JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
암 연구학

Tümör Mikroçevresinin Mekansal İmmün Hücre Manzarasının Multipleks İmmünohistokimyasal Analizi

Published: August 18, 2023
doi:
10.3791/65717
, , , , , , , , , ,
1Department of Medical BioSciences,Radboudumc, 2Division of Immunotherapy, Oncode Institute,Radboudumc, 3Data Science, Institute for Computing and Information Sciences,Radboud University, 4Department of Medical Oncology,Radboudumc, 5Department of Pulmonary Diseases,Radboudumc, 6Department of Pathology,Radboudumc

Summary

Bu protokol, multipleks immünohistokimya kullanılarak tümör mikroçevresinin immün hücre karakterizasyonunun nasıl yapıldığını ayrıntılı olarak açıklar.

Abstract

Tümör mikroçevresinin bağışıklık hücresi manzarası, potansiyel olarak prognostik ve öngörücü biyobelirteçlerin keşfi için bilgi içerir. Multipleks immünohistokimya, mekansal bilgilerini korurken tümör dokularındaki farklı bağışıklık hücresi türlerini görselleştirmek ve tanımlamak için değerli bir araçtır. Burada, doku kesitlerindeki lenfosit, miyeloid ve dendritik hücre popülasyonlarını analiz etmek için ayrıntılı protokoller sunuyoruz. Formalinle sabitlenmiş parafine gömülü bölümlerin kesilmesinden, otomatik bir platformda otomatik multipleks boyama prosedürlerine, slaytların multispektral görüntüleme mikroskobunda taranmasına ve şirket içinde geliştirilen bir makine öğrenimi algoritması olan ImmuNet kullanılarak görüntülerin analizine kadar. Bu protokoller, numunenin farklı bölmelerindeki (tümör ve invaziv sınır) bağışıklık hücrelerini analiz etmek ve en yakın komşu analizini uygulamak için tümör belirteçlerini basitçe değiştirerek çeşitli tümör örneklerine uygulanabilir. Bu analiz tümör örnekleriyle sınırlı değildir, aynı zamanda diğer (olmayan) patojenik dokulara da uygulanabilir. Son birkaç yılda ekipman ve iş akışında yapılan iyileştirmeler, üretim sürelerini önemli ölçüde kısalttı ve bu da bu prosedürün teşhis ortamında gelecekteki uygulamasını kolaylaştırdı.

Introduction

Bağışıklık hücreleri, virüsler ve bakteriler gibi patojenlere karşı korunmada çok önemli bir rol oynar, aynı zamanda kanserli hücrelere karşıda önemlidir 1. Bu nedenle, tümör mikroçevresi (TME) içindeki bağışıklık sistemi, prognostik ve prediktif biyobelirteçleri keşfetmek için çok şey vaat etmektedir2. İmmün hücre infiltratları, çeşitli kanser türlerinde prognoz ile ilişkilendirilmiştir, ancak bu henüz klinik bakımda uygulanmamıştır 3,4. Çoğu tümör tipinde, yüksek sayıda sitotoksik T hücresi ve T yardımcı 1 hücresi ve/veya düşük sayıda düzenleyici T hücresi iyi prognozlarla bağlantılıdır. Kolorektal kanserin TNM evrelemesine “İmmünoskor” adı verilen bir hastalığın dahil edilmesi ve TNM-I evrelemesinin 5,6 haline getirilmesi için çabalar devam etmektedir. İmmünoskor, iki farklı tümör bölgesindeki toplam T hücresi (CD3 ile tespit edilir) ve sitotoksik T hücresi (CD8 ile tespit edilir) sayısından türetilir: tümör çekirdeğine karşı tümörlerin invaziv sınırına (IM). İmmünoskor’un ayrıca melanom, akciğer kanseri ve meme kanserigibi diğer kanser türlerinde de prognostik değere sahip olduğu öne sürülmüştür 6,7,8,9. Ayrıca, immün hücre infiltratları, kontrol noktası blokajı immünoterapisine10 verilen yanıtla da ilişkili olabilir. Bununla birlikte, bu prediktif biyobelirteçler, klinik uygulamada rutin olarak uygulanmadan önce prospektif çalışmalarda doğrulanmalıdır. Ayrıca, anlamlı bir tahmin için tek bir biyobelirteçin yetersiz kalacağı da öne sürülmüştür11. Bu nedenle, farklı biyobelirteçleri birleştirerek bir hasta örneğinin tam bir haritasını oluşturmak, “kanser immünogramı” olarak adlandırılan bir durumda daha kapsamlı bir öngörücü biyobelirteç olarak önerilmiştir12.

TME içindeki bağışıklık hücrelerini incelemek için kullanılan yöntemler arasında, en eski ve en iyi bilinen teknik, başta kanser olmak üzere çeşitli hastalıklarda tanı testleri için rutin olarak kullanılan immünohistokimyadır (IHC)13. Bu teknik, uzun bir süre boyunca bir veya sadece birkaç belirteçin14 kullanımı ile sınırlıydı ve bu nedenle, araştırma ortamlarında akış sitometrisi ve gen ekspresyon profili oluşturma (GEP) gibi diğer tekniklerle rekabet etmedi. Bununla birlikte, rutin teşhis ve araştırmalarda tipik olarak kullanılan formalinle sabitlenmiş ve parafine gömülü (FFPE) tümör dokuları, akış sitometrisi ve GEP için (optimal olarak) uygun değildir. Ayrıca, GEP ve akış sitometrisi, hücre fenotipi ve işlevi hakkında çok fazla bilgi sağlasa da, mekansal bilgi eksikliği önemli bir dezavantajdır. Bu nedenle, bir tümörün bağışıklık hücresi ile infiltre edilen ve bağışıklık hücresi tarafından dışlanan bölgelerindeki farklılıklar gibi bir numune içindeki heterojenlik tespit edilemeyebilir15. FFPE dokularının multipleks analizi için, multipleks IHC, görüntüleme kütle sitometrisi ve bir doku kesiti16 içinde aynı anda birden fazla belirteci tespit etmek için kullanılabilen indEXing ile CO-Algılama (CODEX) gibi yeni platformlar geliştirilmiştir. TME’deki bağışıklık hücreleri, immünoterapi için en iyi biyobelirteçleri bulmak için geniş çapta incelenmektedir. Bununla birlikte, multipleks teknikler ve otomatik görüntü analizi kendi başlarına engeller ortaya çıkarmaktadır.

Laboratuvarımız, Opal/Tiramid sinyal amplifikasyonu (TSA) yöntemini kullanarak multipleks IHC boyama konusunda geniş deneyime sahiptir ve bunu bir IHC platformunda otomatikleştirmiştir (Malzeme Tablosuna bakınız)17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28, 29,30,31. Lenfositlerin, miyeloid hücrelerin ve dendritik hücrelerin (DC’ler) farklı alt kümelerinin tespiti için bağışıklık hücresi panellerini optimize ettik. Lenfositler veya karmaşık hücre morfolojileri (yani miyeloid hücreler ve DC’ler) için yoğun bağışıklık hücresi alanları içeren dokuların analiz edilmesi özellikle zordur ve mevcut bağışıklık hücrelerinin sayısını fazla veya küçümseme riski vardır. Bu sorunun üstesinden gelmek için, ImmuNet analiz yazılımı32 numaralı grubumuz tarafından geliştirildi ve bu makine öğrenimi hattı, bu farklı türdeki bağışıklık hücrelerinin tespit kalitesini büyük ölçüde artırdı. FFPE materyalinin elde edilmesinden, farklı doku bölmelerindeki bağışıklık hücresi yoğunluklarının ve bağışıklık hücresi tipleri arasındaki mesafelerin analizine kadar ayrıntılı bir protokol burada açıklanmaktadır.

Bu protokol, 2022’de dijital patoloji görüntüleyicinin uygulanmasından bu yana Radboud Üniversitesi Tıp Merkezi’nde multipleks IHC panellerinin nasıl gerçekleştirildiğini özetlemektedir. Tarif edilen multipleks IHC panelleri, tümör belirteci olarak bir pan-sitokeratin antikoru kullanılarak farklı karsinomlar (örneğin, akciğer, prostat, kolorektal, mesane, meme) veya tümör belirteçleri olarak melanosit ile ilişkili antikorların kullanılmasıyla melanom için kullanılabilir. Bu multipleks IHC protokolleri, primer antikor konsantrasyonu, florofor kombinasyonları ve boyama prosedürünün sırası açısından dikkatlice optimize edilmiştir. Biz ve diğerleri, multipleks IHC panel optimizasyonunu daha önce 17,33,34,35 olarak tanımladık. Multipleks IHC panelleri uyarlanabilir, ancak açıklanan analiz boru hatlarının değerlendirilmesi ve potansiyel olarak buna göre ayarlanması veya yeniden eğitilmesi gerekir. Açıklanan yedi renkli multipleks IHC protokolleri, Opal floroforlar Opal480, Opal520, Opal570, Opal620, Opal690, Opal780 ve 4 ‘,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) kullanır, böylece görüntüleyicide kolay karıştırma ve hızlı tarama “Multispektral Tek Dokunuşla İmmünofloresan” (MOTiF) ile sağlanır. Dokuz renkli boyama ve tarama bu protokolde açıklanmamıştır, çünkü bu, deney düzeneğinin daha da ince ayarını ve sıvı kristal ayarlanabilir filtreyi kullanan görüntüleyicide başka bir tarama modunu gerektirir.

