الحفاظ على أنواع الأنسجة والخلايا المختلفة للعين وتقييمها باستخدام نظام سوائع جديد بدون مضخة
Summary
ينتج عن التحليل في الوقت الفعلي للأنسجة الحية بيانات وظيفية وميكانيكية مهمة. تصف هذه الورقة البروتوكولات والمتغيرات الحرجة لضمان توليد البيانات بدقة وقابلية للتكرار بواسطة نظام موائع متعدد القنوات جديد وخالي من المضخات يحافظ على مجموعة واسعة من نماذج الأنسجة والخلايا ويقيمها.
Abstract
تتطلب العديد من النماذج في المختبر المستخدمة للتحقيق في وظيفة الأنسجة وبيولوجيا الخلية تدفقا للوسائط لتوفير الأوكسجين الكافي وظروف الخلية المثلى اللازمة للحفاظ على الوظيفة والحيوية. وتحقيقا لهذه الغاية ، قمنا بتطوير نظام زراعة تدفق متعدد القنوات للحفاظ على الأنسجة والخلايا في الثقافة وتقييم الوظيفة والجدوى باستمرار إما عن طريق أجهزة الاستشعار في الخط و / أو جمع كسور التدفق الخارجي. يجمع النظام بين 8 قنوات ، والاستشعار البصري المستمر لمعدل استهلاك الأكسجين مع مجمع الكسر المدمج لقياس معدلات إنتاج المستقلبات وإفراز الهرمونات في وقت واحد. على الرغم من أنها قادرة على الحفاظ على مجموعة واسعة من نماذج الأنسجة والخلايا وتقييمها ، بما في ذلك الجزر الصغيرة والعضلات وما تحت المهاد ، فإننا هنا نصف مبادئ التشغيل والمستحضرات / البروتوكولات التجريبية التي استخدمناها للتحقيق في تنظيم الطاقة الحيوية لشبكية العين المعزولة للفأر ، ظهارة صبغة شبكية الفأر (RPE) – المشيمية الصلبة ، وخلايا RPE البشرية المستزرعة. أنتجت الابتكارات في تصميم النظام ، مثل تدفق السوائل بدون مضخة ، عملية مبسطة إلى حد كبير لنظام تدفق متعدد القنوات. يتم عرض مقاطع الفيديو والصور التي توضح كيفية تجميع وإعداد الأداة للتجربة وتحميل نماذج الأنسجة / الخلايا المختلفة في غرف الاندماج. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تحديد ومناقشة المبادئ التوجيهية لاختيار شروط التجارب الخاصة بالبروتوكول والأنسجة ، بما في ذلك تحديد معدل التدفق الصحيح إلى نسبة الأنسجة للحصول على ظروف زراعة متسقة ومستقرة وتحديد دقيق لمعدلات الاستهلاك والإنتاج. إن الجمع بين الصيانة المثلى للأنسجة والتقييم في الوقت الفعلي لمعلمات متعددة ينتج عنه مجموعات بيانات غنية بالمعلومات سيكون لها فائدة كبيرة للبحث في فسيولوجيا العين واكتشاف الأدوية لعلاج ضعف البصر.
