오십견 쥐 모델의 Tuina: 효율적이고 재현 가능한 프로토콜

이 연구는 Shandong University of Traditional Chinese Medicine 부속병원 윤리위원회의 승인을 받았습니다(번호: AWE-2022-023). 1. 실험동물 20마리의 수컷 Sprague-Dawley(SD) 쥐(생후 7주, 250-280g)를 표준 조건(실온[RT] 20-24°C, 습도 40%-60%, 12시간/12시간 명암주기)에 수용했습니다. 2. 그룹화 방법 SD 랫트를 각각 5마리의 랫트로 구성된 대조군(C), FS 모델 대조군(M), FS 모델 투이나 치료군(MT) 및 FS 모델 경구 치료군(MO)으로 그룹화합니다. 케이지 당 5 마리의 쥐를 유지하십시오 (같은 그룹). 7일간의 적응 후, 다음 섹션에 설명된 대로 FS를 모방하기 위해 3주 동안 석고 캐스트 고정을 사용하여 M, MT 및 MO 그룹의 쥐의 한쪽 어깨를 고정합니다. 섹션 4(그림 1)에 설명된 대로 MT 그룹의 쥐에게 2주 동안 Tuina 요법을 투여합니다. 성체 투여량(0.0675mg/일)과 인체 표면적(0.018)에 대한 쥐의 비율(0.018)을 기준으로 쥐 1kg당 덱사메타손의 필요한 투여량을 계산합니다. 2주 동안 오전 0.067시에 오전 00시에 MO 그룹의 쥐에게 매일 위내 덱사메타손 용액을 투여합니다.참고: 이 그룹화 방법을 사용하여 이 연구에서 Tuina 프로토콜의 효과를 확인합니다. 다른 연구에서 실험 목적에 따라 그룹화 방법을 수행합니다. 3. FS 모델 개발 트리브로모에탄올(250mg/kg, 복강내 주사)을 사용하여 쥐를 마취합니다.11.참고: 기관 윤리 위원회의 요구 사항에 따라 트리보모에탄올(10g)과 tert-아밀 알코올(10mL)로 구성된 원액을 4°C에서 보관했습니다.  사용하기 전에 증류수로 2 %로 희석했습니다. 쥐의 오른쪽 어깨와 가슴에 석고를 적신 붕대를 붙이고 오른쪽 앞다리를 어깨 관절의 내부 회전 90°로 3주 동안 유지합니다(그림 2)12.알림: 쥐를 모니터링하여 걷기, 먹기, 마시는 것과 같은 정상적인 생리적 활동을 수행할 수 있는지 확인합니다. 쥐가 정상적인 생리 활동을 수행할 수 없는 경우 석고 붕대를 다시 고정하십시오. 쥐에서 오른쪽 어깨 관절의 경직, 오른쪽 상지의 수축, 근육 위축, 절뚝거림과 같은 증상의 발달을 관찰하여 FS 모델의 성공적인 확립을 확인한다13. 4. 투이나 방법 알림: 절차 전반에 걸쳐 조사관은 개인 보호 장비를 착용해야 합니다. 단 한 명의 전문 Tuina 의사만이 모든 조작을 수행해야 합니다(그림 3, 그림 4 및 그림 5). 기계 수용기와 컴퓨터를 포함하는 지능형 마사지 기술 파라미터 결정 시스템으로 훈련합니다(그림 3A).메카노레수용체(mechanoreceptor)에 대한 조작을 수행하고 소프트웨어를 통해 표시되는 세 방향의 힘 파라미터를 수행합니다(그림 3B). 엄지 손가락을 사용하여 0.5kg의 강도와 100-120회/분의 빈도로 회전 운동에서 회전 반죽 방법을 수행합니다(그림 3C). 엄지 손가락 끝을 사용하여 0.5kg의 강도로 포인트 프레싱 방법을 수행합니다(그림 3D). 4.1.2 및 4.1.3 단계에서 언급 한 기계식 디스플레이를 1 분 동안 유지하여 쥐에 대해 Tuina를 수행합니다. 쥐가 진정될 때까지(~2분) 쥐를 잡습니다. 그런 다음 조작을 수행합니다. 쥐를 옆으로 누운 자세로 놓지만 다른 조작 방법에 따라 위치가 바뀔 수 있습니다. 오른쪽 검지와 중지를 사용하여 쥐의 오른쪽 앞다리를 고정하고 여러 번 구부리고 펴서 쥐의 어깨 관절, 팔꿈치 관절 및 상완골의 위치를 결정합니다. 쥐의 오른쪽 어깨, 앞다리 및 등을 0.5kg의 강도와 100-120회/분의 빈도로 3분 동안 시계 방향으로 돌려 반죽합니다(그림 4A-C).옆으로 누운 자세에서 앞다리 근육을 조작합니다. 엎드린 자세에서 어깨와 등 근육을 조작합니다. 엄지 손가락 끝으로 엄지 손가락 끝으로 경혈 LI15(Jianyu), SI11(Tianzong), HT01(Jiquan) 및 LI11(Quchi)을 0.5kg의 강도로 경혈당 30회 수직으로 누릅니다(그림 4D-G).rat-acupoint 아틀라스를 사용하여 각 경혈의 위치를 정의합니다(그림 5)14,15. 엎드린 자세에서 견봉 끝의 앞쪽 아래쪽 함몰부에 위치한 LI15를 누릅니다. 엎드린 자세에서 견갑골 척추의 중간 지점에 있는 극하외근(infraspinatus fossa)의 함몰부에 위치한 SI11을 누릅니다. 