Analisi della funzione mitocondriale in un mutante PINK1B9-null di Drosophila melanogaster utilizzando la respirometria ad alta risoluzione
Summary
Qui presentiamo un protocollo di respirometria ad alta risoluzione per analizzare la bioenergetica nei moscerini della frutta mutanti PINK1B9-null. Il metodo utilizza il protocollo SUIT (Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration).
Abstract
Le malattie neurodegenerative, tra cui il morbo di Parkinson (PD), e i disturbi cellulari come il cancro sono alcuni dei disturbi che interrompono il metabolismo energetico con compromissione delle funzioni mitocondriali. I mitocondri sono organelli che controllano sia il metabolismo energetico che i processi cellulari coinvolti nella sopravvivenza e nella morte cellulare. Per questo motivo, gli approcci per valutare la funzione mitocondriale possono offrire importanti informazioni sulle condizioni cellulari nei processi patologici e fisiologici. A questo proposito, i protocolli di respirometria ad alta risoluzione (HRR) consentono di valutare l’intera funzione della catena respiratoria mitocondriale o l’attività di specifici complessi mitocondriali. Inoltre, lo studio della fisiologia mitocondriale e della bioenergetica richiede modelli trattabili geneticamente e sperimentalmente come la Drosophila melanogaster.
Questo modello presenta diversi vantaggi, come la sua somiglianza con la fisiologia umana, il suo rapido ciclo di vita, la facilità di manutenzione, l’economicità, l’elevata capacità di produzione e un numero ridotto di preoccupazioni etiche. Questi attributi lo rendono uno strumento inestimabile per sezionare processi cellulari complessi. Il presente lavoro spiega come analizzare la funzione mitocondriale utilizzando il mutante Drosophila melanogaster PINK1B9-null. Il gene pink1 è responsabile della codifica della chinasi putativa 1 indotta da PTEN, attraverso un processo riconosciuto come mitofagia, che è cruciale per la rimozione dei mitocondri disfunzionali dalla rete mitocondriale. Le mutazioni di questo gene sono state associate a una forma familiare autosomica recessiva ad esordio precoce di Parkinson. Questo modello può essere utilizzato per studiare la disfunzione mitocondriale coinvolta nella fisiopatologia del Parkinson.
Introduction
I mitocondri sono organelli cellulari che controllano importanti funzioni, tra cui la regolazione apoptotica, l’omeostasi del calcio e la partecipazione a percorsi biosintetici. Possedendo materiale genetico autonomo, sono in grado di contribuire ai processi di mantenimento e riparazione cellulare. La loro struttura ospita la catena di trasporto degli elettroni e la fosforilazione ossidativa, entrambe cruciali per l’energia cellulare 1,2,3. In particolare, il controllo dell’energia è ottenuto attraverso la produzione di adenosina trifosfato (ATP) tramite fosforilazione ossidativa (OXPHOS)2. L’interruzione del metabolismo energetico con compromissione delle funzioni mitocondriali si verifica sia nella sopravvivenza che nella morte cellulare 4,5, frequentemente associata a un’ampia gamma di patologie umane, come il cancro, e malattie neurodegenerative come il morbo di Parkinson (PD)3,6.
La malattia di Parkinson è una malattia cronica, progressiva e neurologica. La causa principale di questa malattia è la morte delle cellule cerebrali, in particolare nella substantia nigra, che sono responsabili della produzione del neurotrasmettitore dopamina, che controlla il movimento 6,7,8. La prima osservazione che collegava il parkinsonismo alla disfunzione mitocondriale è stata fatta nel 1988, in modelli sperimentali che utilizzavano tossine che inibiscono la catena respiratoria Complesso I9.
Attualmente, esistono diversi metodi per valutare la disfunzione mitocondriale 10,11,12,1 3; tuttavia, rispetto agli approcci convenzionali, la respirometria ad alta risoluzione (HRR) presenta sensibilità e vantaggi superiori 13,14. Ad esempio, i protocolli HRR consentono di valutare la funzione dell’intera catena respiratoria mitocondriale o l’attività di specifici complessi mitocondriali14,15. Le disfunzioni mitocondriali possono essere valutate in cellule intatte, mitocondri isolati o anche ex vivo 10,11,13,14.
