腫瘍微小環境の空間免疫細胞ランドスケープのマルチプレックス免疫組織化学的解析

このプロトコルで示されている患者資料は、以前に実施された研究の一部であり、オランダの法律と並行して、地元のRadboudumc医療倫理委員会によって医療倫理承認が免除されると公式に見なされました（ファイル番号2017-3164)30。 1. FFPE材料の収集、ブロックの選定、サンプルの調製 治療を行う医師や病理医を通じて、患者ファイルから FFPE ブロック識別子を取得します。倫理的な許可が必要かどうかは、地域の規制に確認してください。 地域の病理アーカイブまたは外部の病院からFFPEブロックをリクエストします。注:特定の研究のために腫瘍材料または生検が取得される可能性もあります。これは、小規模な臨床試験や動物実験に当てはまります。このような場合、組織サンプルの処理は研究者の責任となる場合があります。 複数のFFPEブロックが利用可能な場合は、ヘマトキシリンおよびエオシン(HE)染色されたスライドを評価することにより、周囲の間質組織が存在する生存腫瘍組織を含む最も代表的なFFPEブロックを選択します(図1)。注:この選択については、専門家の意見(病理医など)を得ることをお勧めします。FFPE ブロックの内容の評価に HE を使用できず、選択のために新しい HE を作成する必要がある可能性があります。説明については、セクション 2 に進んでください。 厚さ4μmのFFPEリボンをミクロトームにカットします。注:厚さは1μmから6μmの間で、目立った染色の影響はありません。ただし、4μmが最も標準です。 以下のいずれかを使用して、オートステイナーの流路系に適した位置にサンプルをスライドガラスにセットします(図2A-C)。蒸留した40°Cの水の表面に切片を置き、伸ばしてスライドガラスで持ち上げます。又はスライドガラスを40°Cの加熱プレートに置き、スライドに取り付ける場所を蒸留水の滴で覆うようにします。このドロップの上に鉗子でセクションを置き、伸ばすのを待ちます。ペーパータオルで蒸留水を吸い取り、スライドを軽くたたいて余分な水分を取り除きます。注:スライドのラベルに近すぎる位置に組織切片を配置すると、染色が最適ではなくなります(図2D、E)。サンプルごとに6〜10枚のスライドガラスを取り付けて、さまざまなマルチプレックスIHCパネルを実行し、バックアップを取る傾向があります。 取り付けられたスライドガラスを56°Cで1時間、または37°Cで一晩乾燥させます。 実験には取り付けられたスライドガラスを使用するか、4°Cの箱に保管してください。注:これまでの経験では、これらのマウントされたスライドは、マルチプレックスIHC染色が行われる前に何年も保存することができます。 2. ヘマトキシリンおよびエオシン染色スライドの作製 注:セクション2の次の手順はすべて、ドラフト内で実行する必要があります。 スライドをキシレンで脱パラフィンします(2 x 5分)。 エタノールで再水和します(99.6%1 x 5分、95%1 x 5分、70%1 x 2分)。あるいは、スライドを99.6%エタノールに3回浸します。 スライドを蒸留水で洗います(2分)。 核をヘマトキシリンで染色します(10分)。 スライドを蒸留H2Oで洗浄します(5分)。 スライドをエオシンで染色します(5分)。 99.6%エタノールに3倍浸してスライドを脱水します。 スライドをキシレンに2回浸します。 封入用剤を数滴加え、カバースリップで密封します。 スライドを固め、すべての化学物質が蒸発したらスライドをヒュームフードから取り出します。 3. オートステイナーでのモノプレックスIHCとマルチプレックスIHCの実行 染色するサンプルの数に応じて、必要な試薬の量を計算します。注:1回のランで、オートステイナーの容量は30枚のスライドで、6つの抗体でマルチプレックスIHCプロトコルを完了するには~18時間かかります。より多くのスライドを染色する必要がある場合は、(作業)週の毎晩、複数のバッチを入れることができます。4泊30枚のスライド=週に120枚のスライド。週の初めに必要なすべての試薬を準備します。オートステイナーシステムは、スライドごとに150 μLの試薬を分注します。抗体試薬とオパール試薬には6 mL滴定容器を、ブロッキング試薬と二次抗体-西洋ワサビペルオキシダーゼには30 mL容器を使用します。注:6mL容器には便利なインサートが付いており、簡単に取り出して必要に応じて交換できます。試薬の計算では、30 mL容器または6 mL滴定容器でそれぞれ1.6 mLまたは300 μLのデッドボリュームを考慮する必要があります。 