تطوير وتطبيق المقايسات الفيزيائية الحيوية لتقييم تكوين المركب الثلاثي الناجم عن التحلل البروتيني الذي يستهدف الوهم (PROTACS)
Summary
هنا نصف بروتوكولات التوصيف الفيزيائي الحيوي للتكوين المركب الثلاثي الناجم عن التحلل البروتيني الذي يستهدف الوهم (PROTACS) الذي يتضمن أربطة يوبيكويتين فون هيبل-لينداو E3 ligase (VHL) و Cereblon (CRBN). تشمل الطرق الفيزيائية الحيوية الموضحة هنا رنين البلازمون السطحي (SPR) ، وقياس تداخل الطبقة الحيوية (BLI) ، وقياس كالوريمتر المعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة (ITC).
Abstract
يمكن حث الأربطة والبروتينات E3 المستهدفة للتحلل على تكوين معقدات بواسطة جزيئات غير متجانسة وظيفية في عملية متعددة الخطوات. تساهم الحركية والديناميكا الحرارية للتفاعلات المعنية في كفاءة الوجود في كل مكان وما ينتج عنه من تدهور البروتين. توفر التقنيات الفيزيائية الحيوية مثل رنين البلازمون السطحي (SPR) وقياس التداخل الحيوي (BLI) وقياس كالوريمتر المعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة (ITC) معلومات قيمة يمكن استخدامها في تحسين تلك التفاعلات. باستخدام نظامين نموذجيين ، تم إنشاء مجموعة أدوات الفحص البيوفيزيائي لفهم تعاونية تكوين المعقد الثلاثي وتأثير “تأثير الخطاف” على حركية الربط. في إحدى الحالات ، تم تقييم التحلل البروتيني الذي يستهدف جزيء الوهم (PROTAC) الذي تسبب في تكوين معقد ثلاثي بين Brd4BD2 و VHL. يحتوي الجزيء غير المتجانس ، MZ1 ، على صلات نانومتر لكل من بروتين Brd4BD2 (SPR K D = 1 نانومتر ، ITC K D = 4 نانومتر) ومجمع VHL (SPR K D = 29 نانومتر ، ITC K D = 66 نانومتر). بالنسبة لهذا النظام ، تم تطوير فحوصات SPR و BLI و ITC القوية التي أعادت إنتاج النتائج المنشورة التي توضح تعاونية التكوين المعقد الثلاثي. في الحالة الأخرى ، تمت دراسة جزيء تسبب في مجمعات ثلاثية بين بروتين 46.0 كيلو دالتون ، PPM1D ، والمخ [CRBN (319-442)]. يحتوي الجزيء غير المتجانس الوظيفي ، BRD-5110 ، على SPR K D = 1 نانومتر ل PPM1D ولكنه أضعف بكثير ضد مركب CRBN (319-442) المقطوع (SPR KD = ~ 3 μM). في هذه الحالة ، لم يكن ربط CRBN في SPR مشبعا ، مما أدى إلى “تأثير الخطاف”. وجرى تقييم متطلبات الإنتاجية والكواشف لاحتياطي البترول الاستراتيجي ومعهد بلي والمركز الدولي للاتصالات، وقدمت توصيات عامة لتطبيقها على مشاريع البرنامج الاستشاري لتكنولوجيا المعلومات والاتصالات.
Introduction
إن polyubiquitination للبروتينات في الخلية هي عملية منظمة بإحكام تتضمن إنزيمات في عائلة Ubiquitin Ligase 1,2. الإنزيمات الطرفية في المسار هي أربطة يوبيكويتين E3 التي تربط تساهميا جزيئات يوبيكويتين بشركائها المرتبطين بالبروتين3. إن تعدد الوجود في كل مكان لشركاء ربط البروتين هؤلاء يستهدفهم للتحلل البروتيني بواسطة البروتيازوم4. هذا النظام هو جزء من عملية توازن البروتين التي تم الاستفادة منها علاجيا للحث على تدهور البروتينات المشاركة في المرض5. تتكون الجزيئات الصغيرة التي تحفز التفاعل بين أربطة يوبيكويتين E3 ، مثل Von Hippel-Lindau E3 ligase (VHL) أو cereblon (CRBN) ، عادة من رأس حربي ملزم ب E3 ligase متصل بواسطة رابط مرن برأس حربي يرتبط بالبروتين المستهدف للتحلل. يشار إلى هذه الجزيئات غير المتجانسة الوظيفية عادة باسم التحلل البروتيني الذي يستهدف الوهم أو PROTACS6.
