في المختبر نموذج لسفينة بشرية جنينية على الرقاقة لدراسة علم الأحياء الميكانيكي التنموي
Summary
الموصوف هنا هو سير عمل بسيط لتمييز الخلايا البطانية عن الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات متبوعا ببروتوكول مفصل لتحفيزها الميكانيكي. هذا يسمح لدراسة البيولوجيا الميكانيكية التنموية للخلايا البطانية. هذا النهج متوافق مع المقايسات النهائية للخلايا الحية التي تم جمعها من رقاقة الثقافة بعد التحفيز الميكانيكي.
Abstract
القلب هو أول عضو يتم إنشاؤه وظيفيا أثناء النمو ، وبالتالي بدء الدورة الدموية في وقت مبكر جدا من الحمل. إلى جانب نقل الأكسجين والمواد المغذية لضمان نمو الجنين ، تتحكم الدورة الدموية للجنين في العديد من الأحداث التنموية الحاسمة التي تحدث داخل الطبقة البطانية من خلال الإشارات الميكانيكية. تحفز الإشارات الميكانيكية الحيوية التغييرات الهيكلية للأوعية الدموية ، وتضع مواصفات شريانية وريدية ، وتتحكم في تطور الخلايا الجذعية المكونة للدم. عدم إمكانية الوصول إلى الأنسجة النامية يحد من فهم دور الدورة الدموية في التنمية البشرية المبكرة. لذلك ، تعد النماذج في المختبر أدوات محورية لدراسة علم الأحياء الميكانيكية للأسوية. تصف هذه الورقة بروتوكولا للتمييز بين الخلايا البطانية والخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان وبذرها اللاحق في جهاز سائل لدراسة استجابتها للإشارات الميكانيكية. يسمح هذا النهج بزراعة طويلة الأجل للخلايا البطانية تحت التحفيز الميكانيكي متبوعا باسترجاع الخلايا البطانية للتوصيف الظاهري والوظيفي. سيكون النموذج في المختبر الذي تم إنشاؤه هنا مفيدا لتوضيح الآليات الجزيئية داخل الخلايا التي تحول الإشارات بوساطة الإشارات الميكانيكية ، والتي تنظم في النهاية تطور الأوعية الدموية خلال حياة الجنين البشري.
Introduction
أثناء التطور الجنيني ، يكون القلب هو أول عضو يؤسس الوظيفة1 ، مع تقلصات يمكن اكتشافها من المرحلة الأولى من تكوين أنبوب الشغاف2. تتحكم الدورة الدموية ، جنبا إلى جنب مع الإشارات الميكانيكية التي يتوسطها تدفق الدم داخل الوعاء ، في العديد من الجوانب الحاسمة للتطور المبكر. قبل إنشاء الدورة الدموية للجنين ، يتم تنظيم الأوعية الدموية في الضفيرة الشعرية الأولية. عند عمل القلب ، تعيد هذه الضفيرة تنظيمها في الأوعية الدموية الوريديةوالشريانية 3. ينعكس دور الإشارات الميكانيكية في المواصفات الشريانية الوريدية من خلال التعبير البطاني الشامل للعلامات الشريانية والوريدية قبل بدء تدفق الدم4.
لا تتحكم قوى الدورة الدموية في تطور الأوعية الدموية نفسها فحسب ، بل تلعب أيضا دورا أساسيا في التحكم في تكوين خلايا الدم. تظهر الخلايا الجذعية والسلفية المكونة للدم (HSPCs) من خلايا بطانية متخصصة تسمى البطانة الدموية5،6،7،8 ، الموجودة في مناطق تشريحية مختلفة من الأجنة حصريا في المرحلة المبكرة من التطور. أظهرت النماذج التي تعاني من نقص القلب ، جنبا إلى جنب مع النماذج في المختبر ، أن الإشارات الميكانيكية ترشد وتزيد من إنتاج HSPC من البطانة الدموية9،10،11،12،13،14.
لقد ثبت أن أنواعا مختلفة من ديناميكيات التدفق تتحكم بشكل تفاضلي في دورة الخلية 15 ، والمعروفة بأنها مهمة في كل من البطانة الدموية16،17 ومواصفات الخلايا الشريانية18. إجمالا ، تعد الإشارات الميكانيكية محددات حاسمة لهوية الخلية ووظيفتها أثناء التطور. تسمح لنا الأجهزة السائلة الجديدة في المختبر بالتغلب على القيود التي تنطوي عليها دراسة علم الأحياء الميكانيكي التنموي أثناء نمو دم الإنسان في الجسم الحي.
الهدف العام من البروتوكول في هذه المخطوطة هو وصف خط الأنابيب التجريبي خطوة بخطوة لدراسة تأثير إجهاد القص على الخلايا البطانية البشرية المشتقة في المختبر من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSCs). يحتوي هذا البروتوكول على تعليمات مفصلة حول تمايز hiPSCs إلى خلايا بطانية وبذرها اللاحق في رقائق سائلة لبروتوكول التحفيز. باستخدام هذا ، يمكن اختبار الخلايا البطانية المختلفة المشتقة من المختبر لقدرتها على استشعار إجهاد القص من خلال تحليل اتجاهها استجابة للتدفق. سيسمح ذلك للمختبرات الأخرى بمعالجة الأسئلة المتعلقة بالاستجابة لإجهاد القص وعواقبه الوظيفية على هويات الخلايا البطانية المختلفة.