すべてのオパール蛍光色素とジゴキシゲニン(DIG)を付属の希釈液で1:100希釈します。Opal780を抗体希釈液で1:25に希釈します。すべての一次抗体を抗体希釈液で希釈し、 Supplemental File 1で指定されている希釈液で希釈します。 このプロトコルに従うには、実際のマルチプレックスIHC実験を開始する前に、扁桃腺制御組織と他の(腫瘍)組織タイプの両方を含むスライドでモノプレックスIHC(補足ファイル2)を実行し、すべての試薬が適切に準備されていることを確認してください。注:モノプレックスIHCは~3.5時間かかり、その日の終わりまでに信号パターンと強度を確認できます。特定のシグナルが弱すぎる場合(図3)、試薬を調整することができます。 自家蛍光補正のためには、血液やコラーゲンなどの自己蛍光構造を含む(腫瘍)組織を含むスライドを調製します。このスライドは、Monoplex IHCスライドと同時に調製しますが、ブロッキング試薬を抗体とOpal試薬に置き換えて調製します(補足ファイル3)。注:原則として、このようなスライドは、自家蛍光補正が最適でなくなるまで、マルチスペクトルイメージングに再利用できます。ただし、脳や肝臓などの自己蛍光性の高い組織では、その組織を自家蛍光補正に使用することをお勧めします。 マルチプレックスIHCの各ランで、1つのコントロール組織スライドを使用して29個のサンプルをオートステイナーシステムにロードし、各マルチプレックスIHCランの性能を確認します。 マルチプレックスIHCプロトコルは、オートステイナーのウェブサイトの[ ダウンロード ]タブからダウンロードし、カスタマイズされた各マルチプレックスIHCパネル36に合うように調整する。マルチプレックスIHCについては、プロトコルの 補足ファイル4 を参照し、カスタマイズされたマルチプレックスIHCパネルについては、 補足ファイル1を参照してください。 染色プロトコルが完了したら、スライドをオートステイナーから取り出し、洗浄バッファーの入った容器に入れます。 サンプルがすでに非常に低濃度で染色されているため、オートステイナーシステムがDAPIで汚染されるのを防ぐために、スライドをカバースリップで覆う前に手動でDAPIを適用してください。洗浄バッファー1 mLあたり2滴のDAPIを添加し、暗所で室温で5分間インキュベートします。注:スペクトルライブラリを構築するには、サンプルにDAPIが染色されていないことが重要です。洗浄バッファー1 mLあたり1滴のDAPIと、RTでの10分間のインキュベーションも可能です。 スライドをウォッシュバッファーで3回洗浄します。 スライドをペーパータオルの上に置き、余分なウォッシュバッファーをスライドから軽くたたきます。 数滴の封入剤をティッシュにピペットで移します。 封入剤の上にガラスカバースリップをそっと置き、気泡を避けるためにスライドを斜めに覆います。 鉗子または清潔なピペットチップでガラスカバースリップを優しく押して、余分な封入媒体と気泡を取り除きます。 封入剤が固まるまで、スライドを~24時間放置し、顕微鏡スライドボード上で水平に固めるか、顕微鏡に直接ロードしてイメージングします。 封入剤が固まった後、またはスライドがイメージングされた後、スライドを4°Cの顕微鏡ボックスに保管します。 4. デジタルパソロジーイメージャを用いたイメージングとスキャンファイルのアノテーション マシンの右側にある電源ボタンを押して、イメージャーの電源を入れます。少なくとも 20 秒後、ソフトウェアを起動します。メモ: ハードウェアが正しく起動するまで 20 秒待ちます。 スライドを4枚ごとにカセットにセットします。オプション: テンプレートをダウンロードできる .csv ファイルにスライドを入力します (補足ファイル 5)。.csvファイルをプログラムにロードするには、C:\ Users \ Public \ Akoya \ VectraPolaris \ Statesに保存します。注意: 最大20個のカセットまたは80枚のスライドを同時にロードできます。 リファレンス設定メインメニューから [Check Dashboard ]を開きます。注意: リファレンススライド付きのカセットはメーカーから提供されており、オプションでスロット20に恒久的に保持できます。 製造元の指示に従って、付属のスライドに明視野基準を週に一度設定します(数分かかります)。 製造元の指示に従って、付属のスライドに蛍光基準を月に1回設定します(1時間以上かかります)。 プロトコールの作成または調整メインメニューに戻り、[ プロトコルの編集 ]をクリックしてプロトコルを作成します。 [新規…] をクリックし、[イメージングモード] として [蛍光]、[マルチスペクトル スライド スキャン]、および [染色] オプションで [Opal Polaris 5, 6, 7 色] を選択します。 プロトコル名(Protocol Name)でプロトコルに名前を付け、Available Studies(利用可能なスタディ)からスタディを選択してスタディに保存します。または、Create New Study |調査名。 [ Create Protocol] を選択して終了します。 このタイプのスキャンでは、左側のウィンドウの マルチスペクトルスライドスキャン設定のみを使用します。右側の マルチスペクトルフィールド設定のウィンドウは無視してください。 スライドをさまざまな倍率でスキャンします。このプロトコルに従うには、 ピクセル解像度 を 0.50μm(20倍)のままにして、20倍の倍率でスキャンします。 「スキャン露出」を選択して、露出時間を設定します。 スライドが保持されているカセットをロードするには、[ Load Carrier ]オプションで正しいスロットを選択します。 スライド内を移動するには、「Take Overview」を選択して、キャリアがロードされた後にスライドを含むキャリアの概要画像を取得します。これを自動的にオンまたはオフにするには、右上の歯車アイコンをクリックし、[設定…]に移動し、[ナビゲーション概要画像]の下のオプションをオンまたはオフにして、[インタラクティブタスクの読み込み時に自動的に画像キャリア]を有効にします。 対応するモノプレックスIHC染色スライドのフィルターごとに露光時間を設定するには、[ Set Scan Exposures ]を選択し、正の信号を持つさまざまなスポットを見つけます。手動でピントを合わせるか、 オートフォーカス を使用して、その信号に対応するフィルターに切り替えた後に オートエクスポージャー を選択します。露出オーバーを防ぐために最も低い露出時間を選択し、すべての露出時間を設定した後で参照用に各スライドのスナップショットを撮ります(図3)。注: このタイプのスキャンでは、[ フィールド露出の設定] オプションは無視してください。 マルチプレックス染色スライドの露光時間を設定するには、信号が正のいくつかの場所にあるすべてのフィルターを確認します。最低自動露出時間を10%短縮して露出過多を防ぎ、すべての露出時間が設定された後にいくつかのスナップショットを撮ります。 自家蛍光補正のために未染色スライドのスナップショットを撮影するには、 Sample AFフィルター を使用してナビゲートします(図3H)。注:赤血球とコラーゲン構造を持つ場所は興味深いものです。Opal480フィルターの露光時間は、強い自己蛍光領域のために短縮する必要があるかもしれません。Opal480の信号が十分に強い場合でも、独自のサンプルAFフィルターが実装されているため、自己蛍光構造から十分に分離する必要があります(セクション6を参照)。 ソフトウェアを使用して染色とイメージングの品質を評価します(セクション5および6を参照。 図4、 補足ファイル6:補足図S1、補足図S2)。 「保存…」ボタンを選択して、プロトコルとその調整された露出時間がプロトコルに保存されていることを確認します。注:プロトコルがすでに保存されている場合、これまでのところ、ソフトウェアによって未保存の調整に関する追加の通知は提供されません。 スライドの自動スキャンメインメニューに戻り、[ スライドのスキャン] をクリックしてスライドをスキャンします。 スライド名/ID と対応するタスクとプロトコルを [Configure Tasks] に手動で入力するか、以前に作成した .csv ファイルから [Load Setup] で自動的に入力します。 [スキャン] をクリックしてスキャンを開始します。 スキャン設定を保存するためのウィンドウがポップアップするのを待ちます。「 保存 」をクリックしてデフォルト設定を使用し、スキャンを開始します。注:この方法を使用したスキャンには、スライドごとに10~20分かかります。スライドの数にもよりますが、スキャンには最大で丸一日かかる場合があります。 エラーメッセージを探して、すべてのスライドでスライドのスキャンが成功したかどうかを確認します。スキャンが成功したかどうかを確認するには、スキャンされた アコヤ全体のスライドスキャンファイル (.qptiff)とスキャンされた組織全体を保存します。 