Protocol

Bu protokol için gösterilen hasta materyali daha önce yürütülen bir çalışmanın parçasıydı ve Hollanda mevzuatı ile eş zamanlı olarak yerel Radboudumc Tıbbi Etik Komitesi tarafından resmi olarak tıbbi etik onayından muaf kabul edildi (dosya numarası 2017-3164)30. 1. FFPE malzemesinin toplanması, blokların seçimi ve numunelerin hazırlanması Tedavi eden doktorlar veya patologlar aracılığıyla hasta dosyalarından FFPE blok tanımlayıcılarını alın. Etik iznin gerekli olup olmadığını yerel yönetmeliklerle kontrol edin. Yerel patoloji arşivinden veya harici hastane(ler)den FFPE blokları isteyin.NOT: Belirli bir çalışma için tümör materyali veya biyopsi alınması da mümkündür. Bu, küçük klinik deneyler veya hayvan çalışmaları için geçerli olabilir. Bu durumlarda, doku örneğinin işlenmesi araştırmacının sorumluluğunda olabilir. Birden fazla FFPE bloğu mevcut olduğunda, hematoksilen ve eozin (HE) ile boyanmış slaytları değerlendirerek, tercihen çevredeki stromal doku ile birlikte, canlı tümör dokusu içeren en temsili FFPE bloğunu seçin (Şekil 1).NOT: Bu seçim için bir uzman görüşü alınması tavsiye edilir (örneğin bir patolog). Bir FFPE bloğunun içeriğinin değerlendirilmesi için HE’lerin kullanılamaması ve seçim için yenilerinin yapılması gerekebilir. Açıklama için bölüm 2’ye gidin. Bir mikrotom üzerinde 4 μm kalınlığında FFPE şeritleri kesin.NOT: Kalınlık, gözle görülür lekelenme etkisi olmaksızın 1 μm ile 6 μm arasında olabilir; Bununla birlikte, 4 μm en standarttır. Numuneleri, aşağıda açıklanan yöntemlerden birini kullanarak, otomatik boyalayıcının akışkanları için uygun bir konumda (Şekil 2A-C) cam slaytlar üzerine monte edin:Bölümleri damıtılmış 40 °C suyun yüzeyine germek için bir su banyosuna yerleştirin ve bir cam slaytla alın.VEYACam kızakları 40 °C’lik bir ısıtma plakasına yerleştirin ve bölümün kaydırağa monte edileceği yeri bir damla damıtılmış su ile kapattığınızdan emin olun. Bölümü forseps ile bu damlanın üzerine yerleştirin ve uzamasına izin verin. Damıtılmış suyu bir kağıt havlu kullanarak emdirin ve slayta dokunarak fazla suyu alın.NOT: Doku kesitlerini lamın etiketine çok yakın yerleştirmek, optimal olmayan lekelenmeye neden olacaktır (Şekil 2D,E). Farklı multipleks IHC panellerini gerçekleştirmek ve bir yedeğe sahip olmak için numune başına 6-10 cam slayt monte etme eğilimindeyiz. Monte edilen cam kızakları 56 °C’de 1 saat veya gece boyunca 37 °C’de kurumaya bırakın. Deney için monte edilmiş cam slaytları kullanın veya bunları 4 °C’deki kutularda saklayın.NOT: Şimdiye kadarki deneyimlerimize göre, bu monte edilmiş slaytlar, multipleks IHC boyama yapılmadan önce yıllarca saklanabilir. 2. Hematoksilen ve eozin lekeli slaytların oluşturulması NOT: Bölüm 2’deki aşağıdaki tüm adımlar bir çeker ocakta gerçekleştirilmelidir. Ksilen içinde slaytları deparafinize edin (2 x 5 dk). Etanolde rehidrat (% 99.6 1 x 5 dakika;% 95 1 x 5 dakika;% 70 1 x 2 dakika). Alternatif olarak, slaytları 3x ,6 etanole batırın. Slaytları damıtılmış suda yıkayın (2 dakika). Çekirdekleri hematoksilen ile boyayın (10 dakika). Slaytları damıtılmış H2O (5 dakika) ile yıkayın. Slaytları eozin ile boyayın (5 dakika). % 99.6 etanole 3 kez batırarak slaytları kurutun. Slaytları 2 kez ksilene batırın. Birkaç damla montaj ortamı ekleyin ve bir lamel ile kapatın. Slaytların sertleşmesine izin verin ve tüm kimyasallar buharlaştığında slaytları çeker ocaktan çıkarın. 3. Otomatik boyayıcıda monoplex ve multipleks IHC gerçekleştirme Boyanacak numune sayısına bağlı olarak ne kadar reaktife ihtiyaç duyulduğunu hesaplayın.NOT: Çalışma başına, otomatik boyayıcı 30 slayt kapasitesine sahiptir ve altı antikorla multipleks IHC protokolünü tamamlamak için ~ 18 saat sürer. Daha fazla slaytın boyanması gerektiğinde, (iş) haftasının her gecesine birden fazla parti konulabilir; 30 kaydıraktan oluşan 4 gece = haftada 120 kaydırak.Gerekli tüm reaktifleri haftanın başında hazırlayın. Otomatik boyama sistemi, slayt başına 150 μL reaktif dağıtır. Antikor ve Opal reaktifleri için 6 mL’lik titrasyon kaplarını ve bloke edici reaktif ve ikincil antikor-yaban turpu peroksidaz için 30 mL’lik kapları kullanın.NOT: 6 mL’lik kaplar, gerektiğinde kolayca çıkarılabilen ve değiştirilebilen kullanışlı eklere sahiptir. Reaktif hesaplamalarında, 30 mL’lik kap veya 6 mL’lik titrasyon kabı için sırasıyla 1,6 mL veya 300 μL’lik ölü hacim dikkate alınmalıdır. Sağlanan seyrelticide tüm Opal floroforları ve digoksijenenini (DIG) 1:100 oranında seyreltin; Opal780’i antikor seyrelticide 1:25 oranında seyreltin. Antikor seyrelticisindeki tüm primer antikorları, Ek Dosya 1’de belirtilen seyreltmelerle seyreltin. Bu protokolü takip etmek için, tüm reaktiflerin iyi hazırlandığından emin olmak için gerçek multipleks IHC deneyine başlamadan önce hem bademcik kontrol dokusunu hem de diğer (tümör) doku tiplerini içeren slaytlar üzerinde monoplex IHC’yi (Ek Dosya 2) çalıştırın.NOT: Monoplex IHC ~3.5 saat sürer ve sinyal kalıpları ve yoğunluğu için o günün bitiminden önce kontrol edilebilir. Bazı sinyaller çok zayıfsa (Şekil 3), reaktiflerde ayarlamalar yapılabilir. Otofloresan düzeltmesi için, kan ve kollajen gibi otofloresan yapılar içeren (tümör) dokusu içeren bir slayt hazırlayın. Bu slaytı monopleks IHC slaytları ile aynı anda, ancak antikor ve Opal reaktiflerinin yerini alan bloke edici reaktif ile hazırlayın (Ek Dosya 3).NOT: Prensip olarak, böyle bir slayt, otofloresan düzeltmesi artık optimal olmayana kadar multispektral görüntüleme için yeniden kullanılabilir. Bununla birlikte, beyin ve karaciğer gibi yüksek derecede otofloresan dokularda, bu dokunun otofloresan düzeltmesi için kullanılması tavsiye edilir. Her multipleks IHC çalışmasında, her multipleks IHC çalışmasının performansını kontrol etmek için bir kontrol dokusu sürgüsü ile otomatik boyama sistemine 29 numune yükleyin. İndirilenler sekmesi altındaki otomatik boyayıcının web sitesinden multipleks IHC protokollerini indirin ve bunları her özelleştirilmiş multipleks IHC paneline36 uyacak şekilde ayarlayın. Multipleks IHC için, protokol için Ek Dosya 4’e ve özelleştirilmiş multipleks IHC panelleri için Ek Dosya 1’e bakın. Boyama protokolünün tamamlanmasından sonra, slaytları otomatik boyayıcıdan çıkarın ve yıkama tamponu olan bir kaba koyun. Numuneler zaten çok düşük konsantrasyonlarda lekelendiğinden, otomatik boyama sisteminin DAPI ile kirlenmesini önlemek için, slaytları lamel ile kaplamadan önce DAPI’yi manuel olarak uygulayın. Her mL yıkama tamponu başına iki damla DAPI ekleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.NOT: Spektral kitaplıklar oluşturmak için, numunelerde herhangi bir DAPI lekesi olmaması önemlidir. mL yıkama tamponu başına bir damla DAPI ve RT’de 10 dakikalık inkübasyon da mümkündür. Slaytları 3 kez yıkama tamponu ile yıkayın. Slaytları kağıt havluların üzerine yerleştirin ve fazla yıkama tamponunu slaytların üzerine hafifçe vurun. Doku üzerine birkaç damla montaj ortamı pipetleyin. Hava kabarcıklarını önlemek için sürgünü belirli bir açıyla kaplamak için montaj ortamının üzerine nazikçe bir cam lamel yerleştirin. Forseps veya temiz bir pipet ucu ile cam lamel üzerine hafifçe iterek fazla montaj ortamını ve hava kabarcıklarını çıkarın. Montaj ortamı katılaşmadan önce slaytları ~24 saat boyunca rahatsız edilmeden bırakın, ya bir mikroskopi slayt tahtası üzerinde yatay olarak ya da görüntüleme için doğrudan mikroskoba yükleyin. Montaj ortamı katılaştıktan veya slaytlar görüntülendikten sonra, slaytları 4 °C’de mikroskopi kutularında saklayın. 4. Dijital patoloji görüntüleyici kullanılarak görüntüleme ve tarama dosyalarının açıklanması Makinenin sağındaki güç düğmesine basarak görüntüleyiciyi açın. En az 20 saniye sonra yazılımı başlatın.NOT: Donanımın doğru şekilde başlamasına izin vermek için 20 saniye bekleyin. Slaytları her dört slaytta bir kasetlere yükleyin.