Protocol
ملاحظة: يجب إجراء جميع تقنيات زراعة الخلايا في ظل ظروف معقمة في غطاء التدفق الصفحي ويجب تحضين الخلايا عند 37 درجة مئوية في جو رطب مع 5٪ CO2. تعليمات لجميع تحضير السيتوكين لكل من الصيانة (rhbFGF) وبروتوكول التمايز (rhBMP4 ، rhVEGF ، rhbFGF ، rhIL6 ، rhFLT3L ، rhIGF1 ، rhIL11 ، rhSCF ، rhEPO ، rhTPO ، rhIL3) موجودة في الجدول التكميلي S1. 1. زراعة hiPSCs – إذابة الخلايا وصيانتها وتجميدها تحضير وسط الصيانة وعوامل النمو والكواشف الأخرىقم بإعداد وسط الاستزراع عن طريق إضافة مكمل الوسط الخالي من مصل hESCs بالكامل ، و 36 مل من 25٪ من ألبومين مصل الأبقار (BSA) ، و 1 مل من 55 مللي مول من β-mercaptoethanol إلى الوسط القاعدي Modified Eagle Medium / F12 (DMEM / F-12) من Dulbecco (انظر جدول المواد). أعد تعليق 1 ملغ من مثبط رو كيناز (iRock) في 1 مل من DMSO ، وقم بعمل حصص 50 ميكرولتر ، وقم بتخزينها في -20 درجة مئوية.ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بهذه القسامات عند -20 درجة مئوية لمدة 1 سنة. بمجرد إذابتها ، يمكن الاحتفاظ بها عند 4 درجات مئوية لمدة 1 أسبوع. قم بإذابة محلول الفيترونيكتين (VTN-N) على الثلج والقسمة 60 ميكرولتر لكل قارورة قبل التخزين عند -80 درجة مئوية. قبل طلاء الألواح مباشرة ، قم بتخفيف مخزون 60 ميكرولتر في 6 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (DPBS) ؛ التركيز النهائي 5 ميكروغرام / مل. ذوبان خط الخلية hiPSCملاحظة: تم اشتقاق خط الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات SFCi55 سابقا داخليا واستخدم على نطاق واسع للتمايز إلى أنواع مختلفة من الخلايا والسلالات الجنينية المختلفة19،20،21،22.قم بتغطية بئر واحد من صفيحة ذات 6 آبار ب 1 مل من محلول VTN-N لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.ملاحظة: بعد الحضانة ، يمكن تخزين الألواح المطلية عند 4 °C لمدة تصل إلى 1 أسبوع. نضح محلول VTN-N باستخدام ماصة شفط وإضافة 1 مل من وسط الاستزراع المسخن مسبقا المكمل ب 20 نانوغرام / مل من rhbFGF (الجدول التكميلي S1). قم بإذابة القارورة التي تحتوي على hiPSCs بسرعة في حمام مائي وانقل الخلية إلى 5 مل من وسط الاستزراع المسخن مسبقا. أدر الخلايا لأسفل لمدة 3 دقائق عند 300 × جم في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق حبيبات الخلية في 0.5 مل من وسط الاستزراع المكمل ب 20 نانوغرام / مل من rhbFGF. نقل الخلايا إلى بئر واحد مطلي يحتوي بالفعل على 1 مل من الوسط. أضف 5 ميكرولتر من iRock إلى الآبار التي تحتوي على الخلايا في إجمالي 1.5 مل من الوسط. قم بزراعة الخلايا في الحاضنة ، وقم بتغيير الوسط يوميا خلال الأسبوع ، وقم بتغذية الخلايا مرتين ، مع إضافة ضعف الحجم الطبيعي للوسط إلى الخلايا لضمان التغذية خلال عطلة نهاية الأسبوع.ملاحظة: تزرع الخلايا في وجود iRock لمدة 24 ساعة فقط. صيانة وتمرير hiPSCsقم بتغيير الوسط يوميا باستخدام وسط استزراع طازج مسخن مسبقا مكمل ب 20 نانوغرام / مل من rhbFGF. مرور الخلايا عندما تصل إلى حوالي 80٪ من الالتقاء ، بشكل عام مرتين في الأسبوع.لتمرير الخلايا ، قم بتغطية لوحة ب VTN-N كما هو موضح من قبل في الخطوتين 1.2.1 و 1.2.2. نضح الوسط من الآبار بالخلايا واغسلها باستخدام DPBS. نضح DPBS وإضافة 1 مل من كاشف التفكك (انظر جدول المواد) واحتضانه لمدة دقيقة واحدة. نضح كاشف التفكك واحتضانه لمدة 3 دقائق أخرى. اضغط بقوة على اللوحة 10 مرات على كل جانب.ملاحظة: قد تحتاج خطوة التفكك إلى تحسين خاص بنوع الخلية في وقت الحضانة وإجراء التنصت. أضف 1 مل من وسط الاستزراع إلى الخلايا ومع ماصة باستور ، اغسلها مرة واحدة باستخدام الوسط لضمان جمع معظم المستعمرات. أضف 150 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل بئر لتوفير نسبة مرور من 1 بئر إلى 6.ملاحظة: مباشرة بعد إذابة قارورة جديدة ، من الأفضل تمرير الخلايا بنسبة أقل مثل 1: 1 أو 1: 2 لممر واحد أو ممرين للسماح لها بالوصول إلى مرحلة نمو ثابتة قبل المرور بنسبة 1: 6. قم بزراعة الخلايا في الحاضنة ، وقم بتغيير الوسط يوميا خلال الأسبوع ، وقم بتغذية الخلايا مرة واحدة خلال عطلة نهاية الأسبوع. تجميد خط الخلية hiPSCsملاحظة: قم بتجميد الخلايا داخل أول ممرين لها بعد الذوبان لضمان الحفاظ على دفعة مرور منخفضة ثابتة من القوارير المجمدة لبدء الثقافة. قم بتجميد الخلايا عندما تصل إلى التقاء بنسبة 80٪ تقريبا.قم بتغيير الوسط إلى وسط استزراع طازج مسخن مسبقا مكمل ب 20 نانوغرام / مل من rhbFGF و 5 ميكرولتر من iRock واحتضانه لمدة 1 ساعة على الأقل. افصل الخلايا كما هو موضح في الخطوات 1-3-2-1-3-2-5. اجمع الخلايا المنفصلة في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل يحتوي على 5 مل من وسط الاستزراع. أجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق عند 300 × غرام في درجة حرارة الغرفة. نضح المادة الطافية وأضف 1 مل من محلول الحفظ بالتبريد (انظر جدول المواد). باستخدام ماصة باستور ، قم بإمامة الخلايا برفق لأعلى ولأسفل لخلطها في محلول الحفظ بالتبريد.ملاحظة: تجنب السحب المفرط، الذي قد يؤدي إلى فصل مجموعات الخلايا. قسم معلق الخلية إلى قنينتين للحفظ بالتبريد سعة كل منهما 0.5 مل. انقل قوارير الحفظ بالتبريد إلى حاوية الحفظ بالتبريد المبردة مسبقا عند 4 درجات مئوية. انقل الحاوية مع الخلايا إلى مجمد -80 درجة مئوية لمدة 24 ساعة قبل نقل القوارير إلى النيتروجين السائل للتخزين طويل الأجل. 