Introduction
أنظمة Perifusion لها تاريخ طويل في علوم الحياة. على وجه الخصوص ، لدراسة وظيفة إفراز الجزر ، فقد تم استخدامها لتوصيف حركية إفراز الأنسولين استجابة للإفرازات1. بالإضافة إلى جمع كسور التدفق الخارجي للفحص اللاحق للهرمونات والمستقلبات ، تم دمج أجهزة استشعار في الوقت الفعلي ، في الغالب للكشف عن استهلاك الأكسجين2،3،4. كانت الجهود الواسعة النطاق لفهم الآليات التي تتوسط أمراض العين محدودة بشكل أفضل بسبب عدم وجود طرق ذات صلة من الناحية الفسيولوجية لتقييم التنظيم الأيضي وعدم تنظيم المكونات المعزولة المختلفة للعين ، بما في ذلك شبكية العين ، الصباغ الشبكي الظهاري (RPE) – المشيمية الصلبة وخلايا RPE المستزرعة. تم تكييف الأنظمة الثابتة المصممة للخلايا المستزرعة للأنسجة5 ، لكن الأنسجة تتطلب تدفقا للحصول على أكسجة كافية. نجحت أنظمة التدفق في قياس الاستجابات في الوقت الفعلي بدقة وتكرار في معدل استهلاك الأكسجين (OCR) بواسطة شبكية العين و RPE-choroid-sclera ، وتبقى الأنسجة مستقرة في التمثيل الغذائي لأكثر من 8 ساعات مما يسمح ببروتوكولات مفيدة للغاية تتضمن مركبات اختبار متعددة4،6،7،8،9. ومع ذلك ، فإن تشغيل أنظمة الموائع يتطلب تاريخيا جهازا مخصصا وموظفين فنيين مدربين على منهجيات غير موحدة. لم يتم اعتماد هذه الأنظمة كمنهجية قياسية في معظم المختبرات. BaroFuse هو نظام سوائع مطور حديثا لا يعتمد على المضخات ، بل يعتمد على ضغط الغاز لدفع التدفق عبر قنوات متعددة وغرف الأنسجة (الشكل 1). تتم مراقبة كل قناة باستمرار بحثا عن OCR ، ويتم جمع التدفق الخارجي باستخدام مجمع كسور قائم على اللوحة للفحص اللاحق للمحتويات. الأهم من ذلك ، تم تصميم غرف محيط الأنسجة للأداة لاستيعاب الأنسجة من مختلف الأشكال الهندسية والأحجام.
قلب الجهاز هو نظام الموائع ، حيث يتم دفع التدفق من خزان مضغوط مغلق من خلال أنبوب صغير القطر الداخلي (ID) (يساهم في مقاومة التدفق الأكثر أهمية في دائرة السوائل) إلى غرف الأنسجة الزجاجية التي تضم الأنسجة. يتم توفير الضغط على وحدة خزان الوسائط (MRM) بواسطة منظمات الضغط المنخفض والضغط العالي المتصلة بأسطوانة غاز تحتوي على خليط من الغازات (عادة 21٪ O 2 ، 5٪ CO 2 ، التوازن N2) ، ويتم إغلاق الخزان من الأعلى بواسطة وحدة غرفة الانصهار (PCM) التي تحمل مجموعات غرفة الأنسجة (TCAs). يتم التحكم في معدل التدفق من خلال طول ومعرف أنابيب المقاومة وإعداد الضغط لمنظم الضغط المنخفض. تقوم أنابيب التدفق الخارجي المتصلة بالجزء العلوي من غرف الأنسجة بتوصيل السائل إما إلى وعاء النفايات (الذي يتم وزنه باستمرار لتحديد معدل التدفق تلقائيا) أو إلى آبار صفيحة 96 بئرا يتحكم فيها جامع الكسر. يقيس نظام الكشف O 2 عمر صبغة حساسة ل O2 مطلية داخل كل غرفة من غرف الأنسجة الزجاجية في اتجاه مجرى الأنسجة. ثم يتم استخدام هذه المعلومات لحساب OCR باستمرار. يوجد نظام الموائع بأكمله في حاوية يتم التحكم في درجة حرارتها وخزان الغاز ومجمع الكسور والكمبيوتر هي المكونات الرئيسية للأداة (الشكل 2 أ). أخيرا ، يعمل البرنامج الذي يقوم بتشغيل الأداة على التحكم في تشغيلها (بما في ذلك إعداد وتوقيت مركبات الاختبار المحقونة ، ونظام قياس التدفق ، وتوقيت جامع الكسور) ، بالإضافة إلى معالجة بيانات التعرف الضوئي على الحروف والقياسات التكميلية الأخرى ورسمها بيانيا.