İsteğe bağlı: Slaytları, bir şablonun indirilebileceği bir .csv dosyasına girin (Ek Dosya 5). .csv dosyasını programa yüklemek için C:\Users\Public\Akoya\VectraPolaris\States konumuna kaydedin.NOT: Aynı anda en fazla 20 kaset veya 80 slayt yüklenebilir. Başvuru ayarlarıAna menüden Kontrol Panelini Kontrol Et’i açın.NOT: Referans slaytları olan bir kaset üretici tarafından sağlanır ve isteğe bağlı olarak yuva 20’de kalıcı olarak tutulabilir. Sağlanan slayttaki parlak alan referanslarını üreticinin talimatlarına göre haftada bir kez ayarlayın (birkaç dakika sürer). Sağlanan slayttaki floresan referanslarını üreticinin talimatlarına göre ayda bir kez ayarlayın (1 saatten fazla sürer). Protokolün yapılması veya ayarlanmasıAna menüye geri dönün ve bir protokol oluşturmak için Protokolü Düzenle’ye tıklayın. Yeni…’yi tıklatın ve Boyama seçeneğinin altında Görüntüleme Modu, Multispektral Slayt Taraması, ve Opal Polaris 5, 6 ve 7 rengi olarak Floresans’ı seçin. Protokole Protokol Adı altında bir ad verin ve Mevcut Çalışmalar’dan bir çalışma seçerek bir etüt altına kaydedin veya Yeni Çalışma Oluştur | Çalışma Adı. Protokol Oluştur’u seçerek bitirin. Bu tür bir tarama için, yalnızca sol pencereyi kullanın Multispektral Slayt Tarama Ayarları; sağdaki pencereyi yok sayın Multispektral Alan Ayarları. Slaytları farklı büyütme oranlarında tarayın. Bu protokolü takip etmek için Piksel Çözünürlüğünü 0,50 μm’de (20x) bırakarak 20x büyütmede tarayın. Scan Exposures (Tarama Pozlamaları) öğesini seçerek pozlama sürelerini ayarlayın. Load Carrier (Yük Taşıyıcı) seçeneği altında doğru yuvayı seçerek slaytların tutulduğu kaseti yükleyin. Slaytlar arasında gezinmeye yardımcı olmak için, taşıyıcı yüklendikten sonra slaytları içeren taşıyıcının genel bakış görüntüsünü almak için Genel Bakış Al’ı seçin. Bunu otomatik olarak açmak veya kapatmak için sağ üstteki dişli çark simgesini tıklayın, Tercihler…’e gidin ve etkileşimli görevler için yüklenirken otomatik olarak görüntü taşıyıcısını etkinleştirmek için Gezinmeye Genel Bakış Görüntüsü altındaki seçeneği açık veya kapalı seçeneğini işaretleyin. Tarama Pozlamalarını Ayarla’yı seçerek ve pozitif bir sinyalle farklı noktalar bularak ilgili monopleks IHC lekeli slaytlarda filtre başına pozlama sürelerini ayarlayın. Manuel olarak netleme yapın veya Otomatik Netleme’yi kullanın ve bu sinyal için uyumlu filtreye geçtikten sonra Otomatik Pozlama’yı seçin. Aşırı pozlamayı önlemek için en düşük pozlama süresini seçin ve tüm pozlama süreleri ayarlandıktan sonra referans olması için her slaydın anlık görüntüsünü alın (Şekil 3).NOT: Bu tarama türü için Alan Pozlamalarını Ayarla seçeneğini göz ardı edin. Pozitif sinyalli birkaç konumdaki tüm filtreleri kontrol ederek multipleks lekeli bir slaytta pozlama sürelerini ayarlayın. Aşırı pozlamayı önlemek için en düşük otomatik pozlama süresini azaltın ve tüm pozlama süreleri ayarlandıktan sonra birkaç fotoğraf çekin. Gezinmek için Sample AF filtresini kullanarak otomatik floresan telafisi için lekelenmemiş slaytın anlık görüntülerini alın (Şekil 3H).NOT: Eritrosit ve kollajen yapılarının olduğu yerler ilgi çekicidir. Güçlü otofloresan bölgeler için Opal480 filtresinin maruz kalma süresinin azaltılması gerekebilir. Opal480 sinyali yeterince güçlüyse, tescilli Sample AF filtresinin uygulanması nedeniyle yine de otofloresan yapılardan iyi bir şekilde ayrılmalıdır (bkz. bölüm 6). Yazılımı kullanarak boyama ve görüntüleme kalitesini değerlendirin (bkz. bölüm 5 ve 6; Şekil 4, Ek Dosya 6: Ek Şekil S1 ve Ek Şekil S2). Protokolün ve ayarlanan maruz kalma sürelerinin protokole kaydedildiğinden emin olmak için Kaydet… düğmesini seçin.NOT: Protokol zaten kaydedilmişse, yazılım tarafından şu ana kadar kaydedilmemiş ayarlamalar için ek bir bildirim verilmez. Slaytların otomatik taranmasıAna menüye geri dönün ve slaytları taramak için Slaytları Tara’ya tıklayın. Görevleri Yapılandır altında slayt adlarını/kimliklerini ve ilgili görevleri ve protokolü manuel olarak veya Load Setup ile daha önce yapılmış .csv dosyasından otomatik olarak girin. Taramayı başlatmak için Tara’ya tıklayın. Tarama kurulumunu kaydetmek için bir pencerenin açılmasını bekleyin. Varsayılan ayarları kullanmak ve taramayı başlatmak için Kaydet’i tıklatın.NOT: Bu yöntemi kullanarak tarama, slayt başına ~10-20 dakika sürer. Slayt sayısına bağlı olarak, tarama bir tam güne kadar sürebilir. Herhangi bir hata mesajı olup olmadığına bakarak slaytların taranmasının tüm slaytlar için başarılı olup olmadığını kontrol edin. Taramanın başarılı olup olmadığını anlamak için, taramanın kaydedilmiş bir Akoya tüm slayt tarama dosyasını (.qptiff) ve taramadaki tüm dokuyu arayın. 5. Slayt görüntüleyiciyi kullanarak verilere açıklama ekleme Ana menüye geri dönün ve slayt görüntüleyiciyi açmak için Phenochart’ı Başlat’a tıklayın. Tarama dosyaları doğrudan görünmüyorsa, önce sağ üst köşedeki dişli simgesine tıklayarak konumlarını atayın, Tarayıcı Konumunu Değiştir’e gidin ve ilgilenilen veri kümesinin .qptiff dosyalarından birini rastgele seçin.NOT: Veriler varsayılan olarak D:\Data\VectraPolaris konumunda saklanır. Bir slaydı seçip sağ üst köşedeki Yükle’ye tıklayarak veya üzerine çift tıklayarak yükleyin. Sağ üst köşedeki Giriş düğmesine tıklayarak giriş yapın.NOT: Kullanıcı adı yalnızca baş harfleri veya ad olabilir ve kimin hangi ek açıklamaları yaptığını takip etmek için kullanılır. Karıştırma işlemini gerçekleştirmek için üst kısımdaki Karıştırmayı Kaldır düğmesine tıklayın ve Opal + AF seçeneğini seçin.NOT: Bu, Opal 480 kanalının yakınındaki otomatik floresan sinyalin bir kısmından kurtulmak için kullanışlıdır, ancak hepsinden değil. Verileri toplu olarak işlemek üzere bir algoritma oluşturmak için, inForm Projeleri için 1 x 1 görüntü (görüntü boyutu: 928 μm x 696 μm) seçeneğini kullanarak Damga’yı kullanarak temsili görüntüleri seçin.NOT: Veri kümesi boyunca tümör, stroma, arka plan ve farklı tipte bağışıklık hücreleri içeren birkaç temsili pul, ~ 20-30 görüntü elde edecek şekilde seçilir. Dokuda neyin analiz edilmesi gerektiğine bağlı olarak, ROI seçeneğini kullanarak bir ilgi alanı seçin ve inForm Batch’i seçin. Tümörden çok uzakta veya arka planda olan görüntüler gibi analiz edilmesi gerekmeyen görüntüleri manuel olarak silin.NOT: ~ 0,5 mm’lik bir IM’yi analiz edebilmek için tüm tümörün etrafına bir ROI çizme ve tümör bölgesinden uzakta fazladan bir görüntü seçme eğilimindeyiz.Çizilen yatırım getirisi nispeten küçükse, yatırım getirisi 2-9 birleştirilmiş 20x görüntüden oluşacaktır. Bu bizim tarafımızdan tercih edilmediğinden, bunu atlatmak için ilgilenilen dokuyu (inForm Batch için seçilen) manuel olarak damgalayın. Açıklama eklemeyi bitirdiğinizde, ek açıklamaların otomatik olarak kaydedilmesine ve sonraki slaytın yüklenmesine izin verin. Ek açıklama işlemi sırasında slaytların doğru şekilde taranıp taranmadığını kontrol edin.Bir .qptiff dosyası eksikse veya bir slayt başarıyla taranmadıysa, slaytta herhangi bir doku olup olmadığını kontrol edin, slaytı etanol ile temizleyin ve yeniden tarayın. Doku tam olarak taranmamışsa, bu nedenle potansiyel olarak önemli (tümör) bir bölge eksikse veya önemli bölgenin taranması odak dışındaysa, slaytı etanol ile temizleyin ve tekrar tarayın.NOT: Her iki durumda da, sistemin dokuyu bulmasına ve tekrar taramayı denemesine yardımcı olmak için dokuyu lamel üstünde bir işaretleyici ile çevrelemek de yardımcı olabilir (Ek Dosya 6: Ek Şekil S3). Elimizde, ince kırmızı bir kalem, kalın siyah bir kalemden daha iyi çalıştı. Tüm örneklerin taranması ve açıklama eklenmesi tamamlandıktan sonra, verileri farklı bir bilgisayarda veya harici diskte depolayarak yedekleyin. 6. Spektral karıştırma inForm otomatik görüntü analizi yazılımını açın. Görüntüleri yazılıma şu şekilde yükleyin: Dosya | Resmi Aç; .qptiff dosyaları’nı seçin. Adım 5.6’da inForm Projeleri olarak işaretlenen damgaların projeye yüklenmesine izin verin. Otomatik floresan telafisi için görüntülenen .qptiff dosyalarını yükleyin. Otofloresanı telafi etmek için, lekelenmemiş slayttan görüntüye eritrositler ve kollajen gibi otofloresan olan farklı yapı türleri boyunca bir çizgi çizmek için görüntü üzerindeki otomatik floresan seçme aracını kullanın. İşaretleyicileri ve Renkleri Düzenle… bölümünde, Opal florofora karşılık gelen işaretleyici adları atayın ve rengi tercih edilen renge ayarlayın. Floroforları karıştırmak için sol alt köşedeki Tümünü Hazırla’yı seçin. Görüntüleri gözden geçirin ve görüntülerde tüm sinyallerin görünüp görünmediğini ve karışım gidermenin iyi gidip gitmediğini kontrol edin. Kaliteyi kontrol etmek için tüm işaretçileri tek tek kapatıp açmak için göz küresi simgesini seçin. İsteğe bağlı olarak, doku segmentasyonu, hücre segmentasyonu ve fenotipleme algoritmalarını eğitin. Dışa Aktar sekmesine gidin ve Dışa Aktarma Dizini altındaki Gözat… düğmesine tıklayarak yeni bir boş dışa aktarma dizini oluşturun. Dışa aktarılacak görüntüler: altında, Bileşik Görüntü ve Bileşen Görüntüleri (çoklu görüntü TIFF)’i seçin. Dosya Seç | Kaydet | Algoritmayı belirli bir konuma kaydetme projesi. Slaytların toplu işlenmesi için dikey olarak soldaki Toplu Analiz sekmesine gidin. Dışa Aktarma Seçenekleri altında Her öğe için ayrı dizinler oluştur’u seçin. Analiz için slayt eklemek için, Slayt Ekle… düğmesinin altında .qptiff dosyalarını seçin ve bunları toplu analize yükleyin. Slaytların toplu işlenmesini başlatmak için Çalıştır’ı seçin. 