2. تمايز hiPSCs إلى خلايا بطانية تحضير وسط التمايز والسيتوكينات وعوامل النموتحضير وسط التمايز الخالي من المصل (SFD) وفقا للجدول 1. استخدم هذه الوسيلة من اليوم 0 إلى اليوم 5 من التمايز. تحضير وسط خال من المصل لخلايا CD34+ (SFM-34) عن طريق إضافة 34 مكملا غذائيا و 5 مل من مكمل L-glutamine إلى الوسط القاعدي 34 SFM (انظر جدول المواد). استخدم هذه الوسيلة من اليوم 6 من التمايز فصاعدا. أعد تعليق 1 ملغ من CHIR99021 في 716 ميكرولتر من DMSO للحصول على محلول 3 mM. احتضان في درجة حرارة الغرفة حتى يتم إنعاشه بالكامل ؛ إذا لزم الأمر ، قم بالإحماء بسرعة عند 37 درجة مئوية. اصنع 20 ميكرولتر من القسامات وقم بتخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر. استخدميه مباشرة بعد الذوبان ولا تجمدي مرة أخرى أو تخزن. إعادة تعليق السيتوكينات وفقا للتعليمات الواردة في الجدول التكميلي S1. قم بتخزين جميع حصص السيتوكينات عند -80 درجة مئوية. تمايز الخلايا البطانيةملاحظة: لكل يوم من أيام التمايز، قم بإعداد 18 مل (3 مل متوسط/بئر) من وسط SFD المسخن مسبقا، وفقا لخلطات السيتوكينات الموصوفة في الجدول 2.اليوم 0 – تكوين الأجسام الجنينية (EBs)تحضير 18 مل من وسط SFD مع مزيج 1 سيتوكين وفقا للجدول 2 ، لكل صفيحة 6 آبار (3 مل / بئر). أضف 2 مل من وسط SFD المسخن مسبقا مع مزيج 1 سيتوكين في كل بئر من صفيحة 6 آبار طاردة للخلايا (انظر جدول المواد). لتكوين EBs، اتبع الخطوات الموضحة في الخطوات 1.3.2.2-1.3.2.4.ملاحظة: تأكد من أن hiPSCs متقاربة بنسبة 70-80٪ لبدء التمايز. أضف 1 مل من وسط SFD المسخن مسبقا مع مزيج 1 سيتوكينات إلى كل بئر من مجموعات الخلايا المنفصلة. استخدم ماصة باستور لنقل مجموعات الخلايا برفق إلى بئر واحد من البئر الطارد للخلايا لتشكيل EB بنسبة 1: 1. بعد وضع اللوحة في الحاضنة ، حركها للأمام والخلف ، يمينا ويسارا ، لتفريق EBs بالتساوي في البئر. اليوم 1 – تغيير متوسط في EBsملاحظة: هذه الخطوة ضرورية فقط إذا كان هناك ، بحلول اليوم 1 من التمايز ، العديد من الخلايا المفردة المعلقة جنبا إلى جنب مع EBs.تحضير 18 مل من وسط SFD مع مزيج 1 سيتوكين وفقا للجدول 2 ، لكل صفيحة 6 آبار (3 مل / بئر). قم بتدوير اللوحة مع EBs لنقلها إلى المركز وجمعها باستخدام ماصة باستور في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل.ملاحظة: إذا بدت EBs مجمعة معا كما هو الحال في السلاسل ، فقم بفصلها عن طريق سحبها لأعلى ولأسفل باستخدام P1000 قبل جمعها في أنبوب الطرد المركزي سعة 15 مل. انتظر 5-10 دقائق حتى تستقر EBs في قاع الأنبوب.ملاحظة: إذا كانت EBs صغيرة جدا ، فقم بطردها لمدة 5 دقائق عند 100 × جم لمساعدتها على الاستقرار. اغسل الألواح الطاردة للخلايا بالماء المعقم أو DPBS لإزالة أي خلايا مفردة أو حطام. استنشاق بعناية وببطء من EBs دون إزاحتها. أضف 2 مل من SFD مع مزيج 1 سيتوكينات إلى كل بئر من الألواح الطاردة للخلايا. أعد تعليق EBs باستخدام 1 مل من وسط SFD مع مزيج 1 سيتوكينات لكل بئر بدء – بالنسبة للوحة 6 آبار ، أضف 6 مل من الوسط. انقل EBs إلى الألواح الطاردة للخلايا بحجم 1 مل لكل بئر ، والذي يحتوي بالفعل على 2 مل من وسط SFD. بعد وضع اللوحة في الحاضنة ، حركها للأمام والخلف ، يمينا ويسارا ، لتفريق EBs بالتساوي في البئر. اليوم 2 – إضافة CHIR99021قم بتدوير EBs في وسط اللوحة وإضافة CHIR99021 وفقا للجدول 2 على جانب البئر لتجنب الاتصال المباشر بالخلايا.ملاحظة: إذا لم يتم تغيير الوسيط في اليوم 1 ، فاستبدل الوسيط بالكامل بدلا من إضافة CHIR وحده. تحضير 18 مل من وسط SFD مع المزيج 2 وفقا للجدول 2 ، لكل لوحة 6 آبار (3 مل / بئر). بعد وضع اللوحة في الحاضنة ، حركها للأمام والخلف ، يمينا ويسارا ، لتفريق EBs بالتساوي في البئر. اليوم 3 – تغيير متوسط في EBs وإضافة السيتوكينات Mix 3تحضير 18 مل من وسط SFD مع خلط 3 سيتوكينات وفقا للجدول 2 ، لكل لوحة 6 آبار (3 مل / بئر). جمع المعارف المكتسبة كما هو موضح في الخطوات 2.2.2.2-2.2.2.4. أضف 2 مل مسخن مسبقا من وسط SFD مع مزيج 3 سيتوكينات إلى الألواح الطاردة للخلايا. استنشاق بعناية طاف من EBs. أضف 1 مل / بئر من SFD مع مزيج 3 سيتوكينات. توزيع EBs بين الآبار كما هو موضح في الخطوات 2.2.2.8-2.2.2.9. اليوم 6 – تغيير متوسط ل SFM-34 وإضافة السيتوكينات Mix 4تحضير 18 مل من وسط SFD مع مزيج 4 سيتوكينات وفقا للجدول 2 ، لكل صفيحة 6 آبار (3 مل / بئر). جمع المعارف المكتسبة كما هو موضح في الخطوات 2.2.2.2-2.2.2.4. أضف 2 مل من وسط SFM-34 المسخن مسبقا مع مزيج 4 سيتوكينات إلى الألواح الطاردة للخلايا. استنشاق بعناية طاف من EBs. أضف 1 مل / بئر من SFM-34 مع مزيج 4 سيتوكينات. توزيع EBs بين الآبار كما هو موضح في الخطوات 2.2.2.8-2.2.2.9. 3. عزل خلايا CD34 + والبذر في الشريحة ملاحظة: يتم عزل خلايا CD34 + من خلال نهج عزل إيجابي باستخدام مجموعة ميكروبيدات CD34 (انظر جدول المواد) ، والتي تحتوي على ميكروبيدات CD34 مترافقة مع الأجسام المضادة للفأر وحيدة النسيلة الأجسام المضادة CD34 المضادة للإنسان وكاشف FcR Blocking (Human IgG). من المهم التحقق من كفاءة عزل العمود عن طريق تلطيخ الخلايا قبل وبعد العزل لتحليل قياس التدفق الخلوي ، يشار أدناه إلى متى يجب أخذ الخلايا لهذا التحليل. تحضير المواد والكواشف.قم بإعداد المخزن المؤقت للغسيل بإضافة 5 مل من محلول BSA بنسبة 5٪ و 200 ميكرولتر من EDTA 0.5 متر إلى 45 مل من DPBS للحصول على PBS + 0.5٪ BSA + 2 mM EDTA. قم بالتحضير الطازج لكل عزل ، وقم بتعقيمه بالفلتر ، واحفظه في الثلاجة حتى الاستخدام. قم بتغطية رقائق السوائل بمحلول اللامينين المحضر عن طريق تخفيف rhLaminin 521 1:50 في DPBS Ca 2+ Mg2+. قم بتغطية كل شريحة بالحجم المناسب للشريحة المستخدمة واحتضانها في الحاضنة لمدة 2 ساعة قبل البذر.