Le disfunzioni mitocondriali sono strettamente associate a molti processi patologici e fisiologici. È quindi importante studiare la fisiologia mitocondriale e la bioenergetica utilizzando sistemi modello trattabili geneticamente e sperimentalmente. A questo proposito, la ricerca sulla Drosophila melanogaster, il moscerino della frutta, presenta diversi vantaggi. Questo modello condivide caratteristiche e processi cellulari fondamentali con gli esseri umani, tra cui l’uso del DNA come materiale genetico, organelli comuni e percorsi molecolari conservati coinvolti nello sviluppo, nell’immunità e nella segnalazione cellulare. Inoltre, i moscerini della frutta hanno un ciclo di vita rapido, una facile manutenzione, un basso costo, un’elevata produttività e meno problemi etici, costituendo così uno strumento prezioso per sezionare processi cellulari complessi 16,17,18,19,20.
Inoltre, un omologo del gene putativo chinasi 1 (pink1) indotto da PTEN è espresso in D. melanogaster. Svolge un ruolo cruciale nella rimozione dei mitocondri danneggiati attraverso il processo di mitofagia8. Nell’uomo, le mutazioni in questo gene predispongono gli individui a una forma familiare autosomica recessiva di PD associata a disfunzione mitocondriale 8,21,22,23. Di conseguenza, il moscerino della frutta è un potente modello animale per gli studi sulla fisiopatologia della malattia di Parkinson e lo screening di candidati farmaci incentrati sulla disfunzione mitocondriale e sulla bioenergetica. Pertanto, il presente lavoro spiega come analizzare la funzione mitocondriale in un modello di PD da D. melanogaster utilizzando la tecnica HRR in OROBOROS con il protocollo Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration (SUIT).
Protocol
Representative Results
Discussion
L’HRR è una potente tecnica per studiare la respirazione mitocondriale e il metabolismo energetico in D. melanogaster e in altri organismi. Fornisce una valutazione dettagliata e quantitativa della funzione mitocondriale, consentendo ai ricercatori di ottenere informazioni sulla bioenergetica delle cellule. Il protocollo qui presentato descrive la valutazione della funzione della catena respiratoria mitocondriale e l’attività di specifici complessi mitocondriali utilizzando il protocollo SUIT in D. melanog…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano l’agenzia brasiliana Coordenação de Aperfeiçoamento de Pesquisa Pessoal de Nível Superior (CAPES EPIDEMIAS 09 #88887.505377/2020). P.M. (#88887.512821/2020-00) e T.D. (#88887.512883/2020-00) sono beneficiari di assegni di ricerca.
Materials
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | Adenosine 5′-diphosphate sodium sal (CAS number 72696-48-1); ≥95%; molecular weight = 501.31 g/mol. |
| Ágar | Kasv | K25-1800 | For bacteriologal use |
| Antimycin-A | Sigma-Aldrich | A8674 | Antimycin A from Streptomyces sp. (CAS number 1397-94-0); molecular weight 540 g/mol; |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | Bovine Serum Albumin (CAS number 9048-46-8); pH 7,0 ≥ 98% |
| Datlab software | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20700 | Software for data acquisition and analysis |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D 5628 | CAS number 11024-24-1 |
| Distilled water | |||
| Drosophila melanogaster strain w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 | Obtained from Bloomington Drosophila stock center | ||
| Drosophila melanogaster strain w1118 | Obtained from the Federal University of Santa Maria | ||
| EGTA | Sigma-Aldrich | E8145 | Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (CAS number 13638-13-3); ≥97%; molecular weight =468.28 g/mol |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920 | Carbonyl cyanide 4- (trifluoromethoxy)phenylhydrazone (CAS number 370-86-5); ≥98% (TLC), powder |
| GraphPad Prism version 8.0.1. | Software for data acquisition and analysis | ||
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034 | 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (CAS number 7365-45-9); ≥99,5% (titration), cell cultured tested; molecular weight = 238.30 g/mol |
| High-resolution respirometer Oxygraph O2K | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 10022-02 | Startup O2K respirometer kit |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | Monopotassium phosphate (CAS number 7778-77-0); Reagente Plus, molecular weigt = 136.09 g/mol |