7. Yatırım getirisi çizimi Yalnızca 6. bölümdeki bileşen dosyalarını içeren bir klasör oluşturun, ancak hiyerarşik klasör yapısını olduğu gibi tutun (bileşen dosyaları örnek/slayt ile adlandırılan klasörlerde bulunur). QuPath tüm slayt görüntüleyici yazılımını açın. Soldaki Proje oluştur’a tıklayın ve uygun bir ada sahip yeni bir boş klasör seçin/oluşturun. Otomatikleştir’e tıklayın ve Komut dosyası düzenleyicisini göster’i seçin. Ek Dosya 7’de bulunan komut dosyasını kopyalayıp yapıştırın. 34. satırda, tüm bileşen dosyalarını içeren slayt klasörlerinin bulunduğu konumu değiştirin (adım 7.1’de oluşturulan klasör. Çalıştır’ı seçin ve devam etmek için slaytların toplu dikişi bittiğinde (ertesi gün veya daha sonra) geri dönün. Oluşturulan .ome.tif dosyalarını QuPath projesine sürükleyin ve bunları bir proje olarak kaydedin. Otomatik olarak yeni bir pencere açıldığında, Görüntü türünü ayarla | Floresan ve İçe Aktar’ı tıklayın. Soldaki menüde numune listesine bakın; örneği açmak için birine çift tıklayın (Şekil 5A). Kanalların yoğunluğunu ayarlayarak daha iyi görünür hale getirmek için, kontrast simgesini tıklatın. Tüm kanalları seçin ve Sıfırla’yı tıklayın. Otomatik floresanı kapatın. Tümör için bir ROI çizmeye başlamak için kontrast simgesine tıklayın ve Gri tonlamalı göster’i seçin. Tümör işaretleyici kanalını seçin ve yoğunluğu en iyi şekilde görünür hale getirmek için ayarlayın (Şekil 5B). Kabaca bir tümör ROI’si çizmek için fırça aracını tıklayın. Değnek aracını seçerken, yatırım getirisini dışarıdan yumuşatmak için alt tuşuna basarken yatırım getirisinin dışına tıklayın (Şekil 5C). Ayrılmış tümör parçalarını aynı ROI ile birleştirin. Soldaki listede ek açıklamaya sağ tıklayarak ROI’ye tümör gibi uygun bir ad verin; Özellikleri ayarla’yı seçin ve adı girin. IM için bir ROI oluşturmak için, aşağıdakileri seçerek tümör bölgesinden mevcut ROI’yi genişletin: Nesneler | Ek Açıklamalar… | Ek açıklamaları genişletin. Genişletme yarıçapının hangi boyutta olması gerektiğini seçin ve İç kısmı kaldır ve Üst öğeyle sınırla’yı seçin (Şekil 5D). Kontrast simgesine tıklayın, otomatik floresan kanalını seçin ve yoğunluğu en iyi şekilde görünür hale getirmek için ayarlayın. Yatırım getirisini dışarıdan yumuşatmak ve bu yatırım getirisinin bir parçası olmaması gereken tüm arka planları kaldırmak için alt tuşuna basarken çubuğu tıklayın ve yatırım getirisini ayarlayın. Soldaki listede ek açıklamaya sağ tıklayarak ROI’ye istilacı kenar boşluğu veya anlık ileti gibi uygun bir ad verin, Özellikleri ayarla’yı seçin, adı girin ve isteğe bağlı olarak rengini yeşil olarak değiştirin. Ek açıklamaları kaydedin: Dosya | Nesneleri dışa aktarma | Tüm nesneleri dışa aktarın ve FeatureCollection Olarak Dışa Aktar’da varsayılan seçimle Tamam’a tıklayın ve tercih edilen bir konuma kaydedin. 8. Bağışıklık hücresi tespiti ImmuNet hem eğitim hem de çıkarım için bileşen verilerini (çok kanallı TIFF dosyaları) kullandığından, ek açıklamaları eğitim ve doğrulama kümelerine bölün. Modeli eğitmek için, deponun Benioku dosyasında açıklanan adımları izleyin, örnek veri kümesini ve ek açıklamaları istenen verilerle değiştirin. Farklı bağışıklık hücrelerinin yanı sıra, ilgilenilen bir hücre olarak tanınmaması gereken yerlerde arka plan açıklamaları yaparak modele olumsuz örnekler sağlayın: tümör hücreleri, diğer hücreler veya “hücre yok” (ilgilenilen hücrelerle karıştırılabilecek yapılar); Ayrıntılar için ImmuNet yayınına bakınız32. Doğrulama ek açıklamalarını kullanarak performansın tatmin edici olduğundan emin olun. Modelin algılamadığı doğrulama ek açıklamalarının bir payı olan ek açıklama türü başına hata oranına bakın – en basit değerlendirme metriği. Birkaç tam açıklamalı yatırım getirisi yaparak ve F puanlarını hesaplayarak yanlış pozitiflere göre performansı değerlendirin. Nicel değerlendirmeye ek olarak, modelin yapma eğiliminde olduğu hatalar hakkında nitel bir fikir edinmek için tahmini görsel olarak inceleyin (Şekil 6, Ek Dosya 6: Ek Şekil S4 ve Ek Şekil S5). Model performansının yetersiz olduğuna karar verilirse, depoda açıklandığı gibi bazı kutucuklar için tahmini görselleştirin ve hangi sitelerin hataya en açık olduğunu denetleyin. Bu tür sitelerde daha fazla ek açıklama yapın ve model eğitimini ve değerlendirmesini yeniden çalıştırın. Hedef performans elde edildiğinde, depo Readme’nin Tüm veri kümesi için çıkarım bölümünde açıklandığı gibi tüm veri kümesi için çıkarımı çalıştırın. Elde edilen .csv dosyalarını model tahminiyle birlikte veri analizi için giriş olarak kullanın (bunun için bir Python veya R betiği yazın). 9. Tahmin fenotiplemesi ve veri analizi NOT: Bu bölümde, lenfosit paneli ile boyanmış tek bir melanom örneği için, ImmuNet (bölüm 8) tarafından tanımlanan bağışıklık hücrelerinin konumlarını ve QuPath ile tanımlanan ROI’leri (bölüm 7) birleştiren basit bir veri analizi örneği veriyoruz. Analiz R 4.1.1’de gerçekleştirilmiştir (bir komut dosyası Ek Dosya 8 olarak sağlanmıştır). Komut dosyası şu paketleri gerektirir: plyr 1.8.8, dplyr 1.0.8, tidyr 1.2.0, sf 1.0-7, ggplot2 3.4.0, RANN 2.6.1 ve RColorBrewer 1.1-2, install.packages() komutuyla kurulabilir. Girdi olarak, ImmuNet’in bir örnek tahminini içeren bir .csv dosyası ve QuPath’ten dışa aktarılan ROI’leri içeren bir dosya alır. Adım 9.1-9.6, sağlanan komut dosyasında gerçekleştirilen tek bir numunenin analizini açıklar ve bölüm 9.7-9.9, birden fazla numunenin analizi için seçenekleri açıklar. ImmuNet’in tahminini R’ye yükledikten sonra, fenotipleri tanımlayan belirteçleri birbirine karşı çizerek ve popülasyonları en iyi ayıran eşikleri seçerek tahmin edilen belirteç ifadesi için eşikleri belirleyin.NOT: Verilen örnek için kullanılan geçit stratejisi Şekil 7B’de gösterilmiştir. Miyeloid ve dendritik hücre panelleri için geçit stratejileri Ek Dosya 6’da gösterilmiştir: Ek Şekil S6 ve Ek Şekil S7. Eşikleri belirledikten sonra, her bir ImmuNet tahminine bir panelde tanımlanmış bir fenotip atamak için bunları kullanın. Bazı tahminlerde, tahmin edilen belirteçlerin hiçbirinin eşiğin üzerinde olmadığını veya eşiklemeden sonra ifade edildiği düşünülen belirteçlerin kombinasyonunun tutarsız olabileceğini gözlemleyin (ör., lenfosit panellerinde CD3+ CD20+ tahminleri). Adım 8.3’te iyi model performansı elde edilirse, bu tür tahminlerin oranı küçük olacaktır; Analizden önce bunları filtreleyin. QuPath’te çizilen tümör ve 100 μm’ye kadar invaziv marjı için ROI’leri ayrı ayrı analiz etmek için, karşılık gelen GeoJSON dosyalarını R’ye yükleyin ve her tahmin için tahminin düştüğü ROI’yi belirleyin. Akıl sağlığı kontrolü için ve keşif veri analizinin bir parçası olarak, bir örnekte bulunan bağışıklık hücrelerini, ROI’lerin sınırlarıyla birlikte karşılık gelen ROI’lerde ayrı ayrı görselleştirin (Şekil 7A). Şimdi, her bir ROI için farklı bağışıklık hücrelerinin yoğunluklarını ayrı ayrı hesaplayın. Verilen örnekte bulunan yoğunluklar Tablo 1’de gösterilmiştir. Birden fazla örnek varsa, hücre yoğunluklarının dağılımını görselleştirin. Normal dağılımlı değerler elde etmek için yoğunluk değerlerini log-transform haline getirin.NOT: Belirli fenotiplerin sayıları 0 olduğunda, bunlar Log dönüşümüne uğratılamaz ve bu da eksik değerlere yol açar. Bu sorunun üstesinden gelmek için, yüzey alanına bölünmeden önce tüm hücre sayımlarına 0,5 eklenerek LaPlacian yumuşatma uygulanabilir. Yoğunluk değerlerini analiz edin ve tercih ettiğiniz yazılımı kullanarak çizin (Şekil 8). Hücrelerin korunmuş konumları uzamsal analize olanak tanır. Örneğin, tespit edilen her bağışıklık hücresi için en yakın komşuyu bulun ve ardından her fenotip için, farklı fenotiplerin en yakın komşu olarak ortaya çıktığı durumların yüzdesini hesaplayın.NOT: Bu örnekte bulunan doğal öldürücü (NK) hücrelerin sayısı çok küçük olduğundan, onları bu analizden çıkardık. Tümör ve IM ROI’leri için elde edilen sonuçlar Şekil 9’da verilmiştir.

