전기적으로 자극된 평판 장착 망막의 칼슘 이미징

모든 동물 시술은 표준 동물 윤리 지침(유럽 공동체 지침 86/609/EU)에 따라 수행되었으며 지역 동물 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 본 연구에는 생후 8주 된 Long Evans 쥐가 사용되었습니다. 동물은 상업적 출처에서 얻었다( 자료표 참조). 1. 미디어 및 플랫 마운팅 어셈블리 준비 에임스 미디엄 (1 L)1L 유리병에 Ames’ Medium 분말, 1.9g/L NaHCO3, 페니실린/스트렙토마이신 100x 10ml, 탈이온수 1L를 섞습니다( 재료 표 참조). 탈이온수 또는 NaHCO280을 사용하여 pH를 7.4로 조정하고 삼투압을 3mOsm으로 조정합니다. 후드 아래의 0.2μm 기공 크기 필터를 통해 용액을 여과하여 멸균합니다.알림: 멸균된 배지는 4°C에서 보관하십시오. 이 용액은 안정적으로 유지되며 최대 1개월 동안 사용할 수 있습니다. 마운팅 멤브레인작은 접착제 방울을 사용하여 하나의 PTFE 다공성 멤브레인( 재료 표 참조)을 와셔에 부착합니다. 최소 15분 동안 건조시킵니다. 반투명도를 얻으려면 멤브레인을 70% 에탄올에 1분 동안 담그십시오. 탈이온수로 멤브레인을 두 번 헹구어 에탄올을 완전히 제거합니다. 불투명을 방지하기 위해 탈이온수에 보관하십시오. 2. GCL 라벨링 및 쥐 망막 플랫 마운팅 참고: 이 표지 방법은 망막 신경절 세포를 변위된 무축삭 세포와 구별하지 않습니다. 망막 신경절 세포의 선택적 표지가 필요한 경우, 망막 신경절 특이적 프로모터(11)와 함께 AAV를 사용하거나 시신경(12)을 통한 역행성 표지를 사용하는 것을 고려한다. ON- 및 OFF-center 망막 신경절 세포의 등급을 구별하기 위해, 광 반응에 기초하여 망막 신경절 세포를 분류하고13,14, 향상된 감도와 단일 활동 전위를 측정할 수 있는 능력을 제공하는 새로운 버전의 유전자 인코딩 칼슘 표지자를 활용한다15. 유리체강내 주사8주 된 Long Evans 쥐를 페달 반사가 없을 때까지 2% 이소플루란/1%O2 로 마취하고 쥐 코 마스크로 마취를 유지합니다( 재료 표 참조).알림: 마취 중에는 체온을 유지하기 위해 동물을 가열 패드 위에 올려 놓으십시오. 동공을 확장시키기 위해 시중에서 판매되는 점안액( 재료 표 참조)을 한 방울 떨어뜨립니다. 수술을 진행하기 전에 안저경 검사와 생체 내 망막 영상 시스템과 함께 광간섭 단층 촬영(OCT)을 사용하여 눈에 이상이 있는지 검사합니다. 각막-객관적인 접촉을 촉진하기 위해 Methocel 2%를 한 방울 떨어뜨립니다( 재료 표 참조).알림: 이상이 감지되면 해당 눈에 대한 후속 단계를 진행하지 마십시오. 국소 마취제로 Prescaine 한 방울을 바릅니다. 시중에서 판매되는 봉합사 필라멘트로 눈꺼풀과 윤부 결막을 고정합니다( 재료 표 참조). 30G 바늘을 사용하여 변두리에서 4mm 떨어진 1mm 경화술을 만듭니다.36G의 뭉툭한 바늘을 정밀 주사기에 부착하고 유전적으로 암호화된 칼슘 지시약을 운반하는 AAV 입자를 45° 각도로 30초 동안 유리체에 주입합니다. 이 연구에서는 AAV2-CAG-GCaMP5G(HBSS에서 7.5 x 1011 GC/mL)를 사용했습니다( 자료표 참조).참고: 잠재적으로 종양 유발 유전자 산물 또는 독소 분자를 암호화하지 않고 도우미 바이러스 없이 생산되는 AAV 구조체는 생물안전 레벨 1(BSL-1) 시설에서 취급할 수 있습니다. 