يتضمن تطوير PROTACS تقييم قدرة الجزيئات على تحفيز تدهور البروتينات في الخلايا. تم تطوير العديد من أنظمة الفحص الخلوي التي تراقب التفاعل المستحث بين البروتين المستهدف ومكونات E3 ligase ، مثل VHL أو CRBN ، عند معالجة الخلايا بجزيء PROTAC. أحد هذه المقايسات الخلوية ، نظام nanoluc-Halotag7 ، يتضمن إنزيم ربط E3 مدمج في مستقبل Halotag وبروتين مستهدف موسوم بمانح نانولوك. يؤدي التكوين المركب الثلاثي إلى تقريب مانح nanoluc ومستقبل Halotag مما يسمح بنقل الطاقة من المتبرع إلى المستقبل مما يؤدي إلى انبعاث الضوء. يمكن استخدام الاختلافات في هذا النظام لتقييم النفاذية الخلوية لجزيئات PROTACS8 أو التغيرات في المستوى النسبي لانتشار البروتين المستهدففي كل مكان 9. في حين أن هذه الأنظمة الخلوية ضرورية لدفع تحسين PROTACS ، فإن تكوين المجمعات بين أربطة E3 والبروتينات المستهدفة للتحلل هو عملية متعددة الخطوات10,11. تساهم الحركية والديناميكا الحرارية للتفاعلات الثنائية والثلاثية المعنية في انتشار الكفاءة في كل مكان وما ينتج عنه من تدهور البروتين12،13،14.
فيما يلي وصف للبروتوكولات التي يمكن تكييفها للتوصيف الفيزيائي الحيوي للتكوين المركب الثلاثي الناجم عن PROTACS باستخدام رنين البلازمون السطحي (SPR) وقياس تداخل الطبقة الحيوية (BLI) وقياس كالوريمتر المعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة (ITC). تمكنت بروتوكولات SPR و ITC لجزيء MZ1 PROTAC الذي يحفز تكوين معقد ثلاثي بين Brd4BD2 و VHL المستمدة من تقارير الأدبيات13,15 والموضحة هنا من تلخيص النتائج المبلغ عنها مع بعض التعديلات على الإجراءات المبلغ عنها ، والتي سيتم مناقشتها. يتم تضمين وصف لمقايسة BLI المستخدمة لتقييم تكوين المعقد الثلاثي بين MZI و Brd4BD2 و VHL في هذا التقرير. كانت قياسات التقارب من BLI متسقة مع تلك التي لوحظت في SPR و ITC. بروتوكول منشور سابقا تم فيه تطوير اختبار SPR لتقييم تكوين المعقد الثلاثي الناجم عن PROTAC بين PPM1D ، وهو بروتين الفوسفاتيز Ser / Thr الذي يتم تحفيز تعبيره بطريقة تعتمد على p5316 ، و CRBN موصوف أيضا. في هذه الحالة ، يحتوي جزيء PROTAC على تقارب نانوي ل PPM1D ولكن فقط تقارب ميكرومولار ل CRBN. في هذه الحالة ، يكون ارتباط جزيء PROTAC ب CRBN غير مشبع ، مما يؤدي إلى “تأثير الخطاف” الشائع الملاحظ. تأثير الخطاف هو خاصية لثلاثة أنظمة جسم يوجد فيها نوعان يمكن أن يشكلان معقدا غير متجانس عندما يكون كلاهما مرتبطا بجزيء جسر (الشكل 1)17. لوحظ تأثير الخطاف عندما يكون نوع الجسور في تركيز زائد بالنسبة للنوعين الآخرين. الحالة الناتجة هي الحالة التي تتفوق فيها التفاعلات الثنائية على التفاعلات الثلاثية. تتطلب الأنظمة التي لوحظ فيها تأثير الخطاف اعتبارات تصميم تجريبية محددة تمت مناقشتها في هذا التقرير. يتم توفير المفاهيم العامة ومتطلبات الكواشف لتقييم استخدام المقايسات الفيزيائية الحيوية لتقييم تكوين المعقد الثلاثي الناجم عن PROTAC.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن أن يوفر التوصيف الفيزيائي الحيوي للتفاعلات الثنائية والثلاثية بين جزيئات PROTAC وشركائها في ربط البروتين رؤى فريدة وتكميلية مقارنة بالأنظمة الخلوية المستخدمة على نطاق واسع. يمكن أن يساعد فهم التقارب بين كل رأس حربي لجزيء PROTAC وشركائه في ربط البروتين في توجيه جهود الكيمياء الطبية نحو تح…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل بجائزة الابتكار وتطوير التكنولوجيا من مركز تطوير العلاجات في معهد برود لمعهد ماساتشوستس للتكنولوجيا وهارفارد. ويود المؤلفون أن يشكروا أعضاء فريق القيادة العليا ولجنة المراجعة على دعمهم لهذا العمل.