Representative Results

Tümör dokusu içeren FFPE bloklar patoloji raporları ve HE boyalı preparatlar baz alınarak seçildi. Hastadan birden fazla tümör lezyonu rezeke edildiğinde ve/veya tümör örnekleri büyük olduğunda, bunlar birden fazla FFPE bloğuna bölünür. Hem tümör bölmesinde hem de tümörün invaziv kenarı (IM) olarak bilinen şeydeki bağışıklık hücrelerini analiz etmeyi tercih ediyoruz. IM, tümöre komşu olan kanserli olmayan stromal dokudur. Bu nedenle, bir tümör örneği için birden fazla FFPE bloğu mevcut olduğunda, her iki doku tipini de içeren FFPE blokları seçilir. HE ile boyanmış slaytlarda görüldüğü gibi, bir FFPE bloğu tümör dokusu ve tümöre komşu stromal doku içeriyordu (Şekil 1A). Aynı tümörden gelen başka bir FFPE bloğu çok daha az çevre stromal doku içeriyordu (Şekil 1B). Bununla birlikte, bazı doku örnekleri için FFPE bloklarında seçenek yoktur veya IM, FFPE bloklarının hiçbirinde mevcut değildir. Bu genellikle veri yorumlama sırasında akılda tutulması gereken (iğne) biyopsiler için geçerlidir. Şekil 1: Bir melanom tümör örneğinin HE ile boyanmış slaytları. (A) Numunenin sağ üst köşesinde tümöre (IM) bitişik stromal dokuya sahip bir tümör örneği örneği (siyah ok uçları ile gösterilmiştir). (B) Numunede çok az stromal doku bulunan veya hiç bulunmayan aynı tümör lezyonundan başka bir numune. Ölçek çubukları = 5 mm. Kısaltmalar: HE = hematoksilen ve eozin; IM = invaziv marj. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Önerilen yedi renkli bir panel (Ek Dosya 4) ile multipleks IHC boyama, 3 günlük bir boyama işleminde (normal çalışma saatleri göz önüne alındığında) manuel olarak veya bir otomatik boyama makinesinde gece boyunca gerçekleştirilebilir. Otomatik boyayıcıyı kullanırken, bölümlerin, sistemin optimum akışkanlığını sağlayan cam sürgü üzerinde belirli bir yere monte edilmesi gerekir (Şekil 2A). Bölümler kızaklara doğru şekilde monte edildiğinde (Şekil 2B), eşit şekilde lekelenecektir (Şekil 2C). Bölümler cam lam üzerine en uygun şekilde monte edilmezse (Şekil 2D), otomatik boyalayıcının akışkanları (tam) dokuya ulaşmadığı için genellikle optimal olmayan bir boyama paterni ile sonuçlanır (Şekil 2E). Bu, numuneler çok büyük olduğunda veya monte edilmiş slaytlar bu sorunun farkında olmayan biri tarafından sağlandığında meydana gelebilir. Bu durumlarda, analiz için slaydın sadece iyi lekelenmiş kısmı seçilmelidir. Bu tür numuneler için başka bir seçenek, sıvıları en iyi şekilde yaymak için bunları manuel olarak boyamak olabilir. Şekil 2: FFPE bölümünün cam kızağa montajı ve darbe. (A) Otomatik boyayıcı üzerinde optimum boyama için cam sürgünün nereye monte edileceğinin şeması. (B) Doğru monte edilmiş bir kızak örneği. (C) Doğru monte edilmiş slaytlar, eşit şekilde lekelenmiş bir doku bölümü ile sonuçlanır. (D) Optimal olmayan monte edilmiş bir kızak örneği. (E) Yetersiz monte edilmiş slaytlar, bu resmin sol tarafında görüldüğü gibi eksik bir lekeli doku bölümüne neden olabilir. Ölçek çubukları = 5 mm. Kısaltma: FFPE = formalin sabit ve parafine gömülü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Büyük multipleks IHC deneyleri çoklu boyama turlarında gerçekleştirildiğinde ve büyük miktarlarda çözeltilerin hazırlanması gerektiğinde, multipleks IHC’ye geçmeden önce bu reaktifleri monopleks bir IHC çalışmasında test etmek en iyisidir. Monoplex IHC, beklenen boyama paternleri için dijital patoloji görüntüleyici ile kontrol edilir ve pozlama süreleri, kontrol slaytları üzerindeki ilgili filtrelerle ayarlanır (Şekil 3A-H). Bademcik dokusu, çoğu bağışıklık hücresi belirteci için pozitif bir kontrol olarak kullanılır. Bademcik kontrol dokusunda DAPI maruziyet süresi her zaman diğer dokulara göre daha yüksek olduğu için (Şekil 3G), DAPI maruziyet süresinin çalışılacak doku tipine göre ayarlanması gerekmektedir. Bu tür tarama ile düzenli maruz kalma süreleri, florofor ve filtreye bağlı olarak 1 ms ile 30 ms arasındadır (Şekil 3I). Bir monopleks IHC bu sayıları aştığında veya boyama paterni beklendiği kadar net olmadığında, antikor çözeltisi ayarlanmalı veya değiştirilmelidir. Burada gösterilen örnekte, yoğunluğu diğer belirteçlerle daha fazla aralıkta tutmak için FOXP3 konsantrasyonunu (Şekil 3C ve Şekil 3I) artırmaya karar verdik. Otofloresan diğer dokularda da bademcik kontrol dokusundan daha güçlü olabilir. Bizim ayarımızda, Sample AF filtresinin maruz kalma süresi 25 ms ile 50 ms arasındadır (Şekil 3H,I). Şekil 3: Monopleks IHC ve boyanmamış kontrol numunelerinde maruz kalma sürelerinin ayarlanması. (A) Tonsil kontrol dokusunda CD20 – Opal 480 sinyali. (B) CD3 – Tonsil kontrol dokusunda Opal 520 sinyali. (C) Bademcik kontrol dokusunda FOXP3 – Opal 570 sinyali. (D) CD56 – Tonsil kontrol dokusunda Opal 620 sinyali (E) CD8 – Tonsil kontrol dokusunda Opal 690 sinyali. (F) Tümör belirteci – Bademcik kontrol dokusunda Opal 780 sinyali. (G) Bademcik kontrol dokusundaki DAPI sinyali genellikle ilgilenilen doku tipinden daha zayıftır. (H) Otofloresan – tümör kontrol dokusunda örnek AF sinyali. (I) ile ayarlamadan ve multipleks IHC lekeli slaytları kontrol etmeden önce maruz kalma sürelerinin ekran görüntüsü. Ölçek çubukları = 100 μm. Kısaltmalar: AF = otofloresan; IHC = immünohistokimya; DAPI = 4’6-diamidino-2-fenilindol. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Multipleks IHC gerçekleştirildikten sonra, pozlama süreleri, birkaç multipleks IHC slaytı kontrol edilerek ve otomatik pozlama seçilerek monoplex IHC ayarlarından ayarlanır. Bu tür bir taramada, doygunluk koruma seçeneği yoktur ve bu nedenle, pozlamayı çok yükseğe ayarlamaktan kaçınmak ve böylece aşırı pozlamayı önlemek son derece önemlidir. Aşırı maruz kalma, floroforların spektral olarak karışmasını engeller. Genellikle monopleks IHC’ye dayalı maruz kalma sürelerini aşan pozlama süreleri ayarlamayız ve yalnızca multipleks IHC’de daha güçlü olan belirteçler için maruz kalma sürelerini azaltırız (Şekil 3G ve Şekil 4A). Birkaç slaytta farklı konumlarda otomatik pozlama yaparak, birkaç filtrenin pozlama sürelerinin hala çok yüksek olduğu gözlemlenebilir. Bunlar, otomatik pozlama ayarı kullanılırken gözlemlenen en düşük sayıya ayarlanmalı ve diğer görünmeyen konumlarda aşırı pozlamayı önlemek için değerin ‘unu daha çıkarmalıdır (Şekil 4A). Bu yöntemle, belirli filtreler için maruz kalma süreleri, monopleks IHC’de ayarlananlardan daha düşük olabilir. Bununla birlikte, başarılı bir multipleks IHC deneyi ile, tüm belirteçler, en azından kontrol slaytında gözlemlenebilir olmalıdır (Şekil 4B-H, Ek Dosya 6: Ek Şekil S1 ve Ek Şekil S2). Bazı belirteçlerin her numunede bulunmayabileceğini göz önünde bulundurun. En az bir bademcik bölümü içeren bir kontrol sürgüsü ekleyerek, standart panellerin tüm işaretleyicilerinin başarılı bir şekilde boyanması ve sinyal gücü doğrulanabilir. Şekil 4: Bir melanom tümör örneğinde lenfosit paneli ile başarılı bir şekilde boyanmış bir kesit örneği. (A) Bu multipleks IHC örneğini kaydetmek için kullanılan maruz kalma süreleri. (B) Tümör dokusu içindeki multipleks IHC lenfosit panelinin kompozit görüntüsü. (C) CD20 – macenta cinsinden Opal 480 sinyali. (D) CD3 – Kırmızı Opal 520 sinyali. (E) FOXP3 – Yeşil renkli Opal 570 sinyali. (F) CD56 – Sarı renkte Opal 620 sinyali. (G) CD8 – Camgöbeği cinsinden Opal 690 sinyali. (H) TM – Beyaz Opal 780. Ölçek çubukları = 100 μm. Kısaltma: TM = tümör belirteci; IHC = immünohistokimya. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Multipleks IHC slaytları dijital görüntüleyici tarafından tamamen taranır. Sonraki analiz için döşemeler slayt görüntüleyicide seçilir. Bununla birlikte, tümör ve IM gibi daha spesifik bölgelerin analiz edilmesi gerektiğinde, bu ilgi alanları (ROI’ler) QuPath kullanılarak çizilebilir. Slayt görüntüleyicide seçilen kutucukların toplu işlenmesi tamamlandıktan sonra, bileşen dosyaları yeniden birleştirilir (Şekil 5A ve Ek Dosya 7). Tümör işaretleyici kanalı (Şekil 5B) ve QuPath’teki sihirli değnek aracı kullanılarak, tümör taslağı “Tümör ROI”sini oluşturmak için izlenebilir (Şekil 5C). Daha sonra, Tümör ROI’si, bir “invaziv marj ROI” oluşturmak için belirli bir mesafe, bu durumda 500 μm ile genişletilebilir (Şekil 5D). İstenmeyen herhangi bir arka plan (doku dışı), otofloresan sinyaline bakılarak sihirli değnek aracıyla bu ROI’den çıkarılır (Şekil 5E). Hem Tümör ROI hem de IM ROI, daha fazla işlem için bir GeoJSON dosyası olarak kaydedilir (Şekil 5F). Şekil 5: QuPath’te tümör ROI ve invaziv marj ROI çizim süreci. (A) Birleştirilmiş bileşen dosyaları. (B) Yalnızca tümör işaretleyici kanalını gösteren gri tonlamalı görüntü. (C) Tümör ROI, tümör marker sinyalinin etrafına çizilir. (D) IM ROI’YI OLUŞTURMAK IÇIN Tümör ROI’sini 100-500 μm genişleterek yeni bir ROI yapılır. (E) IM ROI, ARKA PLAN (NEGATIF SINYAL) VE YAĞ, KAN DAMARLARı VE SAÇ FOLIKÜLLERI GIBI DIĞER BÜYÜK DOKU YAPıLARı HARIÇ TUTULARAK YALNıZCA STROMAL DOKUYU IÇERECEK ŞEKILDE AYARLANıR. (F) Elde edilen tümör ROI ve IM ROI, bölgelerin daha fazla işlenmesi için kaydedilir ve GeoJSON dosyalarına aktarılır. Tümör ROI’si kırmızı bir anahat ile ve IM ROI’si yeşil bir anahat ile görüntülenir. Ölçek çubukları = 2 mm. Kısaltmalar: ROI = ilgi alanı; IM = invaziv marj; GeoJSON = Coğrafi JavaScript Nesne Gösterimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. ImmuNet ağları bağışıklık hücrelerini tespit etmek için kullanılabilir. Lenfosit paneli için, deneysel kompozit görüntü (Şekil 6A), yazılım tarafından tespit edilen bağışıklık hücreleri ile görsel olarak karşılaştırılabilir (Şekil 6B). Miyeloid panel (Ek Dosya 6: Ek Şekil S4) ve dendritik hücre paneli (Ek Dosya 6: Ek Şekil S5) için de benzer görsel karşılaştırmalar yapılabilir. Şekil 6: ImmuNet tarafından tanınan lenfositler. (A) Şekil 4B’nin ImmuNet tarafından beyaz noktalarla tanınan hücreleri gösteren kompozit görüntüsü. (B) ImmuNet tarafından tanınan hücreler ve daha sonra tespit edilen işaretleyici ifadesi. Ölçek çubukları = 50 μm. Kısaltma: TM = tümör belirteci. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. ImmuNet tarafından tespit edilen ve .csv formatta kaydedilen bağışıklık hücreleri, daha fazla analiz için herhangi bir programlama diline aktarılabilir. R’de uzamsal görselleştirme ve geçit gerçekleştirdik (Ek Dosya 8). Tespit edilen hücreler daha sonra uzamsal olarak görselleştirilebilir (Şekil 7A, Ek Dosya 6: Ek Şekil S6 ve Ek Şekil S7). Psödobelirteç ekspresyonu üzerinde geçitleme, bireysel bağışıklık hücrelerini fenotiplemek için gerçekleştirilebilir (Şekil 7B). Şekil 7: Lenfosit panelinin geçit stratejisi. (A) QuPath ile tanımlanan Tümör ve İnvaziv Marj bölgelerinde tespit edilen bağışıklık hücreleri. (B) ImmuNet tarafından A bölümünden tespit edilen tüm hücrelerin geçitlenmesi. Lenfositler ilk olarak CD20+ B hücreleri ve CD3+ T hücreleri üzerine geçitlenir. CD3 + T hücreleri, CD8 ve FOXP3 ekspresyonu için daha fazla kapılıdır. CD20-CD3- popülasyonu, CD56 + doğal öldürücü hücreler için kapılıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Tahmin edilen hücrelerin fenotipleri geçit ile belirlendiğinde, farklı ROI’ler içinde farklı fenotiplerin hücre yoğunlukları hesaplanabilir. Bu, fenotip başına toplam hücre sayısının ROI’nin yüzey alanına bölünmesiyle hesaplanır (Tablo 1, Şekil 8 ve Ek Dosya 8). Burada B hücreleri CD3-CD20+, yardımcı T hücreleri CD3+CD20-CD8-FoxP3-, regülatör T hücreleri CD3+CD20-CD8-FoxP3+, sitotoksik T hücreleri CD3+CD20-CD8+FoxP3- ve NK hücreleri CD3-CD20-CD56+ olarak tanımlanmaktadır. Fenotip Tümördeki Yoğunluk (hücreler / mm2) IM cinsinden yoğunluk (hücre/mm2) B hücresi 185.74 145.62 Yardımcı T hücresi 301.46 157.51 Düzenleyici T hücresi 38.53 19.53 Sitotoksik T hücresi 185.35 83.21 NK hücresi 0.18 0 Tablo 1: ROI’lerdeki fenotiplerin yoğunlukları. Lenfosit paneli ile boyanmış tek bir melanom örneğinde bulunan farklı fenotiplerdeki hücrelerin yoğunlukları. Yoğunluklar, Tümör ve IM ROI’lerinde ayrı ayrı hesaplanır. Kısaltmalar: IM = istilacı kenar boşluğu; ROI = ilgi alanı. Şekil 8: Birden fazla örnek için veri analizi örneği. 23 primer melanom tümörünün tümör ve IM’sindeki farklı lenfosit fenotiplerinin yoğunluk analizi. Kısaltmalar: IM = istilacı kenar boşluğu; ROI = ilgi alanı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Bu bağışıklık hücrelerinin mekansal bilgilerine daha fazla dalmak için, bir örnekteki tanımlanmış fenotipler veya en yakın komşuların fenotiplerinin yüzdeleri arasındaki mesafeleri belirlemek de mümkündür (Şekil 9). Şekil 9: Tek bir numune için en yakın komşu analizi örneği. Lenfosit paneli ile boyanmış tek bir melanom örneğinde bulunan (A) Tümör ve (B) IM ROI’lerinde farklı hücre tipleri için en yakın komşu fenotiplerin yüzdesi. Kısaltmalar: IM = istilacı kenar boşluğu; ROI = ilgi alanı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Ek Dosya 1: Protokol özelliklerini özetleyen multipleks IHC. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın. Ek Dosya 2: Monoplex için otomatik boyama protokolü. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın. Ek Dosya 3: Otofloresan telafisi için otomatik boyama protokolü. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın. Ek Dosya 4: Multipleks immünohistokimya için otomatik boyama protokolü. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın. Ek Dosya 5: Şablon .csv dosyası. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın. Ek Dosya 6: Bir melanom doku örneğinde miyeloid ve dendritik hücre panelleri; tarama hatası durumunda slaytları işaretleme; ImmuNet tarafından tanınan miyeloid ve dendritik hücreler; miyeloid ve dendritik hücre panellerinin geçit stratejileri. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın. Ek Dosya 7: QuPath dikiş komut dosyası. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın. Ek Dosya 8: Veri analizi komut dosyası. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