그렇지 않고 BSL-2 격리 하에서 생물학적 유해 물질로 간주되는 경우 적절한 예방 조치를 취해야 합니다16. GCaMP에 대한 AAV 인코딩은 BSL-1로 간주되며 생물 안전 작업대에서 조작할 필요가 없습니다. 염증을 예방하고 항생제 예방을 위해 Tobradex 한 방울( 재료 표 참조)을 바르십시오. 원하는 경우 다른 쪽 눈으로 2, 3, 4단계를 반복합니다.알림: 수술 후 12-24시간 후에 동물을 검사하여 부작용이 없는지 확인하십시오. 주사 3일 후, 안저경 검사와 생체 내 망막 영상 시스템으로 OCT를 사용하여 망막 구조를 검사합니다( 자료표 참조). 주입 후 2주가 지나면 GCL에서 형광이 방출됩니다. in vivo 망막 이미징 시스템을 사용하여 형광 안저경으로 망막 구조 및 AAV 발현을 평가합니다.참고: Weitz et al.12에 따르면 AAV2-CAG-GCaMP5G의 형광은 주사 후 1주에 눈에 띄게 되고 2주까지 강화됩니다. 넷째 주부터 GCaMP의 과발현은 세포이환율을 유발합니다. 죽어가는 세포는 핵과 세포질에서 자극에 반응하여 변동하지 않는 높은 기준선 형광 신호를 나타냅니다. 건강한 세포에서 GCaMP 발현은 세포질에 국한되고핵 7,8,12,17,18에서 제외됩니다. 이러한 특징은 현미경 이미징 중에 생체 외에서 관찰할 수 있습니다. 유전자 발현의 창은 바이러스 벡터와 선택된 프로모터에 따라 달라질 수 있습니다. 망막 절제 및 평면 장착참고: 주사 후 2-3주 후, 유리체강내 주사를 맞은 쥐는 표준 윤리 지침(유럽 공동체 지침 86/609/EU)에 따라 전기생리학 프로토콜이 시작되기 직전에 안락사되고 지역 윤리 위원회의 승인을 받습니다. 이산화탄소(CO2) 흡입은 이 프로토콜에서 안락사 방법으로 사용됩니다.눈 적출구부러진 집게를 사용하여 안와(國広)의 바깥쪽을 부드럽게 눌러 안와(相度)에서 눈을 약간 돌출시킵니다. 스프링 가위를 사용하여 눈을 잡고 있는 근육을 자르고 안구를 뚫지 않도록 주의하면서 적출합니다.알림: 이 단계부터 시작하여 산소가 공급된(95%O2 / 5%CO2) Ames’ Medium에서 실체 현미경으로 망막을 해부합니다. 망막 절제한 쌍의 작은 구부러진 집게와 가는 스프링 가위를 사용하여 안구에서 주변 조직을 모두 제거합니다. 약 3cm x 3cm 여과지 조각을 3.5cm 접시 뚜껑에 놓습니다. Ames’ Medium에 종이를 담그십시오. 안구를 종이 위에 놓고 앞쪽 부분이 작업자를 향하도록 합니다. 한 쌍의 직선 집게를 사용하여 안구를 잡고 접시 표면에서 약 45° 각도로 ora serrata 위에 놓습니다. 직선 집게 사이의 공간을 참조로 사용하여 칼날로 작게 자릅니다. 안구를 에임스의 영매에 상환하십시오. 한 쌍의 직선 집게와 가는 스프링 가위를 사용하여 눈의 앞쪽과 뒤쪽 부분을 분리합니다. 두 쌍의 직선 집게를 사용하여 렌즈를 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 공막에서 망막을 분리합니다. 망막이 아이컵에서 분리될 때까지 가는 스프링 가위를 사용하여 공막을 시신경 쪽으로 자릅니다. 형광 실체 현미경을 사용하여 칼슘 지표 발현이 가장 좋은 망막 영역을 식별합니다.참고: 바이러스 확산 정도는 유리체강내 주사의 성공 여부에 따라 다릅니다. 망막의 많은 부분에 걸쳐 형광을 얻으려면 연습이 필요할 수 있습니다. 