Мезенхимальные стромальные клетки, полученные из жировой ткани, совместно культивируемые с первичной смешанной глией для уменьшения прион-индуцированного воспаления
Summary
Мезенхимальные стромальные клетки (AdMSCs), полученные из жировой ткани, обладают мощными иммуномодулирующими свойствами, полезными для лечения заболеваний, связанных с воспалением. Мы демонстрируем, как выделять и культивировать мышиные AdMSCs и первичную смешанную глию, стимулировать AdMSCs для повышения регуляции противовоспалительных генов и факторов роста, оценивать миграцию AdMSC и совместно культивировать AdMSCs с первичной смешанной глией, инфицированной прионами.
Abstract
Мезенхимальные стромальные клетки (МСК) являются мощными регуляторами воспаления за счет выработки противовоспалительных цитокинов, хемокинов и факторов роста. Эти клетки демонстрируют способность регулировать нейровоспаление в контексте нейродегенеративных заболеваний, таких как прионная болезнь и другие нарушения неправильного сворачивания белка. Прионные заболевания могут быть спорадическими, приобретенными или генетическими; Они могут быть результатом неправильного сворачивания и агрегации прионного белка в мозге. Эти заболевания неизменно приводят к летальному исходу, и нет доступных методов лечения.
Одним из самых ранних признаков заболевания является активация астроцитов и микроглии и связанное с этим воспаление, которое происходит до обнаруживаемой агрегации прионов и потери нейронов; таким образом, противовоспалительные и регуляторные свойства МСК могут быть использованы для лечения астроглиоза при прионной болезни. Недавно мы показали, что МСК, полученные из жировой ткани (AdMSCs), культивируемые совместно с клетками BV2 или первичной смешанной глией, уменьшают прион-индуцированное воспаление посредством паракринной сигнализации. В этой статье описывается надежное лечение с использованием стимулированных AdMSC для уменьшения воспаления, вызванного прионами.
Гетерозиготная популяция AdMSC может быть легко выделена из жировой ткани мышей и расширена в культуре. Стимуляция этих клеток воспалительными цитокинами усиливает их способность как мигрировать в гомогенат мозга, инфицированный прионами, так и производить противовоспалительные модуляторы в ответ. Вместе эти методы могут быть использованы для исследования терапевтического потенциала МСК в отношении прионной инфекции и могут быть адаптированы для других нарушений сворачивания белка и нейровоспалительных заболеваний.
Introduction
Глиальное воспаление играет ключевую роль в развитии различных нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Паркинсона, Альцгеймера и прионную болезнь. Несмотря на то, что аномальная агрегация белков в значительной степени связана с патогенезом заболевания и нейродегенерацией, глиальные клетки также играют роль в усугублении этого 1,2,3. Таким образом, нацеливание на глиально-индуцированное воспаление является многообещающим терапевтическим подходом. При прионной болезни клеточный прионный белок (PrPC) неправильно сворачивается на ассоциированный с заболеванием прионный белок (PrPSc), который образует олигомеры, агрегирует и нарушает гомеостаз в мозге 4,5,6.
Одним из самых ранних признаков прионной болезни является воспалительная реакция астроцитов и микроглии. Исследования, подавляющие этот ответ путем удаления микроглии или модификации астроцитов, в целом не показали улучшения патогенеза заболевания на животных моделях 7,8,9. Модуляция глиального воспаления без его устранения является интригующей альтернативой в качестве терапевтического средства.
Мезенхимальные стромальные клетки (МСК) стали использоваться в качестве средства для лечения различных воспалительных заболеваний благодаря своей способности модулировать воспаление паракринным образом 10,11. Они показали способность мигрировать к местам воспаления и реагировать на сигнальные молекулы в этих средах, выделяя противовоспалительные молекулы, факторы роста, микроРНК и многое другое. Ранее мы продемонстрировали, что МСК, полученные из жировой ткани (обозначенные AdMSCs), способны мигрировать в гомогенат мозга, инфицированный прионами, и реагировать на этот гомогенат мозга путем повышения экспрессии генов противовоспалительных цитокинов и факторов роста.
Кроме того, AdMSCs могут снижать экспрессию генов, ассоциированных с ядерным фактором-каппа B (NF-κB), пириновым доменом семейства Nod-подобных рецепторов, содержащим передачу сигналов инфламмасом 3 (NLRP3), и глиальной активацией как в микроглии BV2, так и в первичной смешанной глии 14. В этой статье мы предоставляем протоколы о том, как изолировать AdMSCs и первичную смешанную глию от мышей, стимулировать AdMSCs к активации модулирующих генов, оценить миграцию AdMSC и совместно культивировать AdMSCs с глией, инфицированной прионами. Мы надеемся, что эти процедуры могут стать основой для дальнейших исследований роли МСК в регуляции глиально-индуцированного воспаления при нейродегенеративных и других заболеваниях.