ملاحظة: يمكن استخدام مصفوفات أخرى للطلاء ويجب اختبارها لنوع / تجربة الخلية المحددة. قم بإعداد وسط Mix 4 SFM-34 عن طريق استكمال 18 مل من وسط SFM-34 مع مزيج 4 من السيتوكينات وفقا للجدول 2 وضع الخليط في أنبوب سعة 50 مل في الحاضنة مع فك الغطاء قليلا لتسهيل تبادل الغازات. ضع مجموعات التروية المحددة وأي أنابيب أخرى لاستخدامها في الحاضنة لإزالة الغاز. اليوم 8 – تفكك EBs وعزل CD34 +جمع المعارف المكتسبة كما هو موضح في الخطوات 2.2.2.2-2.2.2.5. أضف 1 مل من كاشف تفكك الخلايا لكل بئر بداية من EBs التي تم جمعها (إذا تم جمع 6 آبار ، أضف 6 مل). انقل 1 مل من معلق EB في كاشف تفكك الخلية إلى كل بئر من لوحة طارد الخلايا. احتضان لمدة 10 دقائق في الحاضنة. ماصة بلطف EBs صعودا وهبوطا على البئر مع P1000 ، لا يزيد عن 10 مرات. كرر الخطوات من 3.2.4 إلى 3.2.5 لما مجموعه 3x.ملاحظة: إذا كان من الصعب فصل EBs ، كرر الخطوات المذكورة أعلاه 4x إجمالا. أضف 5 مل من المخزن المؤقت للغسيل لكل بئر من EBs المنفصلة. اجمع الخلايا في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل عن طريق تمريرها عبر مصفاة 40 ميكرومتر. خذ 10 ميكرولتر من تعليق الخلية لحساب الخلايا.ملاحظة: لاختبار كفاءة العزل ، انقل 105 خلايا / أنبوب إلى أنبوبين مختلفين (التحكم غير الملوث وعينة الاختبار الملطخة) التي سيتم استخدامها لاحقا لقياس التدفق الخلوي (كما هو موضح في الخطوات 4.3.9-4.3.13). بالنسبة للوحة 6 آبار ، يجب جمع ~ 106 خلايا بعد الترشيح. قم بتدوير الخلايا لأسفل لمدة 10 دقائق عند 300 × جم. أعد تعليق الخلايا في 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل ، وقم بسحب الإصبع برفق عدة مرات للتأكد من عدم وجود كتل. استمر في اتباع بروتوكول الشركة المصنعة (انظر جدول المواد). بذر خلية CD34 + في رقائق سائلةملاحظة: يبلغ ارتفاع القناة للرقاقة السائلة المستخدمة في البروتوكول 0.6 مم وطولها 50 مم ، لمساحة نمو إجمالية تبلغ 2.5 سم2 (الشكل التكميلي S1). يتم زرع هذا النوع من الرقائق بحجم إجمالي لتعليق الخلية يبلغ 150 ميكرولتر. يمكن استخدام رقائق مختلفة ، ويجب تكييف حجم البذر وكثافة الخلية وفقا لمنطقة النمو. قد تكون هناك حاجة إلى تحسين إضافي اعتمادا على خط الخلية المستخدم ونموه.أعد تعليق خلايا CD34 + المعزولة في 300 ميكرولتر من وسط SFM-34 المسخن مسبقا باستخدام السيتوكينات Mix 4. خذ 10 ميكرولتر من تعليق الخلية وعد الخلايا. إعادة تعليق 2.5 × 105 خلايا في حجم نهائي قدره 150 ميكرولتر مكمل SFM-34 ؛ أضف 0.5 ميكرولتر من iRock.ملاحظة: لاختبار كفاءة العزل ، انقل 105 خلايا / أنبوب إلى أنبوب (عينة اختبار بعد الفرز) سيتم استخدامها لاحقا لقياس التدفق الخلوي (كما هو موضح في الخطوات 4.3.9-4.3.13). قم بشفط اللامينين ببطء من الرقائق السائلة عن طريق وضع طرف P200 داخل الخزان على حافة القناة.ملاحظة: إذا كان من الصعب جمع السائل ، ارفع جانبا واحدا من الشريحة ببطء لمساعدة السائل على الانتقال إلى الخزان المقابل. أضف تعليق الخلية بثبات في القناة للتأكد من عدم تكوين فقاعات.ملاحظة: قم بتنفيذ الخطوات 3.3.4-3.3.5 بسرعة ولكن برفق لتجنب جفاف الصفيحة وتشكيل فقاعات في قنوات الشريحة. إذا تم تشكيل الفقاعات ، ارفع جانبا واحدا من الشريحة واضغط برفق على الشريحة لتعبئة الفقاعات ؛ عندما يصلون إلى الخزان ، سوف يرتفعون إلى الواجهة الهوائية ويجب ألا يكونوا قادرين على إعادة تشغيل القناة. انقل الشريحة إلى الحاضنة واتركها طوال الليل حتى يتم ربط الخلايا بالكامل بالقناة وتبدو ممدودة. عندما تكون الخلايا متصلة بالكامل ، قم بشفط الوسط كما في الخطوة 3.3.4 واستبدله ب 200 ميكرولتر من SFM-34 المكمل بالسيتوكين. من الآن فصاعدا ، استبدل الوسط يوميا حتى تصل الخلايا إلى التقاء 90٪ -100٪. 4. تطبيق التدفق المستمر على الخلايا البطانية – الشريان الأورطي على رقاقة تحضير المواد والكواشف.قم بإعداد وسط Mix 4 SFM-34 عن طريق استكمال 18 مل من وسط SFM-34 مع مزيج 4 من السيتوكينات وفقا للجدول 2 ووضعه في أنبوب سعة 50 مل في الحاضنة مع فك الغطاء قليلا لتسهيل تبادل الغازات. ضع مجموعات التروية المحددة وأي أنبوب لاستخدامه في الإعداد السائل في الحاضنة لإزالة الغاز. تجميع نظام السوائلقم بتثبيت مجموعة التروية في الوحدة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.ملاحظة: تذكر استخدام المشابك في النظام. إذا تم استخدام المشابك المنزلقة لهذه الخطوة ، فيجب أن تنزلق على الأنبوب قبل توصيلها بالشريحة. قم بتوصيل شريحة سائلة جديدة وأضف وسط SFM-34 المكمل بالسيتوكين ، مع التأكد من ملء كلا الخزانين في ظل ظروف معقمة في الغطاء. قم بتنفيذ برنامج إزالة الفقاعة وخطوة المعايرة. قم بإزالة الوحدة السائلة مع المجموعة المتصلة من الحاضنة ونقلها إلى غطاء المحرك ؛ خذ أيضا الرقائق التي تحتوي على الخلايا من الحاضنة. ثبت الأنبوب على جانبي شريحة الاختبار. قم بإزالة الأنبوب من شريحة الاختبار.ملاحظة: تأكد من عدم وجود فقاعات في موصل Luer في نهاية الأنبوب. إذا كانت الفقاعات مرئية ، فقم باستنشاقها بعناية باستخدام ماصة P200 وإذا لزم الأمر ، أضف المزيد من الوسائط للتأكد من أن الموصل مملوء بالوسيط. قم بتوصيل الشريحة التي تحتوي على الخلايا بالأنبوب. قم بإزالة أو فتح المشابك. نقل النظام إلى الحاضنة وتوصيل مضخة الهواء بالوحدة السائلة. ابدأ البرنامج المحدد مسبقا باستخدام البرنامج المخصص للمضخة (الشكل التكميلي S2) مع الزيادة التدريجية في إجهاد القص الموصوف في الجدول 3.