De ontwikkeling en toepassing van biofysische assays voor het evalueren van ternaire complexvorming geïnduceerd door proteolyse gericht op chimeren (PROTACS)

De polyubiquitinatie van eiwitten in de cel is een strak gereguleerd proces waarbij enzymen uit de Ubiquitine Ligase-familie betrokken^zijn1,2. De terminale enzymen in de route zijn de E3-ubiquitine-ligasen die covalent ubiquitinemoleculen hechten aan hun eiwitbindende partners³. De polyubiquitinatie van die eiwitbindende partners richt zich op proteolytische afbraak door het proteasoom⁴. Dit systeem maakt deel uit van het eiwithomeostaseproces dat therapeutisch is gebruikt om de afbraak van eiwitten die betrokken zijn bij ziekte te induceren⁵. Kleine moleculen die de interactie tussen E3-ubiquitineligasen induceren, zoals Von Hippel-Lindau E3-ligase (VHL) of cereblon (CRBN), zijn meestal samengesteld uit een E3-ligase-bindende kernkop die door een flexibele linker is verbonden met een kernkop die bindt aan het eiwit dat het doelwit is van afbraak. Deze heterobifunctionele moleculen worden gewoonlijk aangeduid als proteolyse gericht op chimeren of PROTACS⁶.

De ontwikkeling van PROTACS omvat het evalueren van het vermogen van moleculen om de afbraak van eiwitten in cellen te induceren. Er zijn veel cellulaire testsystemen ontwikkeld die de geïnduceerde interactie tussen het doeleiwit en E3-ligasecomponenten, zoals VHL of CRBN, bewaken bij behandeling van de cellen met een PROTAC-molecuul. Een van die cellulaire tests, het nanoluc-Halotag-systeem⁷, omvat een E3-ligase dat is gefuseerd met de Halotag-acceptor en een doeleiwit dat is gelabeld met een nanoluc-donor. Ternaire complexvorming brengt de nanoluc-donor en de Halotag-acceptor in de buurt waardoor de overdracht van energie van de donor naar de acceptor mogelijk wordt, wat resulteert in de emissie van licht. Variaties van dit systeem kunnen worden gebruikt om de cellulaire permeabiliteit van PROTACS-moleculen⁸ of veranderingen in het relatieve niveau van ubiquitinatie van doeleiwitten⁹ te beoordelen. Hoewel deze cellulaire systemen essentieel zijn voor het stimuleren van de optimalisatie van PROTACS, is de vorming van complexen tussen E3-ligasen en eiwitten die gericht zijn op afbraak een proces in meerdere stappen^10,11. De kinetiek en thermodynamica van de betrokken binaire en ternaire interacties dragen bij aan efficiëntie, ubiquitinatie en de daaruit voortvloeiende afbraak van het eiwit^12,13,14.

Hierin worden protocollen beschreven die kunnen worden aangepast voor de biofysische karakterisering van ternaire complexvorming geïnduceerd door PROTACS met behulp van oppervlakteplasmonresonantie (SPR), biolaaginterferometrie (BLI) en isotherme titratiecalorimetrie (ITC). SPR- en ITC-protocollen voor het MZ1 PROTAC-molecuul dat ternaire complexvorming tussen Brd4^BD2 en VHL induceert, afgeleid van literatuurrapporten^13,15 en hier beschreven, waren in staat om de gerapporteerde resultaten samen te vatten met enige wijziging van de gerapporteerde procedures^, die zullen worden besproken. Een beschrijving van een BLI-test die wordt gebruikt om de vorming van ternaire complexen tussen MZI, Brd4,^BD2 en VHL te evalueren, is opgenomen in dit rapport. Affiniteitsmetingen van BLI waren consistent met die waargenomen in SPR en ITC. Een eerder gepubliceerd protocol waarin een SPR-test werd ontwikkeld voor het beoordelen van de PROTAC-geïnduceerde ternaire complexvorming tussen PPM1D, een Ser/Thr-eiwitfosfatase waarvan de expressie op een p53-afhankelijke manier wordt geïnduceerd¹⁶, en CRBN wordt ook beschreven. In dit geval heeft het PROTAC-molecuul een nanomolaire affiniteit voor PPM1D, maar alleen een micromolaire affiniteit voor CRBN. In dit geval is de binding van het PROTAC-molecuul aan CRBN niet verzadigbaar, wat resulteert in het algemeen waargenomen “haakeffect”. Het haakeffect is een eigenschap van drie lichaamssystemen waarin er twee soorten zijn die een heterotrimer complex kunnen vormen wanneer beide gebonden zijn aan een overbruggend molecuul (Figuur 1)¹⁷. Het haakeffect wordt waargenomen wanneer de overbruggingssoort in overconcentratie is ten opzichte van de twee andere soorten. De resulterende toestand is er een waarin de binaire interacties de ternaire interacties overtreffen. De systemen waarbij het haakeffect wordt waargenomen, vereisen specifieke experimentele ontwerpoverwegingen die in dit rapport worden besproken. Er worden algemene concepten en reagensvereisten gegeven voor het evalueren van het gebruik van biofysische assays voor de evaluatie van PROTAC-geïnduceerde ternaire complexvorming.