Células estromales mesenquimales derivadas del tejido adiposo cocultivadas con glía mixta primaria para reducir la inflamación inducida por priones
Summary
Las células estromales mesenquimales derivadas del tejido adiposo (AdMSC) tienen potentes propiedades inmunomoduladoras útiles para tratar enfermedades asociadas con la inflamación. Demostramos cómo aislar y cultivar AdMSCs murinas y glía mixta primaria, estimular AdMSCs para que regulen al alza los genes antiinflamatorios y los factores de crecimiento, evaluar la migración de AdMSCs y co-cultivar AdMSCs con glia primaria infectada con priones mixtos.
Abstract
Las células estromales mesenquimales (MSC) son potentes reguladores de la inflamación a través de la producción de citocinas antiinflamatorias, quimiocinas y factores de crecimiento. Estas células muestran la capacidad de regular la neuroinflamación en el contexto de enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad priónica y otros trastornos del plegamiento incorrecto de proteínas. Las enfermedades priónicas pueden ser esporádicas, adquiridas o genéticas; Pueden ser el resultado del mal plegamiento y la agregación de la proteína priónica en el cerebro. Estas enfermedades son invariablemente mortales, sin tratamientos disponibles.
Uno de los primeros signos de la enfermedad es la activación de los astrocitos y la microglía y la inflamación asociada, que se produce antes de la agregación de priones detectable y la pérdida neuronal; por lo tanto, las propiedades antiinflamatorias y reguladoras de las MSC se pueden aprovechar para tratar la astrogliosis en la enfermedad priónica. Recientemente, demostramos que las MSC derivadas del tejido adiposo (AdMSC) cocultivadas con células BV2 o glía mixta primaria reducen la inflamación inducida por priones a través de la señalización paracrina. En este artículo se describe un tratamiento fiable que utiliza AdMSCs estimuladas para disminuir la inflamación inducida por priones.
Una población heterocigota de AdMSCs puede aislarse fácilmente del tejido adiposo murino y expandirse en cultivo. La estimulación de estas células con citoquinas inflamatorias mejora su capacidad para migrar hacia el homogeneizado del cerebro infectado por priones y producir moduladores antiinflamatorios en respuesta. Juntas, estas técnicas se pueden utilizar para investigar el potencial terapéutico de las MSC en la infección por priones y se pueden adaptar para otras enfermedades neuroinflamatorias y de plegamiento incorrecto de proteínas.
Introduction
La inflamación glial desempeña un papel clave en una variedad de enfermedades neurodegenerativas, como el Parkinson, el Alzheimer y la enfermedad priónica. Aunque la agregación anormal de proteínas se atribuye a gran parte de la patogénesis de la enfermedad y la neurodegeneración, las células gliales también desempeñan un papel en la exacerbación de esta 1,2,3. Por lo tanto, dirigirse a la inflamación inducida por la glía es un enfoque terapéutico prometedor. En la enfermedad priónica, la proteína priónica celular (PrPC) se pliega mal a la proteína priónica asociada a la enfermedad (PrPSc), que forma oligómeros y agregados e interrumpe la homeostasis en el cerebro 4,5,6.
Uno de los primeros signos de la enfermedad priónica es una respuesta inflamatoria de los astrocitos y la microglía. Los estudios que suprimen esta respuesta, ya sea por eliminación de la microglía o modificación de los astrocitos, generalmente no han mostrado mejoría o empeoramiento de la patogénesis de la enfermedad en modelos animales 7,8,9. Modular la inflamación glial sin eliminarla es una alternativa intrigante como terapéutica.
Las células estromales mesenquimales (MSC) han tomado la delantera como tratamiento para una variedad de enfermedades inflamatorias, debido a su capacidad para modular la inflamación de manera paracrina 10,11. Han demostrado la capacidad de migrar a los sitios de inflamación y responder a las moléculas de señalización en estos entornos mediante la secreción de moléculas antiinflamatorias, factores de crecimiento, microARN y más 10,12,13. Hemos demostrado previamente que las MSC derivadas del tejido adiposo (denominadas AdMSCs) son capaces de migrar hacia el homogeneizado cerebral infectado por priones y responder a este homogeneizado cerebral mediante la regulación positiva de la expresión génica para citocinas antiinflamatorias y factores de crecimiento.
