mümkündür (Malzeme Tablosu).
Burada açıklanan ışık kutusu, ışık ışınımı seviyeleri, dinamikleri ve dalga boyları üzerinde hassas kontrol gerektiren özel uygulamalar için tasarlanmıştır (Şekil 2). Bu ışık kutusunun diğer faydaları arasında tek tip ışığa maruz kalma, ihmal edilebilir yanlışlıkla numune ısıtması, birden fazla 6 oyuklu plaka için geniş alan ve uzun ömürlü, spektral olarak iyi karakterize edilmiş ışık kaynakları yer alır. Bununla birlikte, araştırma uygulamasına bağlı olarak farklı ışığa maruz kalma stratejileri tercih edilebilir. Birçok laboratuvar, inkübatörlerin LED şeritlerle kaplanması, LED panellerin numunelerin üzerine asılması veya LED’lerin kültür kabı kapaklarına dahil edilmesi dahil olmak üzere daha küçük ayak izlerine sahip daha basit ve daha uygun maliyetli tek tip ışığa maruz kalma sistemleri geliştirmiştir 32,38,39,40,64,65,66. Daha da önemlisi, bu protokolde kullanılan ışık kutusu, kullanıcıların bireysel kuyuları bağımsız olarak düzenlemesine (Bugaj ve ark.52’nin aksine) veya ışığa maruz kalma üzerinde uzamsal kontrol sağlamasına izin vermez. Uzamsal olarak lokalize optogenetik aktivasyon, sırasıyla SPIM veya konfokal sistemlerde lazerler kullanılarak bOpto-BMP38 ve bOpto-Nodal39 ile gösterilmiştir ve ayrıca çeşitli model sistemlerde diğer birçok optogenetik strateji ile gerçekleştirilmiştir (Rogers ve Müller12’de tartışılmıştır). Hatta bazı yaklaşımlar hücre altı uzamsal çözünürlüğeulaşmıştır 29,30,31. Mekansal olarak lokalize ışığa maruz kalma sistemlerinin uygulanması bu protokolün kapsamı dışında olsa da, dijital mikro ayna cihazları veya maskeleme yaklaşımları gibi özel ekipmanlarla bOpto-BMP/Nodal ile mekansal aktivasyon deneyleri teorik olarak mümkündür. Okuyucular, bir ışığa maruz kalma stratejisine başlamadan önce optogenetik deneyler için DIY ışık kutuları hakkındaki kapsamlı literatürü keşfetmeye teşvik edilir (bkz. örneğin, Gerhardt ve ark.51, Bugaj ve ark.52, Kumar ve Khammash 53 ve https://www.optobase.org/materials/’da daha fazlası).
Moleküler optogenetik stratejiler, mutantlar, ektopik gen ekspresyonu, rekombinant proteinler ve ilaçlar gibi tarihsel yaklaşımlara kıyasla genellikle biyolojik süreçler üzerinde daha yüksek derecede uzay-zamansal kontrol sunar. Optogenetik yaklaşımların faydalarıyla ilgilenen okuyucular, zebra balığı ve diğer organizmalarda bulunan diğer yayınlanmış araçları keşfedebilir. Bunlar, ek sinyal yollarını 32,65,67,68 manipüle etmek, gen ekspresyonunu 61,64,66,69,70,71 düzenlemek, protein lokalizasyonunudeğiştirmek 31,72 ve apoptozu aktive etmek için araçlar içerir 62. Bu araçlar ve diğerleri, moleküler optogenetik yaklaşımları için küratörlüğünde bir web kaynağı olan OptoBase’de uygun bir şekilde kataloglanmıştır28. Yeni optogenetik araçlar oluşturmak için ilham alanlar için, kaynak aynı zamanda yeşil, kırmızı ve yakın kızılötesi dalga boylarına yanıt veren ışığa duyarlı proteinler de dahil olmak üzere çok çeşitli stratejilerde kullanılan ışığa duyarlı proteinlerin yararlı tanımlarını da içeriyor. Bilim camiasının moleküler optogenetik yaklaşımların tam potansiyelini gerçekleştirmesi için heyecanlıyız.
The authors have nothing to disclose.
Bu protokolün finansmanı NICHD Intramural Programı tarafından KWR’ye (ZIA HD009002-01) sağlanmıştır. Aydınlatıcı geri bildirimleri için Jeff Farrell ve laboratuvarına, mükemmel teknik destek için Will Anderson’a, protokolü stres testi için Leanne Iannucci’ye ve zebra balığını sağlıklı tutmak için sıkı çalışmaları için NIH Shared Zebrafish tesisine teşekkür ederiz.