TME’nin mekansal analizi, immün hücre bölmesi hakkında daha fazla bilgi edinmek ve özellikle immüno-onkoloji alanında yeni prognostik ve prediktif biyobelirteçleri keşfetmek için aranan bir tekniktir16. Bu amaçla, 100-1.000 hedefe kadar tahminlerle proteinlerin, mRNA transkriptlerinin veya ikisinin bir kombinasyonunun tespitini içeren birçok farklı teknik geliştirilmektedir. Bununla birlikte, daha yüksek çoğullama, daha az yüksek verimli deneyler, daha yüksek deneysel maliyetler ve teknik zorluklar pahasına gelir ve çoğu zaman TME’nin yalnızca küçük bir kısmı analiz edilebilir. Burada anlattığımız TSA tabanlı yöntemi kullanan multipleks IHC, aynı anda altı farklı belirteç + DAPI’yi tespit eder, gerçekleştirmesi nispeten daha ucuzdur ve tüm doku kesitleri 20 dakikadan kısa sürede tam olarak analiz edilmeye hazır olarak görüntülenir. Bu teknik, boyama prosedürünün otomasyonu ile daha az karmaşık hale geldi. İki ekstra filtrenin eklenmesini içeren multispektral mikroskoptaki iyileştirmeler, spektral karıştırma ve tarama sürelerini büyük ölçüde iyileştirdi. Aynı anda sekiz farklı işaretleyici + DAPI’yi tespit etmek mümkündür. Bununla birlikte, çoğullamayı daha fazla işaretleyici ile genişleterek, spektral karıştırmanın çözülmesi daha zor hale geldikçe ve tüm slaytlar için tarama süreleri önemli ölçüde arttıkça yukarıda belirtilen faydalar ortadan kalkar. Tanı ortamında uygulamayı daha kolay kolaylaştırmak için multipleks IHC’yi farklı kurumlar arasında standartlaştırmak için çabalar sarf edilmektedir. Multipleks IHC’nin bu standardizasyonu için, kullanıcılara altı farklı işaretleyici + DAPI ile daha erişilebilir protokole uymalarını tavsiye ediyoruz. Bununla birlikte, yine de oldukça fazla teknik bilgi birikimi gereklidir ve aşağı akış analizi zor olabilir, bunun için bu protokolde açıklanan metodolojileri geliştirdik.