Protocol
Representative Results
Discussion
В данной работе мы демонстрируем надежный и относительно недорогой протокол для оценки эффектов мезенхимальных стромальных клеток (МСК), полученных из жировой ткани, в уменьшении прион-индуцированного воспаления в модели глиальных клеток. AdMSC могут быть легко выделены и расширены в ку…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Lab Animal Resources за их животноводство. Источниками финансирования этой рукописи являются Фонд Боттчера, Фонд Мерфи Тернера, Колледж ветеринарной медицины CSU и Исследовательский совет Колледжа биомедицинских наук. Рисунки 2A, 2C и 3A были созданы с помощью BioRender.com.
Materials
| 0.25% Trypsin | Cytiva | SH30042.01 | |
| 5 mL serological pipets | Celltreat | 229005B | |
| 6-well tissue culture plates | Celltreat | 229106 | |
| 10 cm cell culture dishes | Peak Serum | PS-4002 | |
| 10 ml serological pipets | Celltreat | 229210 | |
| 15 mL conical tubes | Celltreat | 667015B | |
| 50 mL conical tubes | Celltreat | 667050B | |
| BV2 microglia cell line | AcceGen Biotech | ABC-TC212S | |
| Cell lifter | Biologix Research Company | 70-2180 | |
| Crystal violet | Electron Microscopy Sciences | 12785 | |
| Dispase | Thermo Scientific | 17105041 | |
| DMEM/F12 | Caisson Labs | DFL14-500ML | |
| DNase-I | Sigma Aldrich | 11284932001 | |
| Essential amino acids | Thermo Scientific | 11130051 | |
| Ethanol (100%) | EMD Millipore | EX0276-1 | |
| Fetal bovine serum (heat inactivated) | Peak Serum | PS-FB4 | Can be purchased as heat inactivated or inactivated in the laboratory |
| Formaldehyde | EMD Millipore | 1.04003.1000 | |
| Glass 10 mL serological pipet | Corning | 7077-10N | |
| Hank’s Balances Salt Solution | Sigma Aldrich | H8264-500ML | |
| Hemocytometer/Neubauer Chamber | Daigger | HU-3100 | |
| High Glucose DMEM | Cytiva | SH30022.01 | |
| low glucose DMEM containing L-glutamine | Cytiva | SH30021.01 | |
| MEM/EBSS | Cytiva | SH30024.FS | |
| non-essential amino acids | Sigma-Aldrich | M7145-100M | |
| Paraformaldehyde (16%) | MP Biomedicals | 219998320 | |
| Penicillin/streptomycin/neomycin | Sigma-Aldrich | P4083-100ML | |
| Phosphate buffered saline | Cytiva | SH30256.01 | |
| Recombinant Mouse IFN-gamma Protein | R&D Systems | 485-MI | |
| Recombinant Mouse TNF-alpha (aa 80-235) Protein, CF | R&D Systems | 410-MT | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Sigmacote | Sigma Aldrich | SL2-100ML | Coat inside of glass pipets by aspirating up and down twice in Sigmacote and allowing to dry thoroughly. Wrap in aluminum foil and autoclave pipets 24 h later. |
| Stemxyme | Worthington Biochemical Corporation | LS004106 | Collagenase/Dispase mixture |
| Sterile, individually wrapped cotton swab | Puritan Medical | 25-8061WC | |
| Thincert Tissue Culture Inserts, 24 well, Pore Size=8 µm | Greiner Bio-One | 662638 | |
| Thincert Tissue Culture Inserts, 6 well, Pore Size=0.4 µm | Greiner Bio-One | 657641 |
References
- Liddelow, S. A., et al. Neurotoxic reactive astrocytes are induced by activated microglia. Nature. 541 (7638), 481-487 (2017).
- Smith, H. L., et al. Astrocyte unfolded protein response induces a specific reactivity state that causes non-cell-autonomous neuronal degeneration. Neuron. 105 (5), 855-866 (2020).
- Hong, S., et al. Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models. Science. 352 (6286), 712-716 (2016).
- Collinge, J., Clarke, A. R. A general model of prion strains and their pathogenicity. Science. 318 (5852), 930-936 (2007).
- Gajdusek, D. C. Transmissible and non-transmissible amyloidoses: autocatalytic post-translational conversion of host precursor proteins to beta-pleated sheet configurations. J Neuroimmunol. 20 (2-3), 95-110 (1988).
- Come, J. H., Fraser, P. E., Lansbury, P. T. A kinetic model for amyloid formation in the prion diseases: importance of seeding. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (13), 5959-5963 (1993).