연구자의 경험은 최적의 결과를 얻는 데 중요한 역할을 합니다. 절단 팁 플라스틱 피펫을 사용하여 망막의 선택한 부분을 장착 멤브레인으로 옮깁니다(장착 멤브레인 단계). 한 쌍의 직선 집게를 사용하여 GCL이 위를 향하도록 망막을 평평하게 장착합니다. 100μL 피펫 팁에 부착된 플라스틱 피펫을 사용하여 매체를 제거하여 망막 조각이 다공성 멤브레인에 부착되도록 합니다. GCL이 전극 위에 놓이도록 어셈블리를 MEA로 뒤집습니다. 산소가 함유된 Ames’ Medium으로 샘플 수조를 채웁니다. 3. 전기 자극에 대한 생체 외 칼슘 이미징 참고: 이 작업에서는 개념 증명 MEA가 생체 외 실험에 사용되었습니다. 맞춤형 MEA는 Ti/Au 트레이스가 있는 500μm 두께의 붕규산 유리에 25μm 직경의 다공성 그래핀 기반 전극으로 제작되었으며 나중에 질화규소 및 SU-8 포토레지스트12로 절연되었습니다. 그러나 칼슘 이미징 방법은 자극에 사용되는 전극 재료에 관계없이 유효합니다. 산소가 공급된 Ames’ 배지가 33°C에서 5mL/분의 일정한 유속으로 시료 항온을 지속적으로 관류하도록 관류 시스템을 설정합니다. 형광 램프, FITC 필터 큐브 및 CMOS 카메라가 장착된 도립 형광 현미경을 사용하여 GCaMP 발현 세포의 자극 전극과 형광을 볼 수 있는 영역이 있는지 망막을 검사합니다. 이 연구에는 20x NA 0.75 공기 대물렌즈가 사용되었습니다.알림: 전극으로 세포를 효과적으로 자극(및 기록)하려면 망막과 전극이 밀접하게 접촉해야 합니다. 따라서 세포는 전극과 동일한 초점면에 눈에 띄게 있습니다. 그렇지 않은 경우 8단계부터 망막 절제 단계를 반복합니다. 건강한 동물 모델(기능하는 광수용체가 있음)의 망막을 사용하는 경우 형광등을 켤 때마다 망막이 GCaMP 센서를 여기시키는 데 사용되는 파장에 빛에 민감하기 때문에 빛에 의해 생성된 일부 유발 반응이 있습니다. 이러한 빛에 의한 칼슘 변화는 조직의 건강 상태를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 빛과 전기적 반응이 혼합되는 것을 방지하려면 이미지 획득을 시작하기 최소 1분 전에 형광등을 켜십시오. GCL에서 전기적 유발 응답을 이끌어내려면 전류 제어 펄스를 보낼 전극을 선택하십시오. 펄스 발생기 장치의 소프트웨어에서 모양, 진폭, 지속 시간, 위상 지연 및 적용할 펄스의 주파수와 같은 전기 자극 매개변수를 설정합니다.참고: 효과적인 자극 파라미터는 펄스 폭이 50μs에서 100ms까지 다양할 수 있으며 진폭은 0.1μA에서 10μA입니다. 자극 주파수, 자극 극성, 펄스 수 및 계면 지연과 함께 이러한 매개변수는 칼슘 이미징 19,20,21,22에 의해 관찰되는 시공간 반응에 영향을 미칠 수 있습니다. 1ms, 2μA 자극을 전달하는 40개의 바이페이직 펄스 트레인은 종종 라벨링된 뉴런에서 가시적인 반응을 생성합니다. 이미지 획득을 자극 전달과 동기화하려면 펄스 발생기를 외부 트리거로 사용하여 이미지 획득 시작을 제어합니다. 출력 트리거 신호를 사용하여 카메라( 재료 표 참조)를 펄스 발생기에 연결하고 카메라 소프트웨어의 “캡처 모드”를 “외부 시작 트리거”로 설정합니다. 카메라 소프트웨어에서 시작을 눌러 외부 트리거가 시작될 때까지 기다립니다. 펄스 발생기 소프트웨어로 이미지 수집을 시작합니다.알림: 외부 트리거 컨트롤은 카메라마다 다르게 설정될 수 있습니다. 