Además, las AdMSC pueden disminuir la expresión de genes asociados con el factor nuclear-kappa B (NF-κB), la señalización del inflamasoma que contiene el dominio de pirina de la familia de receptores tipo Nod 3 (NLRP3) y la activación glial, tanto en la microglía BV2 como en la glía mixta primaria 14. Aquí, proporcionamos protocolos sobre cómo aislar tanto las AdMSC como la glía mixta primaria de ratones, estimular las AdMSC para que regulen al alza los genes moduladores, evaluar la migración de AdMSC y cocultivar AdMSC con glía infectada con priones. Esperamos que estos procedimientos puedan proporcionar una base para una mayor investigación del papel de las MSC en la regulación de la inflamación inducida por la glía en enfermedades neurodegenerativas y otras enfermedades.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí demostramos un protocolo fiable y relativamente barato para evaluar los efectos de las células estromales mesenquimales derivadas del tejido adiposo (AdMSCs) en la disminución de la inflamación inducida por priones en un modelo de células gliales. Las AdMSC se pueden aislar y expandir fácilmente en cultivo para su uso en tan solo 1 semana. Este protocolo produce consistentemente una población heteróloga de células que expresan marcadores consistentes con los de las células estromales mesenquimales por inmu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Lab Animal Resources por su cría de animales. Nuestras fuentes de financiación para este manuscrito incluyen el Fondo Boettcher, el Fondo Murphy Turner, la Facultad de Medicina Veterinaria de CSU y el Consejo de Investigación de la Facultad de Ciencias Biomédicas. Las figuras 2A, 2C y 3A se crearon con BioRender.com.
Materials
| 0.25% Trypsin | Cytiva | SH30042.01 | |
| 5 mL serological pipets | Celltreat | 229005B | |
| 6-well tissue culture plates | Celltreat | 229106 | |
| 10 cm cell culture dishes | Peak Serum | PS-4002 | |
| 10 ml serological pipets | Celltreat | 229210 | |
| 15 mL conical tubes | Celltreat | 667015B | |
| 50 mL conical tubes | Celltreat | 667050B | |
| BV2 microglia cell line | AcceGen Biotech | ABC-TC212S | |
| Cell lifter | Biologix Research Company | 70-2180 | |
| Crystal violet | Electron Microscopy Sciences | 12785 | |
| Dispase | Thermo Scientific | 17105041 | |
| DMEM/F12 | Caisson Labs | DFL14-500ML | |
| DNase-I | Sigma Aldrich | 11284932001 | |
| Essential amino acids | Thermo Scientific | 11130051 | |
| Ethanol (100%) | EMD Millipore | EX0276-1 | |
| Fetal bovine serum (heat inactivated) | Peak Serum | PS-FB4 | Can be purchased as heat inactivated or inactivated in the laboratory |
| Formaldehyde | EMD Millipore | 1.04003.1000 | |
| Glass 10 mL serological pipet | Corning | 7077-10N | |
| Hank’s Balances Salt Solution | Sigma Aldrich | H8264-500ML | |
| Hemocytometer/Neubauer Chamber | Daigger | HU-3100 | |
| High Glucose DMEM | Cytiva | SH30022.01 | |
| low glucose DMEM containing L-glutamine | Cytiva | SH30021.01 | |
| MEM/EBSS | Cytiva | SH30024.FS | |
| non-essential amino acids | Sigma-Aldrich | M7145-100M | |
| Paraformaldehyde (16%) | MP Biomedicals | 219998320 | |
| Penicillin/streptomycin/neomycin | Sigma-Aldrich | P4083-100ML | |
| Phosphate buffered saline | Cytiva | SH30256.01 | |
| Recombinant Mouse IFN-gamma Protein | R&D Systems | 485-MI | |
| Recombinant Mouse TNF-alpha (aa 80-235) Protein, CF | R&D Systems | 410-MT | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Sigmacote | Sigma Aldrich | SL2-100ML | Coat inside of glass pipets by aspirating up and down twice in Sigmacote and allowing to dry thoroughly. Wrap in aluminum foil and autoclave pipets 24 h later. |
| Stemxyme | Worthington Biochemical Corporation | LS004106 | Collagenase/Dispase mixture |
| Sterile, individually wrapped cotton swab | Puritan Medical | 25-8061WC | |
| Thincert Tissue Culture Inserts, 24 well, Pore Size=8 µm | Greiner Bio-One | 662638 | |
| Thincert Tissue Culture Inserts, 6 well, Pore Size=0.4 µm | Greiner Bio-One | 657641 |
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