ملاحظة: اعتمادا على التجربة المحددة المطلوبة ، قد يحتاج برنامج التحفيز إلى التحسين. الموصوف هنا هو زيادة إجهاد القص التدريجي مما يؤدي إلى القيمة النهائية البالغة 5 dyn / cm2 ، والتي تحاكي إجهاد القص المحسوب الذي يختبره جدار الشريان الأورطي الظهري في بداية الدورة الدموية للجنين 9. بغض النظر عن إجهاد القص النهائي الذي سيتم استخدامه ، من الضروري الزيادة تدريجيا بمرور الوقت للسماح للخلايا بالتكيف مع القوة دون التسبب في انفصال الخلايا عن الشريحة. إذا كان بروتوكول التحفيز المحدد أطول من 3 أيام ، فيجب إضافة السيتوكينات إلى النظام عن طريق إضافة 1 مل من SFM-34 الذي يحتوي على سيتوكينات Mix 4 التي تضاف عادة إلى 18 مل. للقيام بذلك ، يتم إيقاف برنامج المضخة مؤقتا بسرعة ويتم إضافة 500 ميكرولتر من الوسط المكمل إلى كل من المحقنتين في المجموعة السائلة. جمع الخلايا للتحليلسخن العازلة التفكك في حمام مائي. قم بإزالة الوحدة السائلة من الحاضنة وانقلها إلى الغطاء. ثبت الأنبوب المحيط بالشريحة على كلا الجانبين وقم بإزالة الأنبوب من الخزانات الموجودة على الشريحة. قم بإزالة الوسط برفق من الشريحة واستبدله ب DPBS Ca 2+ Mg2+ لغسل الخلايا. ملاحظة: يمكن تخطي خطوة الغسيل هذه باستخدام برنامج تلفزيوني إذا بدأت الخلايا في الانفصال. أضف برفق 150 ميكرولتر من محلول التفكك واحتضانه لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية.ملاحظة: تحقق تحت المجهر إذا كانت الخلايا مفردة ومنفصلة ؛ خلاف ذلك ، احتضان لمدة 2 دقيقة إضافية. من الضروري أن يتم فصل الخلايا تماما عن القناة قبل استنشاق الوسط ، لأن الشريحة لا تسمح بالمساعدة في انفصال الخلايا عن طريق الماصة. يمكن استخدام حلول أخرى لفصل الخلايا ، مثل المخازن المؤقتة القائمة على التربسين أو EDTA. اجمع المخزن المؤقت للتفكك الذي يحتوي على الخلايا من خزان واحد وانقله إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل واغسل القناة مرة واحدة باستخدام DPBS لجمع كل الخلايا المنفصلة. أضف 1 مل من المخزن المؤقت للغسيل إلى أنبوب 15 مل مع الخلايا وخذ 10 ميكرولتر لحساب الخلايا. قسم تعليق الخلية في أنابيب قياس التدفق الخلوي ليكون لديك 105 خلايا لكل أنبوب اختبار. قم بتدوير الأنابيب لمدة 5 دقائق عند 300 × جم. قم بإعداد محلول التلوين بحيث يكون 50 ميكرولتر لكل أنبوب اختبار للتلطيخ. أضف CD34 PerCP-efluor710 أو CD34-PE عند تخفيف 1: 100 و 1: 200 ، على التوالي. يعاد تعليق الخلايا في 50 ميكرولتر من محلول التلوين وتحتضينها لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. اغسل الخلايا بإضافة 2 مل من محلول الغسيل وقم بتدويرها لمدة 5 دقائق عند 300 × جم. أعد تعليق الكريات في 100 ميكرولتر من محلول التلوين واحصل على البيانات باستخدام مقياس التدفق الخلوي.ملاحظة: يمكن أيضا تحليل الخلايا مباشرة في الشريحة لاستخراج الحمض النووي الريبي باستخدام 150 ميكرولتر من محلول تحلل الحمض النووي الريبي أو تثبيتها للتصوير باستخدام 4٪ بارافورمالدهيد في DPBS لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تحليل اتجاه الخليةتحليل الصور لتحديد التغيرات في اتجاه الخلية باستخدام FIJI23 (الشكل التكميلي S3).افتح مدير منطقة الاهتمام (ROI) من التحليل | أدوات | قائمة مدير عائد الاستثمار . ارسم ملامح الخلية يدويا باستخدام أداة تحديد المضلع وأضفها إلى مدير عائد الاستثمار بالنقر فوق إضافة أو استخدام اختصار CTRL + T . قم بقياس اتجاه كل عائد استثمار عن طريق اختيار مقياس القطع الناقص المناسب في تحليل | تعيين قائمة القياسات . قم بتطبيق القياس على جميع عائد الاستثمار من خلال المزيد… أمر متعدد المقاييس في مدير عائد الاستثمار.ملاحظة: ستناسب هذه الخطوة القطع الناقص لكل عائد استثمار وتنشئ جدولا يحتوي على طول محاور القطع الناقص الرئيسية والثانوية ، بالإضافة إلى الزاوية. قم بتصدير الجدول إلى ملف CSV ليتم استيراده إلى برامج أخرى لرسمه.ملاحظة: البرنامج النصي المستخدم للمؤامرات متاح في https://gist.github.com/nicolaromano/708b3231d730ee7f70763a7cf8850DDC.
Representative Results
نصف هنا بروتوكولا للتمايز والتحفيز الميكانيكي للخلايا البطانية المشتقة من hiPSCs يسمح بدراسة استجابتها للإشارات الميكانيكية (الشكل 1). ينتج عن هذا البروتوكول إنتاج خلايا بطانية حساسة ميكانيكيا وظيفيا. نقدم هنا نتائج تمثيلية ونصف النمط الظاهري المتوقع لتقييم كيفية استجابة الخلايا لتحفيز السيتوكينات أثناء التمايز. الشكل 1: رسم تخطيطي لبروتوكول التمايز والتحفيز الميكانيكي. رسم تخطيطي لبروتوكول التمايز يوضح توقيت الخلطات المختلفة للسيتوكينات ، وعزل خلية CD34 + ، وبذر الرقائق السائلة ، والتحليل النهائي للخلايا المحفزة ميكانيكيا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. ثقافة hiPSCsمن المهم بدء البروتوكول من hiPSCs التي تنمو بشكل صحيح في ظروف التجديد الذاتي. مؤشر جيد على جودة الثقافة هو سرعة نموها. بعد ذوبان الجليد ، قد تحتاج الخلايا إلى 2-3 أسابيع للوصول إلى المرحلة الصحيحة من النمو التي تضمن تمايز جيد. عندما يمكن تمرير الخلايا مرتين في الأسبوع بنسبة 1: 6 للوصول إلى التقاء كامل تقريبا ، فهذا هو الوقت الذي تكون فيه جاهزة للتمييز في نفس اليوم الذي تحتاج فيه إلى المرور. تمايز hiPSCs إلى خلايا بطانيةالخطوة الأولى من التمايز ، التي تتكون من تكوين أجسام جنينية (EBs) ، تعتمد على خط الخلية وقد تحتاج إلى بعض التحسين لخط الخلية المحدد المستخدم. يمكن تعديل التفكك الموصوف في خطوات البروتوكول 1.3.2.2-1.3.2.4 إما عن طريق تقليل أو تمديد الحضانة باستخدام كاشف التفكك والتفكك اللاحق مع ماصة باستور. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام كواشف التفكك الأخرى لهذه الخطوة بالإضافة إلى التفكك المادي للمستعمرات باستخدام أداة قطع أو طرف ماصة P100. تظهر EBs ذات النوعية الجيدة حافة محددة بحلول اليوم 2 من التمايز وتظهر واضحة ومشرقة عند ملاحظتها باستخدام المجهر ؛ قد تشير المناطق الداكنة إلى موت الخلايا داخل EBs (الشكل 2). الشكل 2: مورفولوجيا الأجسام الجنينية. (أ) اليوم 2 الأجسام الجنينية التي تظهر حواف خارجية محددة جيدا وحجما ثابتا. (ب) اليوم 2 الأجسام الجنينية ذات النوعية الرديئة التي تظهر موت الخلايا على نطاق واسع مما يؤدي إلى تفكك التركيب. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. في اليوم 2 ، تؤدي إضافة CHIR99021 إلى EBs إلى تثبيط بروتين GSK-3 مما يؤدي إلى تنشيط مسار Wnt. خطوط الخلايا المختلفة لها استجابات مختلفة لعلاج CHIR ، ويجب اختبار ذلك عن طريق تحديد عدد خلايا CD34 + التي تم الحصول عليها في اليوم 8 باستخدام تركيزات مختلفة (الشكل 3). الشكل 3: تمايز الخلايا البطانية مع علاجات CHIR المختلفة. التزام الخلايا البطانية الكمي عن طريق قياس التدفق الخلوي في اليوم 8 من التمايز بواسطة التعبير الغشائي CD34 ، بعد معالجة CHIR في اليوم 2 عند (A) 3 μM و (B) 5 μM و (C) 7 μM. تم الحصول على بيانات قياس التدفق الخلوي باستخدام أجهزة قياس الخلايا بخمسة ليزر وبرامج مخصصة (انظر جدول المواد). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. عزل الخلايا CD34 +من المهم التحقق من أن تخصيب CD34 + باستخدام الخرزات المغناطيسية يوفر 80٪ على الأقل CD34 + بعد شطف العمود. لضمان النقاء الكافي ، يمكن تحليل حصصة الخلايا التي تم الحصول عليها من العزلة المغناطيسية عن طريق قياس التدفق الخلوي مع التأكد من استخدام استنساخ مختلف للأجسام المضادة عن تلك المستخدمة في التخصيب المغناطيسي. هنا ، تم استخدام استنساخ 4H11 وتم تحقيق نقاء ~ 85٪ بعد التخصيب (الشكل 4). الشكل 4: التعبير الغشائي ل CD34 قبل وبعد التخصيب عن طريق الفرز المغناطيسي. اليوم 8 تم تلطيخ الأجسام الجنينية المنفصلة (الرمادية) والخلايا بعد التخصيب المغناطيسي (الأخضر) للتعبير عن CD34 وتحليلها بواسطة قياس التدفق الخلوي ، مما يدل على نجاح التخصيب بعد الفرز. تم الحصول على بيانات قياس التدفق الخلوي باستخدام أجهزة قياس الخلايا بخمسة ليزر وبرامج مخصصة (انظر جدول المواد). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. زرع الخلايا في القناة السائلةعند زرع الخلايا في القناة السائلة ، من الضروري تتبع التصاق وتكاثر الخلايا البطانية. بعد البذر ، تستغرق الخلايا ~ 5 ساعات لتلتصق تماما بالقناة (الشكل 5 أ). يمكن أيضا اختبار محلول طلاء بديل لتحسين الالتصاق في هذه المرحلة. للتأكد من أن الخلايا المختبرة حساسة ميكانيكيا وبالتالي قادرة على الاستجابة للتحفيز الميكانيكي ، يمكن اختبار اتجاه الخلية بمرور الوقت. تظهر الخلايا قبل التحفيز اتجاها عشوائيا (الشكل 5A والشكل 5C) وتعيد توجيهها بالتوازي مع اتجاه التدفق (الشكل 5B ، C). يسمح البروتوكول الموصوف هنا بجمع الخلايا من القناة لإجراء تحليل المصب ، على سبيل المثال ، قياس التدفق الخلوي ، لدراسة النمط المناعي للغشاء ، مما يوفر الهوية البطانية للخلايا المحفزة (الشكل 5D ، E). الشكل 5: الاستجابة الميكانيكية للخلايا البطانية المشتقة من hiPSCs . (أ) طبقة متقاربة من خلايا CD34+ المعزولة بعد 48 ساعة من البذر. (ب) طبقة معاد توجيهها من الخلايا البطانية لمدة 3 أيام في ظل الثقافة الديناميكية. ج: تحليل اتجاه الخلايا البطانية بعد 5 أيام من الزراعة الديناميكية. (د) ملف تعريف تعبير CD34 للخلايا المزروعة تحت التدفق لمدة 5 أيام. ه: النسبة المئوية لخلايا CD34+ من تعداد الخلايا المسترجعة من القناة السائلة. تم التقاط الصور باستخدام مجهر مقلوب داخل الحاضنة. تم الحصول على بيانات قياس التدفق الخلوي باستخدام أجهزة قياس خلوي بخمسة ليزر وبرامج مخصصة (انظر جدول المواد). قضبان المقياس = 100 ميكرومتر (أ ، ب). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الكواشف تركيز المخزون تمت إضافة الحجم التركيز النهائي وسيط دولبيكو المعدل من إسكوف (IMDM) – 333 مل – خليط مغذيات لحم الخنزير F-12 (F-12) – 167 مل – ملحق N-2 (100x) 100 × 5 مل 1x ملحق B-27 (50x) 50 × 10 مل 1x حمض الاسكوربيك 10 ملغم/مل 1.25 مل 25 ميكروغرام / مل α-مونوثيوجلسرين (MTG) 11.5 م 19.5 ميكرولتر 448.5 ميكرومتر مصل الإنسان الزلال 100 ملغم/مل 2.5 مل 0.5 مجم / مل هولو ترانسفيرين 100 ملغم/مل 0.75 مل 150 ميكروغرام / مل الجدول 1: تكوين ووصفة ل 500 مل من وسط التمايز الخالي من المصل (SFD). أيام التمايز مزيج السيتوكين السيتوكين التركيز النهائي اليوم 0 – 2 ميكس 1 بي إم بي 4 20 نانوغرام / مل اليوم 2 ميكس 2 CHIR99021 7 ميكرومتر من اليوم 3 فصاعدا مزيج 3 و 4 فيجف 15 نانوغرام / مل بفغف 5 نانوغرام / مل من يوم 6 فصاعدا ميكس 4 IL6 10 نانوغرام / مل FLT3L 10 نانوغرام / مل منتدى حوكمة الإنترنت 1 25 نانوغرام/مل IL11 5 نانوغرام / مل إس سي إف 50 نانوغرام / مل المكتب الأوروبي للبراءات 3 وحدة / مل تبو 30 نانوغرام/مل IL3 30 نانوغرام/مل الجدول 2: خلطات السيتوكينات المستخدمة في تمايز الخلايا البطانية، والأيام التي تضاف فيها إلى وسط SFD، والتركيز النهائي. إجهاد القص (dyn / cm2) الوقت (ح) 0.5 1 1 1 1.5 1 2 1 2.5 1 3 1 3.5 1 4 1 4.5 1 5 حتى نهاية التجربة الجدول 3: قيم إجهاد القص للثقافة الديناميكية وطول تطبيقها. الشكل التكميلي S1: هندسة وأبعاد الرقاقة والأنابيب المستخدمة في هذا البروتوكول. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف. الشكل التكميلي S2: دليل خطوة بخطوة للبرنامج الذي يتحكم في مضخة الهواء مع وصف لكل خطوة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف. الشكل التكميلي S3: دليل لتحليل الاتجاه باستخدام FIJI يوضح رسم شكل الخلية ، والتركيبات الإهليلجية ، والقياس النهائي. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف. الجدول التكميلي S1: حجم الوحدة وحجم إعادة التعليق وتركيزات المخزون للسيتوكينات المستخدمة في بروتوكول التمايز. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Discussion
يسمح البروتوكول الذي وصفناه هنا بتوليد خلايا بطانية حساسة ميكانيكيا من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات ودراسة استجابتها للتحفيز الميكانيكي بوساطة إجهاد القص المتحكم فيه. يعتمد هذا البروتوكول تماما على السيتوكين ومتوافق تماما مع كواشف GMP للترجمة المحتملة إلى إنتاج الخلايا للعلاج بالخلايا.