Standardizasyon, multipleks IHC panel geliştirme ile başlar. Belirli protein hedeflerini tespit eden primer antikorların seçiminin önemi17’den önce vurgulanmıştır. Multipleks IHC panellerimiz çoğunlukla, teşhis departmanımızda IHC için de kullanılan ve doğrulanan primer antikor klonları ile geliştirilmiştir. Bununla birlikte, dendritik hücre multipleks IHC paneli durumunda, çoğu antikor tanı ortamında kullanılmamıştır (van der Hoorn ve diğerleri, gönderimdeki el yazması). Özgüllüğü sağlamak ve parti farklılıklarını en aza indirmek için, poliklonal antikorlar yerine monoklonal antikorları kullanmayı seçtik ve ayrıca transfekte hücre hatları ve birincil hücreler kullanarak çoğu antikoru doğruladık. Yıllar boyunca, Vectra 3 sistemi kullanılarak yapılan çok sayıda çalışmada multipleks IHC panellerin farklı versiyonları kullanılmıştır 18,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32. Bu multipleks IHC panellerini PhenoImager HT sistemine en iyi şekilde uygulamak için, birincil antikor ve florofor kombinasyonlarında bazı ayarlamalar yapılması gerekiyordu. Tüm doku bölümlerinin daha iyi spektral karıştırma ve daha hızlı tarama sürelerinden yararlanmak için, en yeni Opal480 ve Opal780 floroforlarının uygulanması ve yedi renkli multipleks IHC panellerinde Opal540 ve Opal650 floroforların kullanılmasından kaçınılması gereklidir. Tarama süreleri, doku bölümünün boyutuna bağlı olarak ~ 3-10 kat daha hızlıdır. Multipleks IHC panel ayarlarının gerçekleştirilmesi oldukça kolaydı, ancak bazı hususların akılda tutulması gerekiyor. Opal480’in floresan spektrumu, otofloresan spektrumu ile çok örtüşür ve bu nedenle eritrositlerin ve diğer otofloresan yapıların spektral olarak karıştırılmasına müdahale eder. Opal480 ile eşleştirilmiş primer antikorun artan konsantrasyonunun kullanılması çoğu durumda bu sorunu çözmüştür. PhenoImager HT üzerinde tescilli Örnek AF filtresinin uygulanması, Opal480 ve otofloresansın karıştırılmasını kolaylaştırır. Bununla birlikte, Opal480 ile birlikte kullanıldığında net bir sinyal veren bir birincil antikor kullanmak en iyisidir, böylece sinyali otofloresandan daha yüksek olur.

Bu multipleks IHC panelleri kurulmuş olsa da, partiden partiye varyasyon dikkate alınması gereken bir şeydir. Tam multipleks IHC deneyine başlamadan önce monopleks IHC kontrolleri yaparak, bazen primer antikorların deneyden deneye daha güçlü veya daha zayıf performans gösterdiğini gözlemledik. Bunun nedenleri pipetleme hataları, yetersiz reaktif saklama koşulları ve raf ömrü olabilir. Bunu, deneyimlerimize dayanarak birincil antikor solüsyonunu ayarlayarak çözdük. Yukarıda belirtilen ayarlamaların hiçbirinin yapılması gerekmese bile, her multipleks IHC toplu deneyinde, monopleks IHC lekeli kontrol slaytlarına dayalı olarak maruz kalma sürelerinin ayarlanması önemlidir.

Araştırmamız başlangıçta farklı karsinom ve melanom tiplerine odaklandığından, multipleks IHC panellerinin minimal ayarlamalarla tümör tipleri arasında değiştirilebilir olması gerekiyordu. Bu nedenle, optimizasyon sürecine her zaman birden fazla (tümör) doku tipini dahil ettik ve immün hücre belirteçleri için primer antikorlar için seyreltmelerin farklı tümör tipleri arasında benzer tutulabileceğini gözlemledik. Bununla birlikte, karsinomlar ve melanom arasındaki tümör dokusu tespiti, farklı tümör belirteçlerine ihtiyaç duyar. Buna göre, tümör markörü her zaman her bir multipleks IHC panelinin sonunda çalışacak şekilde optimize edilmiştir ve şu anda her zaman Opal780 ile birlikte kullanılmaktadır, bu da tesadüfen bir multipleks IHC boyama prosedüründe son floroforda olması gerekir. Sonuç olarak multipleks IHC’nin sonunda tümör markörünü kullanarak, bu multipleks IHC panelleri, glioblastoma (yani GFAP) ve Hodgkin lenfoma (yani CD30) gibi diğer tümör tipleri ile kolayca değiştirilebilir. Anjiyosarkom için, sadece iki optimizasyon deneyi ile tümör belirteci olarak eritroblast transformasyonuna özgü ilişkili gen (ERG) ile bu lenfosit multipleks IHC panelini kullandık25. Optimizasyon, ERG primer antikorunun titrasyonunu ve sonunda ERG ile multipleks IHC panelinin test edilmesini içeriyordu.

Bu multipleks IHC panellerinde yapılan diğer ayarlamalar, belirli bir bağışıklık hücresi belirtecinin başka bir bağışıklık veya fonksiyonel belirteç ile değiştirilmesiyle de yapılabilir. Her değişiklik optimizasyon gerektirir. Optimizasyon protokolü daha önce açıklandığı gibi takip edilebilir17. Önerilen multipleks IHC panellerinde yapılan bazı değişiklikler, oluşturduğumuz ImmuNet algoritmalarına müdahale edecektir. Yeterli veri üretilmeli ve bu değişiklikleri algoritmaya uygulamak için zaman harcanmalıdır (her yeni belirteç ve/veya hücre fenotipi için en az 750 ek açıklama ve önceden eğitilmiş belirteçlerin doğrulanması için 150 ek açıklama). Burada sunulan paneller fonksiyonel belirteçler içermemektedir, ancak PD-1 ve PD-L1 gibi immün kontrol noktası belirteçlerinin çoğullama IHC panellerine uygulanması laboratuvarımızda yapılmaktadır. Bununla birlikte, negatif ve pozitif sinyallerde daha az ikili olan belirteçlerin analizinin daha zor olduğu kanıtlanmıştır ve grubumuzda aktif bir araştırma alanıdır.

Multipleks IHC ile eş zamanlı olarak değerlendirilebilen belirteç sayısı diğer yeni tekniklere göre sınırlıdır. Bu, bir FFPE bloğunun ardışık dilimleri üzerindeki farklı panelleri analiz ederek aşılabilirken, bu dilimleri uzamsal olarak karşılaştırmak zor olacaktır. Yönlendirme ve katlanmış artefaktlar, slayt hazırlığından sonra büyük olasılıkla aynı değildir. Bununla birlikte, multipleks IHC oldukça erişilebilirdir, bu da onu daha fazla kurum ve araştırmacı için çekici bir araç haline getirir ve bu nedenle, bir teşhis ortamında gelecekteki uygulamalar için daha uygundur. Çoklu tümör tipleri ve aşağı akış analiz boru hatları için multipleks IHC immün hücre panellerinin standardizasyonu ile, hastalar ve tümör tipleri arasındaki TME farklılıkları hakkında daha fazla bilgi edinilebilir. Bu, örneğin, TME’nin spesifik tedavilere antitümör yanıtındaki rolü hakkında daha fazla bilgi edinilmesine yol açabilir. Bu, tedaviye yanıt ve beklenen sağkalım gibi faktörleri tahmin etmek için yeni biyobelirteçlere bile yol açabilir. Genel olarak, bu, multipleks IHC’nin kişiselleştirilmiş bir tıp yaklaşımında klinik karar vermeye yardımcı olacak klinik bir araç haline gelmesini sağlayabilir. Kuşkusuz, analiz prosedürünün daha fazla adımı, günlük bir teşhis ortamında kullanım için uygun olması için muhtemelen otomatikleştirilmeli ve standartlaştırılmalıdır, bu nedenle henüz çoğunlukla fütüristik bir bakış açısıdır.

Tek bir numune slaytı üzerinde birden fazla işaretleyicinin analizi, teknik zorluklarına rağmen çok güçlü bir araç olabilir. Standartlaştırılmış deneysel protokoller ve sağlam bir analiz yöntemiyle, burada ImmuNet kullanarak tanımladığımız gibi, çoklu belirteçlerin nicelleştirilmesi onu klasik IHC’den daha bilgilendirici hale getirirken, multipleks IHC, yeni yüksek pleks deneysel yöntemlere kıyasla nispeten yüksek verim sağlar.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

PhenoImager HT, Radboud Üniversitesi Tıp Merkezi ve Radboud Mikroskopi Teknoloji Merkezi tarafından sağlanan fonlarla satın alındı. CF, Hollanda Kanser Derneği hibesi (10673) ve ERC Adv hibesi ARTimmune (834618) tarafından finansal olarak desteklenmektedir. JT, bir NWO Vidi hibesi (VI.Vidi.192.084) tarafından finansal olarak desteklenmektedir. Yazarlar, multipleks IHC verilerini depolamak için iş akışları oluşturmadaki yardımları için Eric van Dinther ve Ankur Ankan’a teşekkür eder ve ROI çizimi için QuPath’te multipleks IHC verilerinin nasıl uygulanacağına ilişkin talimatlar için Bengt Phung’a teşekkür eder.