في هذه الورقة ، نصف بروتوكولات استخدام نظام الموائع لتدوير وتقييم معدل إنتاج OCR واللاكتات (LPR) لمختلف المكونات المعزولة للعين. LPR هي معلمة تعكس معدل تحلل السكر الذي يكمل بشكل كبير التعرف الضوئي على الحروف ، حيث يمثل الزوج الفرعين الرئيسيين لتوليد الطاقة من الكربوهيدرات في الخلية10. نظرا لأنه من الأفضل تعلم تحضير الأنسجة وتحميلها في غرف الأنسجة من خلال مشاهدة الإجراء ، سيساعد الفيديو في توضيح العديد من الخطوات الحاسمة التي يتم تنفيذها أثناء الإعداد والتشغيل والتي لا يمكن نقلها بسهولة عن طريق النص وحده.
ينقسم وصف البروتوكول إلى 8 أقسام تتوافق مع مراحل مختلفة من التجربة (الشكل 2 ب): 1. التحضير قبل التجريبي ؛ 2. إعداد / توازن perifusate ؛ 3. إعداد الصك. 4. توازن الأنسجة. 5. البروتوكول التجريبي. 6. انهيار الصك. 7. معالجة البيانات. و8. مقايسات كسور التدفق الخارج.
Protocol
Representative Results
Discussion
نظرا لأهمية الطاقة الحيوية في جميع جوانب وظيفة الخلية والحفاظ على المكونات المختلفة للعين ، هناك حاجة ماسة لطرق لدراسة تنظيمها. على وجه الخصوص ، تعتمد شبكية العين العصبية و RPE على التمثيل الغذائي لكل من توليد الطاقة وكذلك الإشارات داخل الخلايا وبين الخلايا14،15،16،17. بسبب قدرتها التأكسدية العالية ، لا يتم الحفاظ على الأنسجة المعزولة للعين بشكل جيد في ظل ظروف ثابتة18،19 ، وبالتالي تتطلب دراسة المكونات المعزولة للعين أنظمة تدفق يمكنها الحفاظ على عمليات التمثيل الغذائي وتقييمها. تم تطوير نظام الموائع لتوليد بيانات OCR و LPR من مجموعة واسعة من أنواع الأنسجة وفي هذه الورقة قدمنا بروتوكولات مفصلة تم العثور عليها لتحقيق أفضل النتائج.
يتضمن المحدد الرئيسي لتوليد بيانات قوية باستخدام نظام التدفق التوازن المسبق للوسائط / المخزن المؤقت القائم على ثاني أكسيد الكربون2 عند 39 درجة مئوية (لضمان عدم تشبع perifusate بالغاز المذاب الذي من شأنه أن يتحلل أثناء التجربة). على وجه الخصوص ، سيتم تشبع الوسائط أو المخزن المؤقت KRB المخزن عند 4 درجات مئوية مقارنة ب 37 درجة مئوية وسوف يتحلل الغاز أثناء التجربة إذا كانت أوقات ما قبل التوازن غير كافية. بالإضافة إلى ذلك ، يجب ألا تتعرض الأنسجة المحملة في غرف الأنسجة للصدمة بسبب العزل غير السليم للأنسجة بسبب التمزق أو الفصل غير الكامل للأنسجة ، أو عن طريق تعريض الأنسجة بكميات منخفضة من المخزن المؤقت القائم على البيكربونات للهواء الجوي لفترة طويلة جدا. التحكم في درجة الحرارة واستقرار التدفق وموثوقية اكتشاف O2 لها تباين ضئيل وهذه العوامل لا تساهم بشكل كبير في معدل الفشل.