| KOH | Sigma-Aldrich | 211473 | Potassium hydroxide (CAS number 1310-58-3); ACS reagent, ≥85%, pellets |
| Malate | Sigma-Aldrich | M1296 | Malonic acid (CAS number 141-82-2); 99%, molecular weight = 104.06 g/mol). A solution is pH adjusted to approximately 7.0. |
| Malic acid | Sigma-Aldrich | M1000 | (S)-(−)-2-Hydroxysuccinic acid (CAS number 97-67-6); ≥95% ; molecular weight = 134.09 g/mol |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (CAS number 4432-31-9); ≥99% (titration); molecular weight = 195.24 g/mol |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Magnesium chloride (CAS number 7786-30-3); anhydrous, ≥98%, molecular weight = 95.21 g/mol |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | ||
| O2K-Titration Set | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20820-03 | Hamilton syringes with different volumes |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O 4876 | Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes (CAS number 1404-19-9); ≥90% total oligomycins basis (HPLC) |
| Pistil to homogenization | |||
| Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | L-Proline (CAS number 147-85-3); powder; 99%; molecular weight = 115.13 g/mol |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Sodium pyruvate (CAS number 113-24-6), ≥99%; molecular weight = 110.04 g/mol |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Rotetone (CAS number 83-79-4); ≥95%, molecular weight 394.42 g/ mol |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S 2378 | Sodium succinate dibasic hexahydrate (CAS number 6106-21-4); ≥99% |
| Sucrose | Merck | 107,651,000 | Sucrose for microbiology use (CAS number 57-50-1) |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | CAS number 107-35-7 |
References
- Brand, M. D., Orr, A. L., Perevoshchikova, I. V., Quinlan, C. L. The role mitochondrial function and cellular bioenergetics in ageing and disease. Br J Dermatol. 169, 1-8 (2013).
- Ramaccini, D., et al. Mitochondrial function and dysfunction in dilated cardiomyopathy. Front Cell Dev Biol. 8, 624216 (2021).
- Zhunina, O. A., et al. The role of mitochondrial dysfunction in vascular disease, tumorigenesis, and diabetes. Front Mol Biosci. 8, 671908 (2021).
- Prasun, P. Mitochondrial dysfunction in metabolic syndrome. Biochim Biophys Acta. 1866 (10), 165838 (2020).
- Bhatti, J. S., Bhatti, G. K., Reddy, P. H. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in metabolic disorders – A Step towards mitochondria based therapeutic strategies. Biochim Biophys Acta. 1863 (5), 1066-1077 (2017).
- Perier, C., Vila, M. Mitochondrial biology and Parkinson’s disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (2), 009332 (2012).
- DeMaagd, G., Philip, A. Parkinson’s disease and its management. Pharmacy and Therapeutics. 40 (8), 504-532 (2015).
- Miyazaki, N., et al. PINK1-dependent and Parkin-independent mitophagy is involved in reprogramming of glycometabolism in pancreatic cancer cells. Biochem Biophys Res Commun. 625, 167-173 (2022).
- Kopin, I. J., Markey, S. P. MPTP toxicity: implications for research in Parkinson’s disease. Annual Review of Neuroscience. 11, 81-96 (1988).
- Connolly, N. M. C., et al. Guidelines on experimental methods to assess mitochondrial dysfunction in cellular models of neurodegenerative diseases. Cell Death Differ. 25 (3), 542-572 (2018).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435, 297-312 (2011).
- Haynes, C. M., Fiorese, C. J., Lin, Y. -. F. Evaluating and responding to mitochondrial dysfunction: The UPRmt and beyond. Trends Cell Mol Biol. 23 (7), 311-318 (2013).
- Long, Q., Huang, L., Huang, K., Yang, Q. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from mouse heart tissues using oroboros 2k-oxygraph. Methods Mol Biol. 1966, 237-246 (2019).
- Scheiber, D., et al. High-resolution respirometry in human endomyocardial biopsies shows reduced ventricular oxidative capacity related to heart failure. Exp Mol Med. 51 (2), 1-10 (2019).
- Krumschnabel, G., Eigentler, A., Fasching, M., Gnaiger, E. Chapter nine – use of safranin for the assessment of mitochondrial membrane potential by high-resolution respirometry and fluorometry. Methods Enzymol. 542, 163-181 (2014).