이 연구는 일반적으로 1분 동안 초당 10프레임으로 이미지(512 x 512픽셀, 16비트 그레이스케일)를 획득하면서 10초마다 바이페이직 펄스 트레인 버스트를 제공했습니다. 펄스 전달은 10초 후에 시작되므로 모든 실험의 첫 번째 프레임은 자발적인 활동에 해당합니다. GCaMP 센서와 수행할 분석에 따라 칼슘 표시기8의 상승 및 감소 시간에 따라 기록 속도를 조정해야 할 수도 있습니다. 칼슘 지시약15의 단일 활동 전위를 검출하기 위한 민감도를 고려한다. [전극 번호]_[펄스 진폭]_[펄스 지속 시간]_[펄스 주파수]_Image001와 같이 적용된 전기 자극 파라미터가 포함된 파일 이름으로 이미지를 저장합니다. 4. 데이터 분석 ImageJ/FIJI를 사용하여 시간 경과에 따른 형광 강도 프로파일과 세포 소마에서 공간 좌표를 추출합니다.”영역 선택 도구”를 사용하여 관심 영역(ROI)을 분할하고 ROI 관리자(분석 > 도구 > ROI 관리자 > 추가)에 추가합니다. ROI Manager 메뉴에서 .zip 폴더로 저장합니다(저장을 > 자세히 보기).참고: 일반적으로 동일한 FOV에 해당하기 때문에 모든 자극 실험에 동일한 ROI를 적용할 수 있습니다. 추출할 매개변수로 “평균 회색 값”을 선택합니다(분석 > 측정값 설정). More > Multi Measure를 클릭하여 세포 somas에서 “Mean gray value”를 추출합니다. 대화 상자가 나타납니다. Measure all 600 slices(600개 슬라이스 모두 측정) 및 One row per slice(슬라이스당 한 행) 옵션을 활성화하여 열이 ROI에 해당하고 행이 시간 프레임에 해당하는 단일 테이블을 얻습니다. 생성된 테이블을 .xls 스프레드시트로 저장합니다. 추출할 매개변수로 “Centroid”를 선택합니다(Analyze > Set measurements). 측정을 클릭하여 ROI에서 “Centroid”를 추출합니다. 생성된 테이블은 ROI의 좌표 (X,Y)에 대응됩니다. .xls 스프레드시트로 저장합니다. 자극에 반응하는 세포를 식별하기 위한 맞춤형 스크립트참고: 여기서는 MATLAB( 재료 목차 참조)을 사용했지만 설명된 단계는 모든 프로그래밍 언어에서 수행할 수 있습니다. 사용자는 교신 작성자에게 요청하여 맞춤형 스크립트를 얻을 수 있습니다.광표백 효과 보정: 배경 및 광표백 효과를 완화하려면 각 버스트 전에 자극이 없는 기간에서 15-20프레임을 가져와 선형 곡선[fit(poly1)]에 맞춥니다.참고: 이 경우 10초마다 주기적인 펄스 트레인 버스트가 전송되는 총 600프레임 동영상의 경우 프레임 1:90, 170:190, 270:290, 370:390, 470:490, 570:590은 자극이 없는 기간으로 간주되었습니다. 공식을 사용하여 정규화: (X-min) / (max-min) 반응 세포 식별정규화된 데이터에서 비자극 주기의 평균 제곱근(RMS)을 계산합니다. 이것은 기준 신호로 간주됩니다. 자극 기간의 최대값(자극하지 않는 기간 사이의 프레임)을 계산합니다. 이 경우 10초마다 주기적인 펄스 트레인 버스트가 전송되는 총 600프레임 동영상의 경우 프레임 91:169, 191:269, 291:369, 391:469, 491:569가 자극 주기로 고려되었습니다. 특정 ROI에 대해 최대값이 기준 신호를 2.5배 초과하는 경우, 해당 자극 기간에 반응하는 세포에 태그를 지정합니다. 세포가 5개의 자극 기간 중 3개에 반응하면 반응 세포로 분류합니다.