겨드랑이 중앙에 위치한 HT01을 누운 자세로 누릅니다. 측면 누운 위치에서 입방체 주름의 측면 끝에 있는 신근 carpi radialis의 내측 함몰부에 위치한 LI11을 누릅니다. 왼쪽 엄지와 중지로 어깨 관절을 잡고 내전, 외전, 전방 신전 및 후방 신전 위치에서 앞다리를 10초 동안 스트레칭합니다(그림 4H-K).알림: 이 스트레칭 방법은 쥐에서 저항 없이 수행해야 합니다. 쥐가 동요하면 Tuina 절차를 일시 중지하십시오. 쥐를 10초 동안 쓰다듬어 진정시킨 다음 시험을 진행합니다. 2주 동안 매일 시술을 수행하십시오. 5. 상완골 ROM 측정 알림: 관절낭 조직의 변성을 방지하기 위해 가능한 한 빨리 측정 프로세스를 완료하는 것이 중요합니다. 견갑골의 아래쪽 가장자리를 노출시킨 후 트리브로모에탄올(복강 내 주사에 의한 초기 용량의 3배)을 과도하게 투여하여 쥐를 희생한 후 견갑골과 상완골 근위 2/3를 제거합니다. 주사 바늘(1.2cm x 0.45mm)을 상완골 샤프트를 따라 상완골두에 삽입합니다. 멸균 수술 시트로 감싼 플라스틱 폼에 견갑골의 상하 모서리에 두 개의 주사 바늘을 수직으로 삽입합니다. 상완골축의 주입 바늘에 가는 실을 붙이고 반대쪽 끝을 5g의 힘으로 당겨 상완골축과 평행이 되도록 합니다. 견갑골의 아래쪽 가장자리와 상완골 축(humeral shaft) 사이의 각도를 측정합니다(그림 6).알림: 신뢰할 수 있는 결과를 얻으려면 별도의 조사관이 측정을 수행하도록 하십시오. 통계 분석 소프트웨어 응용 프로그램을 사용하여 평균 ± 표준 편차(SD)로 데이터를 보고합니다.참고: 여기서는 SPSS 소프트웨어(SPSS, 버전 25.0)가 사용되었습니다. 일원 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 그룹 간의 차이를 분석합니다. 적절한 소프트웨어를 사용하여 막대 그래픽을 얻습니다.참고: 여기서는 GraphPad Prism 8을 사용했습니다. 측정 후 H&E 및 Masson 염색을 사용하여 캡슐 병리를 평가합니다. 6. 섹션 준비 상완골 ROM을 평가한 후 전체 샘플을 4% PFA에 3일 동안 고정한 다음 EDTA(pH 7.2) 용액에서 추가로 2개월 동안 석회질을 제거합니다. 탈수 후 샘플이 포함된 임베디드 조직 블록을 5μm 슬라이스16로 자릅니다. 슬라이스를 65°C에서 60분 동안 건조시킵니다. 슬라이스를 왁스를 제거합니다. 슬라이스를 크실렌 I, 크실렌 II 및 크실렌 III에 7분 동안 담근 다음 하강 에탄올 시리즈(무수 에탄올, 5분, 95% 에탄올, 2분, 80% 에탄올, 2분 및 70% 에탄올, 2분)를 넣고 마지막으로 초순수에 2분 동안 담그십시오. 7. H&E 염색 헤마톡실린을 사용하여 섹션을 5분 동안 염색하고 1% 염산 에탄올로 3초 동안 헹구고 흐르는 물로 5분 동안 세척합니다. 에오신으로 부분을 3분 동안 얼룩지게 하고 수돗물로 씻습니다. 섹션을 에탄올 시리즈(95% 에탄올 I, 3초, 95% 에탄올 II, 3초, 무수 에탄올 I, 3초 및 무수 에탄올 II, 1분)에 담근 다음 크실렌 시리즈(크실렌 I, 1분, 크실렌 II, 1분)에 담근다. 각 샘플에 중성 껌 실런트 한 방울을 떨어뜨립니다. 커버 유리로 각 샘플을 밀봉합니다. 도립 형광 현미경(스케일 바 = 100μm)을 사용하여 이미지를 수집합니다. 8. 메이슨 염색 면역조직화학 펜을 사용하여 절편 주위에 원을 그린 다음 절편을 37°C에서 2시간 동안 Bouin의 용액에서 매염제로 배양합니다. 그런 다음 노란색이 사라질 때까지 섹션을 물로 씻으십시오. 샘플을 청금석 파란색 염료로 3분 동안 처리한 다음 증류수로 세척합니다. 절편을 헤마톡실린(Mayer)으로 2분 동안 염색한 후, 산성 에탄올 분화 용액에서 절편을 3초 동안 처리한다. 그런 다음 흐르는 물에 10분 동안 섹션을 씻습니다. ponceau 마젠타 염료 용액으로 섹션을 10분 동안 염색한 다음 물로 씻습니다. 섹션을 포스 몰리브딕 산 용액에 10 분 동안 담그십시오. 아닐린 블루 염색 용액을 섹션에 5분 동안 첨가한 다음 약산성 작업 용액으로 2분 동안 세척합니다. 7.3단계에서 설명한 대로 섹션을 탈수하고 투명하게 만듭니다. 각 부분에 중성 껌 밀봉제를 한 방울 떨어뜨리고 커버 유리로 덮습니다. 섹션을 흄 후드에 넣어 건조시키십시오. 7.5단계에 설명된 대로 이미지를 수집합니다.