يوفر اشتقاق hiPSCs للعلماء نموذجا فعالا للمراحل المبكرة من التطور الجنيني الذي يمكن من دراسة العمليات التي يصعب دراستها في الجسم الحي24. في الواقع ، يتم جمع الأنسجة الجنينية البشرية المتاحة للبحث من الأجنة التي تفتقر إلى الدورة الدموية ، وقد يكون لهذا تأثير كبير على التوقيع الجزيئي الذي تتحكم فيه الإشارات الميكانيكية. يتيح النهج الموصوف هنا التصوير المباشر والدراسة في الوقت الفعلي لاستجابة الخلية لإجهاد القص. يوفر الجمع بين hiPSCs مع الموائع نموذجا للدراسة يتغلب على التوافر المحدود وعدم إمكانية الوصول إلى أنسجة الجنين النامية عند بدء الدورة الدموية يعيد تشكيل ويتحكم في إنشاء نظام القلب والأوعية الدمويةوالدم 3،9،10،25.
أحد قيود البروتوكول هو أن الخلايا البطانية المشتقة من هذا البروتوكول قد لا تعكس الهويات المختلفة للخلايا البطانية المختلفة الموجودة في الأنسجة النامية. للتغلب على هذا القيد ، قد تكون هناك حاجة إلى مجموعة محددة من السيتوكينات أثناء عملية التمايز التي تسبق التحفيز السائل للحصول على الهوية المطلوبة أو النمط الظاهري الخاص بالأنسجة26. يمكن الحصول على عزل المجموعات الفرعية البطانية باستخدام نمط مناعي أكثر دقة أثناء خطوة العزل. يعزل هذا البروتوكول الخلايا البطانية بناء على تعبير CD34 فقط ، مما يسمح بعزل العمود بدلا من فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) ؛ هذا يقلل من موت الخلايا وخطر التلوث. علاوة على ذلك ، تم تصميم هذا البروتوكول خصيصا لدراسة دور إجهاد القص بوساطة التدفق الصفحي. يجب استخدام مناهج السوائل البديلة لدراسة تأثير الإشارات الميكانيكية الأخرى ، مثل التمدد أو الضغط ، أو أنواع أخرى من التدفق مثل التدفق المضطرب أو المضطرب.
لقد أظهرنا سابقا أن الخلايا البطانية المشتقة من iPSC تحاكي الهويات الخلوية الشريانية الوريدية غير المتجانسة27 مماثلة لتلك التي لوحظت في الشريان الأورطي الظهري الجنيني28،29،30. هذا له أهمية خاصة في سياق تطور الأوعية والمواصفات الخلوية ، والمعروف أنه يتم التحكم فيه عن طريق الدورة الدموية. أظهرت الدراسات في نماذج مختلفة أن نقص الدورة الدموية يؤدي إلى تغيير المواصفات الشريانية الوريدية 11،14،31. لا تزال الآليات التي تربط الإشارات الميكانيكية بمواصفات الخلية غير معروفة ويسمح خط الأنابيب الموصوف هنا بإجراء دراسات وظيفية محسنة لا يمكن اختبارها في الجسم الحي.
يصف خط الأنابيب هذا إنتاج وتحفيز الخلايا البطانية المشتقة من hiPSCs باستخدام القنوات السائلة المتاحة تجاريا ، وتجنب الحاجة إلى صب الأجهزة كما هو الحال بالنسبة لأجهزة polydimethylsiloxane (PDMS) المستخدمة على نطاق واسع12. علاوة على ذلك ، فإن استخدام رقائق PDMS يجعل جمع الخلايا المحفزة أمرا صعبا بشكل خاص ، بينما مع هذا البروتوكول ، يمكن استرداد الخلايا بسهولة من القناة. هذا يحسن بشكل كبير من القوة التحليلية مما يسمح بالتحليل اللاحق مثل التحليلات البروتينية والنسخية ، وقياس التدفق الخلوي ، والمقايسات الوظيفية ، والتي قد تحتاج إلى مزيد من الثقافة أو المقايسات في الجسم الحي .
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال منحة الأبحاث المتقدمة 2021 من الجمعية الأوروبية لأمراض الدم ، وجائزة البحث العالمية 2021 من الجمعية الأمريكية لأمراض الدم ، وصندوق دعم الاستراتيجية الداخلية ISSF3 بتمويل من Welcome Trust وجامعة إدنبرة. نشكر فيونا روسي من مرفق قياس التدفق الخلوي على الدعم في تحليل قياس التدفق الخلوي. لغرض الوصول المفتوح ، قام المؤلف بتطبيق ترخيص المشاع الإبداعي (CC BY) على أي نسخة مخطوطة مقبولة من المؤلف تنشأ عن هذا التقديم.
Materials
| 0.6 Luer uncoated slide | ibidi | IB-80186 | |
| 25% BSA | Life Technologies | A10008-01 | |
| 6-well plates | Greiner Bio-one | 657160 | |
| Accutase | Life Technologies | A1110501 | Cited as Dissociation reagent |
| Ascorbic acid | Merck | A4544-100G | |
| Aspiration pipette | Sardtedt | 86.1252.011 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504044 | Cited as Neuronal cell culture supplement (50x) |
| BD FACS DIVA | BD Biosciences | Version 8.0.1 | Cited as flow cytometry software |
| BD LSR Fortessa 5 Laser | BD Biosciences | ||
| bFGF | Life Technologies | PHG0021 | |
| CD34 Microbead kit | Miltenyil Biotec | 30-046-702 | |
| CD34 PE clone 4H11 | Invitrogen | 12-0349-42 | |
| CD34 PerCP-eFluor 710 clone 4H11 | Invitrogen | 44-0349-42 | |
| Cellstar cell-repellent surface 6-well plates | Greiner Bio-one | 657970 | Cited as cell-repellent plate |
| CHIR99021 | Cayman Chemicals | 13122-1mg-CAY | |
| Cryostor CS10 cell cryopreservation | Merck | C2874-100ML | Cited as Cryopreservation solution |
| Dimethyl Sulfoxide | VWR | 200-664-3 | Cited as DMSO |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 10565-018 | |
| DPB Ca2+ Mg2+ | Life Technologies | 14080055 | |
| DPBS | Life Technologies | 14200075 | |
| EASY Strainer 40 μm | Greiner Bio-one | 542040 | |
| EDTA | Life technologies | 15575020 | |
| FcR Blocking Reagent | Miltenyil Biotec | 130-059-901 | |
| Fiji | Version 1.53c | ||
| Flow Jo | Version 10.7.1 | Cited as flow cytometry sanalysis oftware | |
| FLT3L | Peprotech | 300-19-10uG | |
| Fluidic unit | ibidi | 10903 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050038 | Cited as L-glutamine supplement |
| Ham F-12 | Life Technologies | 11765054 | |
| Holo-transferrin | Merk | T0665-500MG | |
| Human Serum Albumin | Fujifilm UK LTD | 9988 | |
| Ibidi Pump system | ibidi | 10902 | Cited as Pump system |
| IMDM | Life Technologies | 12440053 | |
| Inverted microscope | ioLight/Thisle Scientific | IOL-IO-INVERT | Cited as inverted in-incubator microscope |
| Lyophilised BSA | Merck | A2153-100G | |
| MiniMACS Separator | Miltenyil Biotec | 130-042-102 | Cited as Magnetic separator |
| MS Columns | Miltenyil Biotec | 130-042-201 | Cited as Magnetic column |
| MTG | Merck | M6145-25ML | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502048 | |
| Notebook for pump system | ibidi | 10908 | |
| Paraformaldehyde 37-41% | Fisher Chemicals | F/1501/PB15 | |
| Pastette | Greiner Bio-one | 612398 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15070063 | |
| Perfusion Set YELLOW/GREEN: 50 cm, ID 1.6 mm, 10 mL reservoirs | Ibidi | IB-10964 | Cited as Perfusion set |
| Polystyrene Round Bottom Tubes | Falcon | 352008 | Cited as Flow cytometry tubes |
| Prism 9 | Verison 9.4.0 | ||
| Pump control software | ibidi | version 1.6.1 | Cited as Pump software |
| ReLeSR | Stem cell tecchonologies | 5872 | Cited as Detaching solution |
| rhBMP4 | R&D | 314-BP-010 | |
| rhEPO | R&D | 287-TC-500 | |
| rhIGF1 | Peprotech | 100-11-100uG | |