Building a light box & Light exposure protocol | |||
#8 x 1" Hex Self-drilling Screw | McMaster-Carr | 99663A222 | 1.4.5 |
Digital Optical Power and Energy Meter | ThorLabs | PM100D | 1.7 4 |
Incubator (142 liters) | Boekel Scientific | 139400 | 1.3.1 |
Incubator Panel Mount (1/4" thick cast black acrylic) | Custom part / Piedmont Plastics | Incubator_panel | 1.4.4 |
Large HSS Spiral Groove Step Drill Bit | CO-Z | SDB0001TA | 1.3.2 |
LED lens gasket, Incubator gasket; 1/32" thick black silicone | McMaster-Carr | 5812T12 | 1.4.3 1.4.4 |
LED microplate illuminator | Prizmatix | NA | 1.1 1.4.3 |
M3 10mm Cube Standoff | Newark Eletronics | 005.60.533 | 1.4.1 |
M3 x 10mm 316SS Flat Head Screw | McMaster-Carr | 91801A156 | 1.4.1 |
M6 x 10mm 316SS Flat Head Screw | McMaster-Carr | 91801A305 | 1.4.3 |
Memory card thermometer | Fisherbrand | 15-081-111 | 1.9 3.2.1 |
Microscope Slide Power Meter Sensor Head (150 mW) | ThorLabs | S170C | 1.7 4 |
Red gel filter paper #E106 | Rosco / B&H Foto & Electronics | 110084014805-E106 | 4.2.1 |
Side Brackets (1/4" thick cast black acrylic) | Custom part / Piedmont Plastics | Side_bracket | 1.4.2 |
Vertical Bracket (1/4" thick cast black acrylic) | Custom part / Piedmont Plastics | Vertical_bracket | 1.4.1 |
Weather stripping: Light duty EPDM foam, 1/2" wd 1/4" tk | McMaster-Carr | 8694K12 | 1.8 |
Generating mRNA | |||
EZNA MicroElute Cycle Pure Kit | Omega | D6293-02 | 2.4 |
GeneJET Miniprep Kit (250 rxns) | Thermo Scientific | K0503 | 2.2 |
Microsample incubator (Hybex) | SciGene | 1057-30-0 | 2 |
Microsample incubator 1.5 ml tube block (Hybex) | SciGene | 1057-34-0 | 2 |
Nanodrop One Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-ONE-W | 2.4 |
NotI-HF restriction enzyme | New England Biolabs (NEB) | R3189L | 2.1 |
pCS2-Opto-Alk3 | Addgene | 207614 | 2 |
pCS2-Opto-Alk8 | Addgene | 207615 | 2 |
pCS2-Opto-BMPR2a | Addgene | 207616 | 2 |
RNeasy Mini Kit (250 rxns) | Qiagen | 74106 | 2.3 |
Injecting mRNA | |||
Agarose (UltraPure) | Invitrogen / Thermo Fisher | 16500500 | 3.1.1 |
250 ml glass beakers | Fisherbrand | FB100250 | 3.3.2 |
6-well dishes (case of 50) | Falcon | 08 772 1B | 3.1.6 |
B-8A ball joint | Narishige | B-8A | 3.3 |
Back pressure unit (microinjection rig component) | Applied Scientific Instrumentation (ASI) | BPU | 3.3 |
Foot switch (microinjection rig component) | Applied Scientific Instrumentation (ASI) | FWS | 3.3 |
GJ-1 magnetic stand | Narishige | GJ-1 | 3.3 |
Glass capillaries (4 in, OD 1 mm, filament) | World Precision Instruments | 1B100F-4 | 3.1.11 |
Glass petri dish bottoms (for dechorionating) | Pyrex | 08-748A | 3.3.2 |
Glass pipettes (5 3/4" with wide tip) | Kimble-Chase | 63A53WT | 3.1.9 |
Injection dish molds | Adaptive Science Tools | tu1 | 3.1.3 |
IP iron plate | Narishige | IP | 3.3 |
M-152 micromanipulator | Narishige | M-152 | 3.3 |
Micro pipette holder kit (microinjection rig component) | Applied Scientific Instrumentation (ASI) | MIMPH-MPIP-Kit | 3.3 |
Micrometers | Meiji Techno America | MA285 | 3.3 |
MPPI-2 pressure injector (microinjection rig component) | Applied Scientific Instrumentation (ASI) | MPPI-3 | 3.3 |
Needle puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | 3.1.11 |
Petri dishes (100 mm x 15 mm, case of 500) | Falcon | 08-757-100D | 3.1.2 |
Pipettor (10 ml, green) | Bel-Art | F37898-0000 | 3.3 |
Pronase | Roche | 11459643001 | 3.3.2 |
Squeeze bottles (500 ml) | Nalgene / Thermo Scientific | 2402-0500 | 3.3 |