5. スライドビューアによるデータのアノテーション メインメニューに戻り、[ フェノチャートの起動 ]をクリックしてスライドビューアを開きます。 スキャン ファイルが直接表示されない場合は、まず右上隅の 歯車アイコンをクリックして 場所を指定し、[ ブラウザの場所の変更] に移動して、目的のデータセットの .qptiff ファイルの 1 つをランダムに選択します。注:データはデフォルトでD:\ Data \ VectraPolarisに保存されます。 スライドをロードするには、スライドを選択して右上隅の「 ロード 」をクリックするか、スライドをダブルクリックします。 右上隅の [ログイン ]ボタンをクリックしてログインします。注:ユーザー名はイニシャルまたは名前のみにすることができ、誰がどの注釈を付けたかを追跡するために使用されます。 アンミキシングを実行するには、上部の[ アンミキシング ]ボタンをクリックし、[ オパール+AF ]オプションを選択します。注:これは、Opal 480チャンネルの近くの自家蛍光シグナルの一部を取り除くのに役立ちますが、すべてではありません。 データをバッチ処理するためのアルゴリズムを生成するには、inForm Projects 1 x 1画像用(画像サイズ:928 μm x 696 μm)オプションを使用したスタンプを使用して、代表的な画像を選択します。注:腫瘍、間質、背景、およびさまざまな種類の免疫細胞を含むいくつかの代表的なスタンプがデータセット全体で選択され、最終的に20〜30枚の画像が得られます。 組織内で何を分析する必要があるかに応じて、 ROI オプションを使用して関心領域を選択し、 inForm Batchを選択します。腫瘍から離れすぎている画像や背景にある画像など、分析する必要のない画像を手動で削除します。注:腫瘍全体の周囲にROIを描画し、腫瘍領域から1つの追加の画像を選択して、~0.5mmのIMを分析できるようにする傾向があります。描画されたROIが比較的小さい場合、ROIは2〜9個のマージされた20x画像で構成されます。これは私たちにとって好ましくないので、これを回避するために、目的の組織(inForm Batch用に選択)を手動でスタンプします。 注釈付けが終了したら、注釈を自動的に保存し、次のスライドを読み込みます。 注釈付けプロセス中に、スライドが正しくスキャンされているかどうかを確認します。.qptiffファイルが見つからない場合、またはスライドが正常にスキャンされない場合は、スライドに組織が存在するかどうかを確認し、70%エタノールでスライドをクリーニングして、再度スキャンします。 組織が完全にスキャンされていないため、潜在的に重要な(腫瘍)領域が欠落している場合、または重要な領域のスキャンが焦点が合っていない場合は、スライドを70%エタノールで洗浄し、再度スキャンします。注意: どちらの場合も、カバーガラスの上部にあるマーカーで組織を囲むと、システムが組織を見つけてスキャンを再試行するのに役立ちます(補足ファイル6:補足図S3)。私たちの手の中では、細い赤いマーカーが太い黒いマーカーよりもうまく機能しました。 すべてのサンプルのスキャンと注釈付けが完了したら、データを別のコンピューターまたは外部ディスクに保存してバックアップします。 6. スペクトルアンミキシング inForm自動画像解析ソフトウェアを開きます。 画像をソフトウェアにロードします ファイル |画像を開く; .qptiff ファイルを選択します。ステップ5.6で inForm Projects とマークされたスタンプをプロジェクトにロードします。 自家蛍光補正用に画像化された .qptiff ファイルを読み込みます。 自家蛍光を補正するには、 画像上の自家蛍光選択 ツールを使用して、赤血球やコラーゲンなどの自家蛍光であるさまざまなタイプの構造を通る未染色のスライドから画像上に線を引きます。 [ Edit Markers and Colors… ] セクションで、Opal fluorophore に対応するマーカー名を割り当て、色を好みのものに調整します。 蛍光色素の混合を解除するには、左下隅にある「 すべて準備 」を選択します。 画像を調べて、すべての信号が画像に表示されているかどうか、およびアンミキシングがうまくいったかどうかを確認します。 目玉のアイコン を選択して、すべてのマーカーを1つずつオフにしてからオンにして、品質を確認します。 オプションで、組織セグメンテーション、細胞セグメンテーション、表現型解析のアルゴリズムを学習させます。 「エクスポート」タブに移動し、「エクスポートディレクトリ」の下にある「参照…」ボタンをクリックして、新しい空のエクスポートディレクトリを作成します。 [エクスポートする画像]で、[合成画像]と[コンポーネント画像(マルチ画像TIFF)]を選択します。 [ファイル] |保存する |[投影] を使用して、アルゴリズムを特定の場所に保存します。 スライドのバッチ処理のために、左側の垂直な [バッチ分析 ]タブに移動します。 [エクスポート オプション] で [アイテムごとに個別のディレクトリを作成する] を選択します。 分析用のスライドを追加するには、[スライドの追加] ボタンの下にある .qptiff ファイルを選択し、バッチ分析にロードします。 「実行」を選択して、スライドのバッチ処理を開始します。 7. ROIの描画 セクション 6 のコンポーネント ファイルのみを含むフォルダを作成しますが、階層フォルダ構造はそのままにします (コンポーネント ファイルは sample/slide という名前のフォルダにあります)。 QuPathホールスライドビューアソフトウェアを開きます。 左側の[ プロジェクトの作成 ]をクリックし、適切な名前で新しい空のフォルダーを選択/作成します。 [自動化] をクリックし、[スクリプト エディターの表示] を選択します。 補足ファイル 7 にあるスクリプトをコピーして貼り付けます。34 行目で、すべてのコンポーネント ファイルを含むスライド フォルダー (手順 7.1 で作成したフォルダー) の場所に変更します。 スライドのバッチステッチが終了したら(翌日以降) 実行して戻る を選択して続行します。 生成された.ome.tifファイルをQuPathプロジェクトにドラッグし、プロジェクトとして保存します。 新しいウィンドウが自動的にポップアップしたら、[ 画像の種類を設定] |Fluorescence をクリックし 、[Import] をクリックします。 左側のメニューで、サンプルのリストを確認します。いずれかをダブルクリックしてサンプルを開きます(図5A)。 チャンネルの強度を調整して見やすくするには、 コントラストアイコンをクリックします。 すべてのチャンネルを選択し、「 リセット」をクリックします。 自家蛍光をオフに切り替えます。 腫瘍のROIの描画を開始するには、 コントラストアイコンをクリックして [ グレースケールを表示]を選択します。腫瘍マーカーチャネルを選択し、強度を調整して最適に見えるようにします(図5B)。 ブラシツールをクリックして、腫瘍のROIを大まかに描画します。 ワンドツールを選択しながら、Altキーを押しながらROIの外側をクリックすると、ROIが外側から滑らかになります(図5C)。 同じROIで分離された腫瘍片をマージします。 ROI に適切な名前を付けます (tumor など) 左側のリストで注釈を右クリックします。 [プロパティの設定] を選択し 、名前を入力します。 IM の ROI を作成するには、次を選択して腫瘍領域から既存の ROI を拡張し ます。注釈… |注釈を展開します。 拡張半径のサイズを選択し、[ 内部の削除 ] と [ 親に制約] を選択します (図 5D)。 コントラストアイコンをクリックし、自家蛍光チャンネルを選択し、強度を調整して最適に見えるようにします。 ワンドをクリックし、Altキーを押しながらROIを調整して、ROIを外側から滑らかにし、このROIの一部にならない背景を削除します。 ROI に適切な名前を付けます (侵 襲的マージン や IM など) 。その中には、左側の一覧で注釈を右クリックし、 [プロパティの設定] を選択して名前を入力し、必要に応じて色を緑色に変更します。 注釈を保存します: ファイル |オブジェクトのエクスポート |すべてのオブジェクトをエクスポートし、デフォルトの選択で [FeatureCollection としてエクスポート] で [OK] をクリックし、任意の場所に保存します。 8. 免疫細胞の検出 ImmuNetは、学習と推論の両方にコンポーネントデータ(マルチチャネルTIFFファイル)を使用するため、アノテーションを学習セットと検証セットに分割します。モデルをトレーニングするには、リポジトリの Readme ファイルに記載されている手順に従い、サンプル データセットと注釈を目的のデータに置き換えます。異なる免疫細胞とは別に、関心のある細胞として認識されるべきではない部位(腫瘍細胞、他の細胞、または「細胞なし」(関心のある細胞と混同される可能性のある構造)に 背景 注釈を付けることにより、モデルに否定的な例を提供します。詳細については、ImmuNetの出版物を参照してください32。 検証アノテーションを使用して、パフォーマンスが十分であることを確認します。