Materials
| 96-plate | Greiner | 655076 | flat-bottom, black plates used In BLI experiments |
| 96-well plate | Nunc | 73520-120 | Plate use for ITC sample preparation |
| 96-well plate | Greiner | 650101 | Plate used to prepare samples for SPR experiments |
| Auto iTC200 micro-calorimeter | Malvern Panalytical | Instrument used to perform ITC experiments. Product discontinued. | |
| Biacore S200 | Cytiva | 29136649 | Instrument used to perform SPR experiments |
| MZ1 | ProbeChem | PC-60099 | PROTAC that binds to VHL and Brd4BD2 |
| NTA sensor chip | Cytiva | BR100532 | SPR chip used to perform SPR experiments involving PPM1D |
| Octet Red-384 | Sartorius | Instrument used to perform BLI experiments. Product discontinued. | |
| Plate cover | Malvern | PQA0001 | Cover for Nunc 96-well plate (73520-120) |
| Plate cover | Cytiva | 28975816 | Plate cover for Greiner plate (650101) |
| Series S SA sensor chip | Cytiva | BR100531 | SPR chip used to perform SPR experiments involving MZ1:VHL:BRD4 |
| Streptavidin (SA) Dip and Read Biosensors | Sartorius | 18-509 | Coated sensors used in BLI experiments |
References
- Balaji, V., Hoppe, T. Regulation of E3 ubiquitin ligases by homotypic and heterotypic assembly. F1000Research. 9, (2020).
- Song, L., Luo, Z. -. Q. Post-translational regulation of ubiquitin signaling. Journal of Cell Biology. 218 (6), 1776-1786 (2019).
- Yang, Q., Zhao, J., Chen, D., Wang, Y. E3 ubiquitin ligases: styles, structures and functions. Molecular Biomedicine. 2 (1), 23 (2021).
- Grice, G. L., Nathan, J. A. The recognition of ubiquitinated proteins by the proteasome. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 73 (18), 3497-3506 (2016).
- Chirnomas, D., Hornberger, K. R., Crews, C. M. Protein degraders enter the clinic – a new approach to cancer therapy. Nature Reviews Clinical Oncology. 20 (4), 265-278 (2023).
- Toure, M., Crews, C. M. Small-molecule PROTACS: New approaches to protein degradation. Angewandte Chemie (International ed. In English). 55 (6), 1966-1973 (2016).
- Ottis, P., Toure, M., Cromm, P. M., Ko, E., Gustafson, J. L., Crews, C. M. Assessing different E3 ligases for small molecule induced protein ubiquitination and degradation. ACS Chemical Biology. 12 (10), 2570-2578 (2017).
- Riching, K. M., et al. Quantitative live-cell kinetic degradation and mechanistic profiling of PROTAC mode of action. ACS Chemical Biology. 13 (9), 2758-2770 (2018).
- Nabet, B., et al. The dTAG system for immediate and target-specific protein degradation. Nature Chemical Biology. 14 (5), 431-441 (2018).
- Paiva, S. -. L., Crews, C. M. Targeted protein degradation: elements of PROTAC design. Current Opinion in Chemical Biology. 50, 111-119 (2019).
- Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annual Review of Biochemistry. 67, 425-479 (1998).
- Chan, K. -. H., Zengerle, M., Testa, A., Ciulli, A. Impact of target warhead and linkage vector on inducing protein degradation: Comparison of bromodomain and extra-terminal (BET) degraders derived from triazolodiazepine (JQ1) and tetrahydroquinoline (I-BET726) BET inhibitor scaffolds. Journal of Medicinal Chemistry. 61 (2), 504-513 (2018).
- Roy, M. J., et al. SPR-measured dissociation kinetics of PROTAC ternary complexes influence target degradation rate. ACS Chemical Biology. 14 (3), 361-368 (2019).
- Pierce, N. W., Kleiger, G., Shan, S., Deshaies, R. J. Detection of sequential polyubiquitylation on a millisecond timescale. Nature. 462 (7273), 615-619 (2009).
- Gadd, M. S., et al. Structural basis of PROTAC cooperative recognition for selective protein degradation. Nature Chemical Biology. 13 (5), 514-521 (2017).
- Nahta, R., Castellino, R. C. Phosphatase magnesium-dependent 1 δ (PPM1D), serine/threonine protein phosphatase and novel pharmacological target in cancer. Biochemical Pharmacology. 184, 114362 (2021).
- Douglass, E. F., Miller, C. J., Sparer, G., Shapiro, H., Spiegel, D. A. A comprehensive mathematical model for three-body binding equilibria. Journal of the American Chemical Society. 135 (16), 6092-6099 (2013).
- Zorba, A., et al. Delineating the role of cooperativity in the design of potent PROTACs for BTK. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (31), E7285-E7292 (2018).
- Fairhead, M., Howarth, M. Site-specific biotinylation of purified proteins using BirA. Methods in Molecular Biology. 1266, 171-184 (2015).
- Nowak, R. P., et al. Plasticity in binding confers selectivity in ligand-induced protein degradation. Nature Chemical Biology. 14 (7), 706-714 (2018).