يحتوي الجهاز على ثماني قنوات تدفق / غرف أنسجة تعمل في وقت واحد والتي يتم تزويدها ب perifusate من خزانين ، أربع غرف أنسجة لكل خزان. للحصول على الدورات الزمنية الأكثر دقة ل OCR ، يتم تصحيح المنحنيات الحركية بواسطة غرف غير محملة بالأنسجة. وبالتالي ، فإن البروتوكول التجريبي النموذجي سيشمل مجموعتين من ثلاث غرف نسيجية. تنقسم البروتوكولات بشكل عام إلى فئتين: الأولى هي بروتوكولات مركبات الاختبار المختلفة على كل جانب (على سبيل المثال المخدرات / المركبات على جانب واحد من MRM ، والمركبة فقط على الجانب الآخر) ؛ والثاني هو نفس بروتوكول حقن مركب الاختبار على جانبي MRM ، ولكن نموذج الأنسجة أو الأنسجة المختلفة على كل جانب من MRM. في هذه الورقة ، تمت مقارنة تأثيرات oligomycin و FCCP على شبكية العين مع OCR بواسطة الأنسجة التي لم تتعرض لأي مركبات اختبار ، وتم تقييم نسيجين بشكل متزامن بموجب نفس البروتوكول والظروف لتحديد السلوك الخاص بالأنسجة. تم توضيح هذا الأخير في هذه الدراسة من خلال إظهار زيادة النطاق الديناميكي لمعدل الأيض بواسطة RPE-choroid-sclera بالنسبة إلى شبكية العين بالتوازي في نفس التجربة. وصفت تقارير أخرى مجموعة واسعة من تصميمات الدراسة بما في ذلك قياس التأثيرات المتغيرة لمستويات O2 على OCR و LPR ، واعتماد تركيز الوقود والأدوية والسموم20,21. بالإضافة إلى ذلك ، على الرغم من أننا قصرنا تحليل كسور التدفق الخارجي على قياس اللاكتات وحساب LPR ، فإن محتوى المعلومات للتجربة يزداد بشكل كبير إذا تم فحص مركبات وفئات متعددة من المركبات في كسور التدفق الخارجي مثل الهرمونات والناقلات العصبية وإشارات الخلية والمستقلبات التي يمكنها الخروج من الخلايا20,22 ، 23.
يكون تحميل شبكية العين المعزولة أو RPE-choroid-sclera أمرا بسيطا ، وبمجرد عزل هذه الأنسجة يتم وضعها ببساطة في الجزء العلوي من غرف الأنسجة بالملقط ويسمح لها بالغرق في الفريت. تطور خلايا RPE المستزرعة على إدخالات المرشح استقطابا مناسبا وعلامات نضج RPE بعد 4-8 أسابيع في الثقافة. ليس من الممكن إزالة RPE لتحليل الخلايا الحية بمجرد توصيلها بغشاء البئر ، إذا كان سيتم الحفاظ على نضج RPE والاستقطاب24. يمكن أن تستوعب غرفة perifusion شرائط من غشاء transwell التي يتم قطعها بمشرط أثناء غمرها في المخزن المؤقت وإدخالها بسرعة في غرف الأنسجة. على الرغم من وضع شرائط مرشح القطع في نظام ثابت24 ، لا تتوفر طريقة أخرى للسوائل لتقييم هذه الأنواع المهمة من الخلايا. كانت استجابات خلايا RPE سريعة وأكثر ديناميكية من شبكية العين أو RPE-choroid-sclera ، ويرجع ذلك جزئيا على الأرجح إلى الوصول الفوري لكل من الجوانب القمية والقاعدية لخلايا RPE المكونة كطبقة أحادية على إدخال الغشاء.
هناك عامل آخر في ضمان أن البيانات لديها أعلى إشارة إلى الضوضاء وهو اختيار النسبة المثلى للأنسجة المحملة في غرف الانتشار بالنسبة لمعدل التدفق. يؤدي القليل جدا من الأنسجة بالنسبة لمعدل التدفق إلى اختلاف تركيز O2 المذاب بين التدفق الداخل والخارج وهو صغير جدا ويصعب قياسه بشكل موثوق. في المقابل ، إذا كان التدفق بطيئا جدا ، يصبح تركيز O2 منخفضا جدا بحيث يتأثر النسيج بنقص الأكسجة. ومع ذلك ، يمكن الحفاظ على تدفق السائل المدفوع بضغط الغاز بمعدلات تدفق تصل إلى 5 مل / دقيقة تتطلب كميات صغيرة فقط من الأنسجة للحصول على قياسات دقيقة للتعرف الضوئي على الحروف و LPR. في التجارب الموضحة هنا ، تم استخدام حوالي 20 مل / دقيقة / قناة والتي كانت مناسبة إما لشبكية واحدة أو اثنين من RPE-choroid-scleras أو 360000 خلية RPE. لتقليل تأثيرات النظام التي تؤخر وتشتت تعرض الأنسجة لمركب الاختبار المحقون ، يتم توفير أحجام متعددة من غرف الأنسجة ، بحيث يتم مطابقة كمية الأنسجة (ومعدل التدفق) مع الحجم المناسب للغرفة.