- Demir, E. The potential use of Drosophila as an in vivo model organism for COVID-19-related research: a review. Turk J Biol. 45 (4), 559-569 (2021).
- Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: a primer on the Drosophila model system. 유전학. 201 (3), 815-842 (2015).
- McBride, S. M. J., Holloway, S. L., Jongens, T. A. Using Drosophila as a tool to identify pharmacological therapies for fragile X syndrome. Drug Discov Today Technol Technologies. 10 (1), e129-e136 (2013).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods (San Diego, Calif). 68 (1), 105-115 (2014).
- Bar, S., Prasad, M., Datta, R. Neuromuscular degeneration and locomotor deficit in a Drosophila model of mucopolysaccharidosis VII is attenuated by treatment with resveratrol). Dis Model Mech. 11 (11), (2018).
- Imai, Y. PINK1-Parkin signaling in Parkinson’s disease: Lessons from Drosophila. Neurosci Res. 159, 40-46 (2020).
- Julienne, H., Buhl, E., Leslie, D. S., Hodge, J. J. L. Drosophila PINK1 and parkin loss-of-function mutants display a range of non-motor Parkinson’s disease phenotypes. Neurobiol Dis. 104, 15-23 (2017).
- Biswas, S., Bagchi, A. Analysis of the structural dynamics of the mutations in the kinase domain of PINK1 protein associated with Parkinson’s disease. Gene. 857, 147183 (2023).
- Koh, H., Chung, J. PINK1 and Parkin to control mitochondria remodeling. Anat Cell Biol. 43 (3), 179-184 (2010).
- Zhu, M., Li, X., Tian, X., Wu, C. Mask loss-of-function rescues mitochondrial impairment and muscle degeneration of Drosophila pink1 and parkin mutants. Hum Mol Genet. 24 (11), 3272-3285 (2015).
- Park, J., et al. Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin. Nature. 441 (7097), 1157-1161 (2006).
- Dytham, C. . Choosing and using statistics: a biologist’s guide. , (2011).
- Bonora, M., et al. ATP synthesis and storage. Purinergic Signal. 8 (3), 343-357 (2012).
- Gonçalves, D. F., et al. Caffeine improves mitochondrial function in PINK1B9-null mutant Drosophila melanogaster. J Bioenerg Biomembr. 55 (1), 1-13 (2023).
- Gonçalves, D. F., et al. Mitochondrial function and cellular energy maintenance during aging in a Drosophila melanogaster model of Parkinson disease. Mitochondrion. 65, 166-175 (2022).
- Janowska, J. I., et al. Mitochondrial respiratory chain complex I dysfunction induced by N-methyl carbamate ex vivo can be alleviated with a cell-permeable succinate prodrug. Toxicol In Vitro. 65, 104794 (2020).
- Ngo, D. T. M., et al. Oxidative modifications of mitochondrial complex II are associated with insulin resistance of visceral fat in obesity. Physiol Endocrinol Metab. 316 (2), E168-E177 (2019).
- Stroud, D. A., et al. Accessory subunits are integral for assembly and function of human mitochondrial complex I. Nature. 538 (7623), 123-126 (2016).
- Senyilmaz, D., et al. Regulation of mitochondrial morphology and function by stearoylation of TFR1. Nature. 525 (7567), 124-128 (2015).
- Poddighe, S., et al. Mucuna pruriens (Velvet bean) rescues motor, olfactory, mitochondrial and synaptic impairment in PINK1B9 Drosophila melanogaster genetic model of Parkinson’s disease. PloS One. 9 (10), e110802 (2014).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 810, 25-58 (2012).
- Winer, L. S. P., Wu, M. Rapid analysis of glycolytic and oxidative substrate flux of cancer cells in a microplate. PloS One. 9 (10), e109916 (2014).
- Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio Protoc. 8 (10), e2850 (2018).
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. Am J Physiol. Cell Physiol. 292 (1), C125-C136 (2007).
- Divakaruni, A. S., Jastroch, M. A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements. Nat Metab. 4 (8), 978-994 (2022).
- Bingol, B., Sheng, M. Mechanisms of mitophagy: PINK1, Parkin, USP30 and beyond. Free Radic Biol Med. 100, 210-222 (2016).
