Очистка хроматина локуса гена с одной копией у Saccharomyces cerevisiae

Динамическая организация эукариотических геномов в хроматин уплотняет ДНК, чтобы она помещалась в пределах ядра, обеспечивая при этом достаточную динамику для экспрессии генов и доступность регуляторных факторов. Отчасти эта универсальность опосредована нуклеосомой, основной единицей хроматина, которая состоит из основной частицы со 147.н. ДНК, обернутой ~1,7 раза вокруг октамера гистонов¹. Нуклеосома представляет собой очень динамичную структуру по отношению к своему составу, с многочисленными вариантами гистонов и посттрансляционными модификациями (ПТМ) на N- и C-концевых хвостах гистонов. Кроме того, эукариотический хроматин взаимодействует с множеством других важных компонентов, таких как транскрипционные факторы, механизмы обработки ДНК и РНК, архитектурные белки, ферменты, участвующие в ремоделировании и модификации хроматина, и молекулы РНК, связанные с хроматином. Эти важнейшие механизмы, участвующие в транскрипции, репликации и репарации, требуют доступа к хроматину, который служит естественным субстратом для этих процессов. Следовательно, понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе этих трансакций ДНК, требует точного определения коллективных изменений в структуре хроматина в конкретных областях генома, где эти механизмы сходятся и способствуют биологическим реакциям.

Несмотря на идентификацию многочисленных факторов хроматина с помощью генетики и исследований белок-белкового взаимодействия, проведение прямого, непредвзятого и всестороннего анализа взаимодействий хроматина на конкретных участках генома остается существенным препятствием ^2,3. Первоначально для масс-спектрометрической идентификации ассоциированных белков 4,5,6,7 можно было выделить только очень распространенные участки генома (т.е. повторяющиеся локусы) или многокопийные плазмиды. Ряд новых подходов, основанных на прямой гибридизации зондов захвата с хроматинизированной ДНК, бесконтактном биотинилировании с использованием системы CRISPR-dCas9 или связывании последовательно-специфических белков-адаптеров с интересующим локусом, начал распутывать протеом однокопийных локусов из геномов дрожжей и млекопитающих ^8,9,10. Однако все эти методы требуют сшивания формальдегида для стабилизации белок-ДНК взаимодействий и ультразвуковой обработки для солюбилизации хроматина для последующей очистки. В совокупности обе манипуляции исключают возможность последующих структурно-функциональных исследований очищенного хроматина.

Чтобы преодолеть эти ограничения, мы ранее разработали методологию, которая использует сайт-специфическую рекомбинацию для извлечения целевых хромосомных доменов из дрожжей^11,12. По сути, интересующая область генома окружена сайт-специфической R-рекомбиназой из Zygosaccharomyces rouxi и одновременно включает группу из трех сайтов связывания ДНК для прокариотического транскрипционного репрессора белка LexA (LexA) в пределах одной и той же области. Дрожжевые клетки содержат экспрессионную кассету для одновременной экспрессии R-рекомбиназы и белка LexA, соединенного с меткой тандемной аффинной очистки (TAP). После индукции R-рекомбиназы фермент эффективно удаляет целевой участок из хромосомы в виде кольцевого домена хроматина. Этот домен может быть очищен с помощью белка-адаптера LexA-TAP, который связывается с сайтами связывания ДНК LexA, а также с аффинной опорой. Этот метод недавно был использован для выделения отдельных доменов хроматина, содержащих выбранные репликационные источники^13-й хромосомы дрожжей.

Одним из основных преимуществ этого подхода ex vivo является то, что он позволяет проводить функциональный анализ изолированного материала. Например, репликационные исходные домены, очищенные с помощью этого метода, могут быть подвергнуты анализу репликации in vitro для оценки эффективности возбуждения исходного сырья в пробирке из нативных хроматиновых матриц in vivo . В конечном счете, биохимическая и функциональная характеристика выделенного материала может позволить восстановить ядерные процессы с использованием очищенных белков вместе с нативным хроматиновым шаблоном. Таким образом, эта методология открывает захватывающие возможности в исследовании хроматина, поскольку можно будет проследить коллективные изменения состава и структуры хроматина в определенной области генома, претерпевающей определенную хромосомную трансакцию.