تم تمثيل البيانات من التحليلات الموضحة في هذه الورقة بطريقتين: الحجم المطلق فيما يتعلق بالمعدل ، أو التغيرات الجزئية بالنسبة إلى الحالة المستقرة أو خط الأساس. كان التركيز على توضيح قياس الاستجابات لمركبات الاختبار. ومع ذلك ، فإن نظام الموائع مناسب تماما لتقييم ومقارنة آثار علاج الأنسجة قبل تحليل perifusion مثل التعديلات الجينية. يكون اختبار ما إذا كان العلاج مختلفا عن التحكم أقوى إذا تم تحليل آثار العلاج على الاستجابات الطبيعية لمركبات الاختبار. إذا كان التحليل يتطلب مقادير مطلقة ، فإن القوة الإحصائية لتحليلات العينات التي تتم معالجتها مسبقا يتم تعظيمها إذا تم إجراء تقييمها وضوابطها في نفس تجربة perifusion.
باستثناء المحرك ، يتم توفير جميع الأجزاء التي تتلامس مع السائل من قبل الشركة المصنعة كمواد استهلاكية وتم تعقيمها. لا ينبغي إعادة استخدام هذه الأجزاء ، حيث ستفقد التجارب أحيانا بسبب التنظيف غير الكامل والأسطح الملوثة. النظام في بداية الإعداد معقم. ومع ذلك ، يتم إضافة الوسائط إلى MRM ، ويتم تحميل الأنسجة في الغرف في ظل ظروف غير معقمة. لقد قمنا بقياس التعرف الضوئي على الحروف في النظام الذي يتم تجميعه بأجزاء معقمة ، ولكن حيث يتم إجراء التجربة نفسها في ظل ظروف غير معقمة. يستغرق الأمر حوالي 14 ساعة حتى تتراكم البكتيريا إلى درجة وجود OCR قابل للقياس (نتائج غير منشورة). إذا تم استخدام بروتوكولات أقل من 10 ساعات أو نحو ذلك ، فإن تراكم البكتيريا وأي آثار ناتجة عنها ستكون ضئيلة.
يستخدم العديد من الباحثين أدوات مصممة لقياس التعرف الضوئي على الحروف تحت الحضانة الثابتة لطبقة أحادية من الخلايا ذات الإنتاجية العالية نسبيا25,26. في المقابل ، تحافظ أداة الموائع التي اختبرناها ووصفناها في هذه الورقة على الأنسجة من خلال ضمان توصيل O2 الكافي وهو أمر بالغ الأهمية لمسافات الانتشار الأكبر الموجودة في عينات الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك ، فهي قادرة على جمع الكسور مما يسمح بتقييم معلمات متعددة بالتوازي مع OCR مما يعزز بشكل كبير القدرة على دراسة العلاقات بينها. أخيرا ، يمكن التحكم في تركيزات الغاز المذاب (مثل O 2 و CO 2) ، مما يزيد من مدة التجارب مع الوسائط القائمة على البيكربونات والمخزن المؤقت ، مما يمكن المستخدم من دراسة تأثيرات O2. وتجدر الإشارة إلى أن أحد القيود المفروضة على كلتا المنهجيتين هو عدم القدرة على دراسة غسل مركبات الاختبار ، وهي وظيفة تمتلكها أنظمة الانتشار الأخرى4،27،28. هناك اعتبار آخر عند تحديد طريقة التحليل المثلى وهو حقيقة أن أنظمة الموائع تستخدم وسائط ومركبات اختبار أكثر من الأنظمة الثابتة. يتم تقليل النفقات الإضافية مع أنظمة الموائع الحالية على الرغم من انخفاض معدلات التدفق التي يمكن استخدام النظام.