- Hartmann, K., et al. Complement 3(+)-astrocytes are highly abundant in prion diseases, but their abolishment led to an accelerated disease course and early dysregulation of microglia. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 83 (2019).
- Carroll, J. A., Race, B., Williams, K., Striebel, J., Chesebro, B. Microglia are critical in host defense against prion disease. Journal of Virology. 92 (15), e00549 (2018).
- Bradford, B. M., McGuire, L. I., Hume, D. A., Pridans, C., Mabbott, N. A. Microglia deficiency accelerates prion disease but does not enhance prion accumulation in the brain. Glia. 70 (11), 2169-2187 (2022).
- Li, M., Chen, H., Zhu, M. Mesenchymal stem cells for regenerative medicine in central nervous system. Frontiers in Neuroscience. 16, 1068114 (2022).
- Sanchez-Castillo, A. I., et al. Switching roles: beneficial effects of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells on microglia and their implication in neurodegenerative diseases. Biomolecules. 12 (2), 219 (2022).
- Fu, X., et al. Mesenchymal stem cell migration and tissue repair. Cells. 8 (8), 784 (2019).
- Xiao, Q., et al. TNF-alpha increases bone marrow mesenchymal stem cell migration to ischemic tissues. Cell Biochemistry and Biophysics. 62 (3), 409-414 (2012).
- Hay, A. J. D., Murphy, T. J., Popichak, K. A., Zabel, M. D., Moreno, J. A. Adipose-derived mesenchymal stromal cells decrease prion-induced glial inflammation in vitro. Scientific Reports. 12 (1), 22567 (2022).
- Kirkley, K. S., Popichak, K. A., Afzali, M. F., Legare, M. E., Tjalkens, R. B. Microglia amplify inflammatory activation of astrocytes in manganese neurotoxicity. Journal of Neuroinflammation. 14 (1), 99 (2017).
- Popichak, K. A., Afzali, M. F., Kirkley, K. S., Tjalkens, R. B. Glial-neuronal signaling mechanisms underlying the neuroinflammatory effects of manganese. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 324 (2018).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Hass, R., Otte, A. Mesenchymal stem cells as all-round supporters in a normal and neoplastic microenvironment. Cell Communication and Signaling: CCS. 10 (1), 26 (2012).
- Carroll, J. A., et al. Prion strain differences in accumulation of PrPSc on neurons and glia are associated with similar expression profiles of neuroinflammatory genes: comparison of three prion strains. PLoS Pathogens. 12 (4), 1005551 (2016).
- Carroll, J. A., Race, B., Williams, K., Chesebro, B. Toll-like receptor 2 confers partial neuroprotection during prion disease. PLoS One. 13 (12), e0208559 (2018).
- Yu, Y., et al. Hypoxia and low-dose inflammatory stimulus synergistically enhance bone marrow mesenchymal stem cell migration. Cell Proliferation. 50 (1), e12309 (2017).
- Hay, A. J. D., et al. Intranasally delivered mesenchymal stromal cells decrease glial inflammation early in prion disease. Frontiers in Neuroscience. 17, 1158408 (2023).
- English, K., Barry, F. P., Field-Corbett, C. P., Mahon, B. P. IFN-gamma and TNF-alpha differentially regulate immunomodulation by murine mesenchymal stem cells. Immunology Letters. 110 (2), 91-100 (2007).
- Hemeda, H., et al. Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha differentially affect cytokine expression and migration properties of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 19 (5), 693-706 (2010).
- Carta, M., Aguzzi, A. Molecular foundations of prion strain diversity. Current Opinion in Neurobiology. 72, 22-31 (2022).
- Yu, F., et al. Phagocytic microglia and macrophages in brain injury and repair. CNS Neuroscience and Therapeutics. 28 (9), 1279-1293 (2022).
- Sinha, A., et al. Phagocytic activities of reactive microglia and astrocytes associated with prion diseases are dysregulated in opposite directions. Cells. 10 (7), 1728 (2021).
- Stansley, B., Post, J., Hensley, K. A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer’s disease. Journal of Neuroinflammation. 9, 115 (2012).
- Shan, Z., et al. Therapeutic effect of autologous compact bone-derived mesenchymal stem cell transplantation on prion disease. Journal of General Virology. 98 (10), 2615-2627 (2017).
- Johnson, T. E., et al. Monitoring immune cells trafficking fluorescent prion rods hours after intraperitoneal infection. Journal of Visualized Experiments. (45), e2349 (2010).
- Liu, F., et al. MSC-secreted TGF-beta regulates lipopolysaccharide-stimulated macrophage M2-like polarization via the Akt/FoxO1 pathway. Stem Cell Research and Therapy. 10, 345 (2019).