アノテーションタイプごとのエラー率(モデルが検出しなかった検証アノテーションの割合)を見てみて、最もわかりやすい評価指標です。誤検出に関するパフォーマンスを評価するには、完全に注釈が付けられたROIをいくつか作成し、Fスコアを計算します。 定量的な評価だけでなく、予測を目視で検証することで、モデルがどのような誤差を生じやすいのかを定性的に把握します(図6、補足ファイル6:補足図S4、補足図S5)。モデルのパフォーマンスが不十分であると判断された場合は、リポジトリに記載されているように一部のタイルの予測を視覚化し、最もエラーが発生しやすいサイトを確認します。そのようなサイトでより多くの注釈を作成し、モデルのトレーニングと評価を再実行します。 目標のパフォーマンスが達成されたら、リポジトリの Readme の 「データセット全体の推論 」セクションで説明されているように、データセット全体に対して推論を実行します。モデル予測を含む取得した.csvファイルをデータ分析の入力として使用します(そのためにPythonまたはRスクリプトを記述します)。 9. 予測表現型とデータ分析 注:このセクションでは、ImmuNet(セクション8)で同定された免疫細胞の位置とQuPath(セクション7)で示されたROI(セクション7)を組み合わせたリンパ球パネルで染色した単一のメラノーマサンプルの簡単なデータ解析の例を示します。解析は R 4.1.1 で実行されています (スクリプトは 補足ファイル 8 として提供されています)。このスクリプトには、パッケージ plyr 1.8.8、dplyr 1.0.8、tidyr 1.2.0、sf 1.0-7、ggplot2 3.4.0、RANN 2.6.1、および RColorBrewer 1.1-2 が必要です。これらは install.packages() コマンドでインストールできます。入力として、ImmuNetのサンプル予測を含む.csvファイルと、QuPathからエクスポートされたROIを含むファイルを取ります。手順 9.1 から 9.6 では、指定されたスクリプトで実行される 1 つのサンプルの分析について説明し、セクション 9.7 から 9.9 では、複数のサンプルの分析のオプションについて説明します。 ImmuNet の予測を R に読み込んだ後、表現型を定義するマーカーを相互にプロットし、母集団を最適に分離するしきい値を選択することにより、予測マーカー発現のしきい値を決定します。注:特定のサンプルに使用されたゲーティング戦略を 図7Bに示します。骨髄系および樹状細胞パネルのゲーティング戦略は、 補足ファイル6:補足図S6および補足図S7に示されています。 閾値を決定したら、それらを使用して、各ImmuNet予測にパネルで定義された表現型を割り当てます。一部の予測では、予測されたマーカーのいずれも閾値を上回っていないか、閾値化後に発現すると考えられるマーカーの組み合わせに一貫性がない可能性があることを観察します(例:リンパ球パネルにおけるCD3+ CD20+ 予測)。ステップ 8.3 で良好なモデル性能が達成された場合、そのような予測の割合は小さくなります。分析の前にそれらを除外します。 QuPathで描画された腫瘍とその浸潤性マージンの最大100μmのROIを個別に分析するには、対応するGeoJSONファイルをRにロードし、各予測について、予測が当てはまるROIを決定します。 健全性チェックのため、および探索的データ分析の一部として、サンプル中に見つかった免疫細胞を、対応するROIとROIの境界で別々に視覚化します(図7A)。 次に、ROIごとに異なる免疫細胞の密度を個別に計算します。特定のサンプルで見つかった密度を 表1に示します。 複数のサンプルが利用可能な場合は、細胞密度の分布を可視化します。密度値を対数変換して、正規分布の値を実現します。注:特定の表現型のカウントが0の場合、これらはLog変換できず、欠損値につながります。この問題を解決するために、ラプラシアン平滑化を適用するには、まずすべてのセル数に0.5を加算してから、表面積で除算します。 密度値を分析し、選択したソフトウェアを使用してプロットします(図8)。 セルの位置が保持されているため、空間解析が可能になります。例えば、検出された免疫細胞ごとに最近傍細胞を見つけ、次に表現型ごとに、異なる表現型が最近傍として発生するケースの割合を計算します。注:このサンプルで見つかったナチュラルキラー(NK)細胞の数は非常に少なかったため、この分析から除外しました。腫瘍とIM ROIについて得られた結果を 図9に示します。