Materials

anti-CD14 Cell Marque  114R-16 section 3, clone EPR3653
anti-CD163 Cell Marque  163M-15 section 3, clone MRQ-26
anti-CD19 Abcam ab134114 section 3, clone EPR5906
anti-CD1c (BDCA1) Thermo Scientific TA505411 section 3, clone OTI2F4
anti-CD20 Thermo Scientific MS-340-S section 3, clone L26
anti-CD3 Thermo Scientific RM-9107 section 3, clone sp7
anti-CD303/BDCA2 Dendritics via Enzo Lifesciences/Axxora DDX0043 section 3, clone 124B3.13
anti-CD56 Cell Marque  156R-94 section 3, clone MRQ-42
anti-CD66b BD Biosciences 555723 section 3, clone G10F5
anti-CD68 Dako Agilent M087601 section 3, clone PG-M1
anti-CD8 Dako Agilent M7103 section 3, clone C8/144B
anti-Foxp3 Thermo Scientific 14-4777 section 3, clone 236A/E7
anti-Gp100 Dako Agilent M063401 section 3, clone HMB45
anti-HLA-DR, DP, DQ Santa Cruz sc-53302 section 3, clone CR3/43
anti-MART-1 Thermo Scientific MS-799 section 3, clone A103
anti-pan cytokeratin Abcam ab86734 section 3, clone AE1/AE3 + 5D3
anti-SOX10 Sigma Aldrich 383R section 3, clone EP268
anti-Tyrosinase Sanbio MONX10591 section 3, clone T311
anti-XCR1 Cell Signaling Technologies via Bioké 44665S section 3, clone D2F8T
antibody diluent Akoya BioSciences SKU ARD1001EA section 3, from Opal 7-Color Automation IHC Kit 50 slide (can optionally also be replaced by TBST with 10% BSA)
Bond Aspirating Probe Leica Biosciences S21.0605 section 3
Bond Aspirating Probe Cleaning Leica Biosciences CS9100 section 3
Bond Dewax Solution Leica Biosciences AR9222 section 3
Bond Objectglas label + print lint Leica Biosciences S21.4564.A section 3
Bond Research Detection System 2 Leica Biosciences DS9777 section 3
Bond RX autostainer  Leica Biosciences – section 3, automated platform
Bond TM Epitope Retrieval 1 – 1 L Leica Biosciences AR9961 section 3
Bond TM Epitope Retrieval 2 – 1 L Leica Biosciences AR9640 section 3
Bond TM Wash Solution 10x – 1 L Leica Biosciences AR9590 section 3
BOND Universal Covertile Leica Biosciences S21.4611 section 3
Bond(TM) Titration Kit Leica Biosciences OPT9049 section 3
Coverslip 24 x 32 mm #1 (0.13-0.16 mm) Fisher Scientific 15717592 section 2
coverslip 24 x 50 mm VWR 631-0146 section 2
DAPI Fluoromount-G VWR 0100-20 section 3, whenever monoplex slides need to be quickly checked, not for official analysis, then DAPI is stained seperately for better results
Eosine section 2, home made
Ethanol 99.5% VWR 4099.9005 section 2
Fluoromount-G VWR 0100-01 section 3 
haematoxyline – section 2, home made
ImmuNet – immune cell detection and phenotyping pipeline
inForm software 2.4.10 Akoya BioSciences – section 4 & 6
OPAL 480 reagent pack Akoya BioSciences FP1500001KT section 3
OPAL 520 reagent pack Akoya BioSciences FP1487001KT section 3
OPAL 570 reagent pack Akoya BioSciences FP1488001KT section 3
OPAL 620 reagent pack Akoya BioSciences FP1495001KT section 3
OPAL 690 reagent pack Akoya BioSciences FP1497001KT section 3
OPAL 780 reagent pack Akoya BioSciences FP1501001KT section 3
Opal 7-Color Automation IHC Kit 50 slide Akoya BioSciences NEL821001KT section 3
PhenoChart 1.1.0 Akoya BioSciences – section 5
PhenoImagerHT Akoya BioSciences CLS143455 section 4, digital pathology imager with slide viewer and imaging software (formerly known as Vectra Polaris)
Quick-D mounting medium Klinipath 7280 section 2
QuPath 0.3.2 whole slide image analysis software platform
R 4.1.1
Slide boxes VWR 631-0737 section 1
SuperFrost Plus Thermo Scientific through VWR 631-9483 section 1
Vectra Polaris software 1.0.13 Akoya BioSciences – section 4
Xylene VWR 4055-9005 section 2
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dunn, G. P., Bruce, A. T., Ikeda, H., Old, L. J., Schreiber, R. D. Cancer immunoediting: from immunosurveillance to tumor escape. Nature Immunology. 3 (11), 991-998 (2002).
  2. van der Woude, L. L., Gorris, M. A. J., Halilovic, A., Figdor, C. G., de Vries, I. J. M. Migrating into the tumor: a roadmap for T cells. Trends in Cancer. 3 (11), 797-808 (2017).
  3. Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome. Nature Reviews. Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).
  4. Fridman, W. H., et al. The immune microenvironment of human tumors: general significance and clinical impact. Cancer Microenvironment. 6 (2), 117-122 (2013).
  5. Pages, F., et al. International validation of the consensus Immunoscore for the classification of colon cancer: a prognostic and accuracy study. Lancet. 391 (10135), 2128-2139 (2018).
  6. Angell, H. K., Bruni, D., Barrett, J. C., Herbst, R., Galon, J. The Immunoscore: colon cancer and beyond. Clinical Cancer Research. 26 (2), 332-339 (2020).
  7. Angell, H., Galon, J. From the immune contexture to the Immunoscore: the role of prognostic and predictive immune markers in cancer. Current Opinion in Immunology. 25 (2), 261-267 (2013).
  8. Galon, J., et al. Cancer classification using the Immunoscore: a worldwide task force. Journal of Translational Medicine. 10, 205 (2012).
  9. Galon, J., et al. World-wide Immunoscore Task Force: meeting report from the 34;Melanoma Bridge&#34, Napoli, November 30th-December 3rd, 2016. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 212 (2017).
  10. Tumeh, P. C., et al. PD-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance. Nature. 515 (7528), 568-571 (2014).
  11. Creemers, J. H. A., et al. A tipping point in cancer-immune dynamics leads to divergent immunotherapy responses and hampers biomarker discovery. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002032 (2021).
  12. Blank, C. U., Haanen, J. B., Ribas, A., Schumacher, T. N. CANCER IMMUNOLOGY. The "cancer immunogram". Science. 352 (6286), 658-660 (2016).
  13. Teruya-Feldstein, J. The immunohistochemistry laboratory looking at molecules and preparing for tomorrow. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 134 (11), 1659-1665 (2010).
  14. Ramos-Vara, J. A., Miller, M. A., et al. When tissue antigens and antibodies get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry–the red, brown, and blue technique. Veterinary Pathology. 51 (1), 42-87 (2014).
  15. Hegde, P. S., Karanikas, V., Evers, S. The where, the when, and the how of immune monitoring for cancer immunotherapies in the era of checkpoint inhibition. Clinical Cancer Research. 22 (8), 1865-1874 (2016).
  16. Parra, E. Novel platforms of multiplexed immunofluorescence for study of paraffin tumor tissues. Journal of Cancer Treatment and Diagnosis. 2 (1), 43-53 (2018).
  17. Gorris, M. A. J., et al. Eight-color multiplex immunohistochemistry for simultaneous detection of multiple immune checkpoint molecules within the tumor microenvironment. Journal of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).
  18. Roelofsen, T., et al. Spontaneous regression of ovarian carcinoma after septic peritonitis; a unique case report. Frontiers in Oncology. 8, 562 (2018).
  19. van den Brand, D., et al. Peptide-mediated delivery of therapeutic mRNA in ovarian cancer. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 141, 180-190 (2019).
  20. van den Brand, D., et al. EpCAM-binding DARPins for targeted photodynamic therapy of ovarian cancer. Cancers. 12 (7), 1762 (2020).
  21. Di Blasio, S., et al. The tumour microenvironment shapes dendritic cell plasticity in a human organotypic melanoma culture. Nature Communications. 11 (1), 2749 (2020).
  22. van Beek, J. J. P., et al. Human pDCs are superior to cDC2s in attracting cytolytic lymphocytes in melanoma patients receiving DC vaccination. Cell Reports. 30 (4), 1027-1038 (2020).
  23. Rodriguez-Rosales, Y. A., et al. Immunomodulatory aged neutrophils are augmented in blood and skin of psoriasis patients. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 148 (4), 1030-1040 (2021).
  24. Hoeijmakers, Y. M., et al. Immune cell composition in the endometrium of patients with a complete molar pregnancy: Effects on outcome. Gynecologic Oncology. 160 (2), 450-456 (2021).
  25. van Ravensteijn, S. G., et al. Immunological and genomic analysis reveals clinically relevant distinctions between angiosarcoma subgroups. Cancers. 14 (23), 5938 (2022).
  26. van der Woude, L. L., et al. Tumor microenvironment shows an immunological abscopal effect in patients with NSCLC treated with pembrolizumab-radiotherapy combination. Journal for Immunotherapy of Cancer. 10 (10), e005248 (2022).
  27. Graham Martinez, C., et al. The immune microenvironment landscape shows treatment-specific differences in rectal cancer patients. Frontiers in Immunology. 13, 1011498 (2022).
  28. Cortenbach, K. R. G., et al. Topography of immune cell infiltration in different stages of coronary atherosclerosis revealed by multiplex immunohistochemistry. International Journal of Cardiology. Heart & Vasculature. 44, 101111 (2023).
  29. van Wilpe, S., et al. Homologous recombination repair deficient prostate cancer represents an immunologically distinct subtype. Oncoimmunology. 11 (1), 2094133 (2022).
  30. Gorris, M. A. J., et al. Paired primary and metastatic lesions of patients with ipilimumab-treated melanoma: high variation in lymphocyte infiltration and HLA-ABC expression whereas tumor mutational load is similar and correlates with clinical outcome. Journal for Immunotherapy of Cancer. 10 (5), e004329 (2022).
  31. van Wilpe, S., et al. Intratumoral T cell depletion following neoadjuvant chemotherapy in patients with muscle-invasive bladder cancer is associated with poor clinical outcome. Cancer Immunology, Immunotherapy. 72 (1), 137-149 (2023).
  32. Sultan, S., Gorris, M. A. J., Buytenhuijs, F., Lvan de Woude, L. A Segmentation-free machine learning architecture for immune land-scape phenotyping in solid tumors by multichannel imaging. bioRxiv. , (2021).
  33. Parra, E. R., et al. Immuno-profiling and cellular spatial analysis using five immune oncology multiplex immunofluorescence panels for paraffin tumor tissue. Scientific Reports. 11 (1), 8511 (2021).
  34. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
  35. Sun, Z., Nyberg, R., Wu, Y., Bernard, B., Redmond, W. L. Developing an enhanced 7-color multiplex IHC protocol to dissect immune infiltration in human cancers. PLoS One. 16 (2), e0247238 (2021).
  36. LeicaBiosystems. BOND RX Fully Automated Research Stainer Protocols. , (2022).

Tags

암 연구학Immune Cell LandscapeSpatial AnalysisLymphocytesMyeloid CellsDendritic CellsMachine LearningImmuNetDiagnostic Application

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Gorris, M. A. J., Martynova, E., Sweep, M. W. D., van der Hoorn, I. A. E., Sultan, S., Claassens, M. J. D. E., van der Woude, L. L., Verrijp, K., Figdor, C. G., Textor, J., de Vries, I. J. M. Multiplex Immunohistochemical Analysis of the Spatial Immune Cell Landscape of the Tumor Microenvironment. J. Vis. Exp. (198), e65717, doi:10.3791/65717 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image