| rhIL11 | Peprotech | 200-11-10uG | |
| rhIL3 | Peprotech | 200-03-10uG | |
| rhIL6 | R&D | 206-IL-010 | |
| rhLaminin-521 | Life technologies | A29248 | Cited as Laminin |
| rhSCF | Life Technologies | PHC2111 | |
| rhTPO | R&D | 288-TPN-025 | |
| rhVEGF | R&D | 293-VE-010 | |
| RLT Lysis Buffer | Qiagen | 79216 | |
| Serial Connector for µ-Slides: Sterile, Sterile | ibidi | IB-10830 | |
| StemPro-CD34 SFM media | Life Technologies | 10639011 | Cited as Serum-Free media for CD34+ cells (SFM-34) |
| StemPro-CD34 Nutrient Supplement | Life Technologies | 10641-025 | Cited as 34 nutrient supplement |
| StemPro hESC SFM | Life Technologies | A1000701 | Cited as Culture media |
| StemPro supplement | Life Technologies | A10006-01 | |
| Vitronectin (VTN-N) recombinant human protein, truncated | Invitrogen | A31804 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | Cited as iRock |
| β-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 |
References
- Copp, A. J. Death before birth: clues from gene knockouts and mutations. Trends in Genetics. 11 (3), 87-93 (1995).
- Ji, R. P., et al. Onset of cardiac function during early mouse embryogenesis coincides with entry of primitive erythroblasts into the embryo proper. Circulation Research. 92 (2), 133-135 (2003).
- Peacock, H. M., Daems, M., Jones, E. A. V. Hemodynamic control of endothelial cell fates in development. Cardiac and Vascular Biology. 8, 127-166 (2021).
- Chong, D. C., Koo, Y., Xu, K., Fu, S., Cleaver, O. Stepwise arteriovenous fate acquisition during mammalian vasculogenesis. Developmental Dynamics. 240 (9), 2153-2165 (2011).
- Jaffredo, T., Gautier, R., Eichmann, A., Dieterlen-Lièvre, F. Intraaortic hemopoietic cells are derived from endothelial cells during ontogeny. Development. 125 (22), 4575-4583 (1998).
- Zovein, A. C., et al. Fate Tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).
- Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).
- Boisset, J. C., et al. In vivo imaging of haematopoietic cells emerging from the mouse aortic endothelium. Nature. 464 (7285), 116-120 (2010).
- Adamo, L., et al. Biomechanical forces promote embryonic haematopoiesis. Nature. 459 (7250), 1131-1135 (2009).
- Diaz, M. F., et al. Biomechanical forces promote blood development through prostaglandin E2 and the cAMP-PKA signaling axis. Journal of Experimental Medicine. 212 (5), 665-680 (2015).
- North, T. E., et al. Hematopoietic stem cell development is dependent on blood flow. Cell. 137 (4), 736-748 (2009).
- Lundin, V., et al. YAP regulates hematopoietic stem cell formation in response to the biomechanical forces of blood flow. Developmental Cell. 52 (4), 446.e5-460.e5 (2020).
- Li, J., et al. Mimicry of embryonic circulation enhances the hoxa hemogenic niche and human blood development. Cell Reports. 40 (11), 111339 (2022).
- Azzoni, E., et al. The onset of circulation triggers a metabolic switch required for endothelial to hematopoietic transition. Cell Reports. 37 (11), 110103 (2021).
- Li, Y. S. J., Haga, J. H., Chien, S. Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells. Journal of Biomechanics. 38 (10), 1949-1971 (2005).
- Batsivari, A., et al. Understanding hematopoietic stem cell development through functional correlation of their proliferative status with the intra-aortic cluster architecture. Stem Cell Reports. 8 (6), 1549-1562 (2017).
- Canu, G., et al. Analysis of endothelial-to-haematopoietic transition at the single cell level identifies cell cycle regulation as a driver of differentiation. Genome Biology. 21 (1), 157 (2020).
- Luo, W., et al. Arterialization requires the timely suppression of cell growth. Nature. 589 (7842), 437-441 (2020).
- Yang, C. -. T., et al. Activation of KLF1 enhances the differentiation and maturation of red blood cells from human pluripotent stem cells. Stem Cells. 35 (4), 886-897 (2017).
- Lopez-Yrigoyen, M., et al. A human iPSC line capable of differentiating into functional macrophages expressing ZsGreen: A tool for the study and in vivo tracking of therapeutic cells. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170219 (2018).
- Lopez-Yrigoyen, M., et al. Production and characterization of human macrophages from pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. 2020 (158), (2020).
- Fidanza, A., et al. Single cell analyses and machine learning define hematopoietic progenitor and HSC-like cells derived from human PSCs. Blood. 136 (25), 2893-2904 (2020).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- North, T. E., et al. Hematopoietic stem cell development is dependent on blood flow. Cell. 137 (4), 736-748 (2009).
- Nguyen, J., Lin, Y. Y., Gerecht, S. The next generation of endothelial differentiation: Tissue-specific ECs. Cell Stem Cell. 28 (7), 1188-1204 (2021).
- Petazzi, P., et al. Arterial cells support the development of human hematopoietic progenitors in vitro via secretion of IGFBP2. bioRxiv. , (2022).
- Crosse, E. I., et al. Multi-layered spatial transcriptomics identify secretory factors promoting human hematopoietic stem cell development. Cell Stem Cell. 27 (5), 822 (2020).
- Calvanese, V., et al. Mapping human haematopoietic stem cells from haemogenic endothelium to birth. Nature. 604 (7906), 534-540 (2022).
- Zeng, Y., et al. Tracing the first hematopoietic stem cell generation in human embryo by single-cell RNA sequencing. Cell Research. 29 (11), 881-894 (2019).
- Hwa, J. J., et al. Abnormal arterial-venous fusions and fate specification in mouse embryos lacking blood flow. Scientific Reports. 7 (1), 11965 (2017).
Tags
In Vitro ModelFetal Human VesselOn-chipDevelopmental MechanobiologyEndothelial Cell DifferentiationInduced Pluripotent Stem CellsFluidic DeviceMechanical StimulationVessel DevelopmentFetal CirculationArteriovenous SpecificationHematopoietic Stem CellsPhenotypical CharacterizationFunctional Characterization
Cite This Article
Ventura, T., Egan, E. J., Romanò, N., Fidanza, A. In Vitro Model of Fetal Human Vessel On-chip to Study Developmental Mechanobiology. J. Vis. Exp. (197), e65492, doi:10.3791/65492 (2023).