بشكل عام ، يتم وصف وصف مفصل للبروتوكولات لإجراء التجارب باستخدام أداة تدفق / تقييم جديدة. لخصت البيانات التي تم إنشاؤها باستخدام شبكية العين و RPE-choroid-sclera النتائج السابقة التي تم الحصول عليها باستخدام أنظمة أكثر صعوبة في الاستخدام (وغير متوفرة بسهولة). وقد ثبت أيضا أن النظام يمكنه الحفاظ على خلايا RPE المرتبطة بأغشية transwell وتقييمها ، وهو نموذج خلوي مهم للغاية لم يتم تحليله من قبل باستخدام أنظمة التدفق بسبب هشاشة الخلايا. تتكون الأجزاء الرئيسية للبروتوكول من وقت إعداد مدته 75 دقيقة ، تليها فترة توازن مدتها 90 دقيقة والبروتوكول التجريبي مما يجعله مناسبا للاستخدام الروتيني من قبل المختبرات غير المتخصصة في تشغيل أنظمة الموائع. على الرغم من أننا ركزنا على قياس الاستجابة الحادة للأنسجة لاختبار المركبات ، إلا أن النظام مناسب جدا لمقارنة الأنسجة من مصادر مختلفة مثل النماذج الحيوانية أو نماذج الخلايا التي تم تعديلها وراثيا أو خضعت لعلاجات / ظروف اختبارية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن نطاق المقايسات التي يمكن إجراؤها على كسور التدفق الخارجي واسع النطاق ويشمل المستقلبات وجزيئات إشارات الخلية والهرمونات / الناقلات العصبية المفرزة بالإضافة إلى التحليل متعدد المكونات الناتج عن قياس الطيف الكتلي على الكسور وكذلك الأنسجة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا البحث من خلال منح من المعاهد الوطنية للصحة (R01 GM148741 I.R.S.) ، U01 EY034591 ، R01 EY034364 ، مؤسسة BrightFocus ، أبحاث للوقاية من العمى (JRC) و R01 EY006641 و R01 EY017863 و R21 EY032597 (JBH).
Materials
| BIOLOGICAL SAMPLES | |||
| C57BL/6J mice | Envigo Harlan (Indianapolis, IN) | N/A | |
| REAGENTS | |||
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920L9795 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270G | |
| KCN | Sigma-Aldrich | 60178 | |
| Lactate | MilliporeSigma | L6661 | |
| Oliigomycin A | Sigma-Aldrich | 75351L9795 | |
| CELL CULTURE AND TISSUE HARVESTING | |||
| Beuthanasia-D | Schering-Plough Animal Health Corp., Union, NJ | N/A | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Euthasol, 390 mg/ml sodium pentobarbital | Virbac | RXEUTHASOL | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | 12303C | |
| Hank’s Buffered Salt Solution | GIBCO | 14065056 | |
| Krebs Ringer Bicarbonate (KRB) | Thermo Fisher Scientific | J67795L9795 | |
| Matrigel | ThermoFisher | #CB-40230 | |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| ROCKi | Selleck Chemicals | Y-27632 | |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | #25-200-072 | |
| SUPPLIES | |||
| Gas Cylinders: 21% O2/5% CO2/balance N2 | Praxair Distribution, Inc | N/A | |
| Transwell filters | MilliporeSigma | 3470 | |
| COMMERCIAL ASSAYS | |||
| Amplex Red Glucose/Glucose Oxidase Assay Kit | ThermoFisher | A22189 | |
| Glucose Oxidase from Aerococcus viridans | Invitrogen (Carlsbad, CA) | A22189L9795 | |
| Lactate Oxidase | Sigma-Aldrich | L9795 | |
| EQUIPMENT | |||
| BaroFuse Multi-Channel Perifusion system | EnTox Sciences, Inc (Mercer Island, WA | Model 001-08 | |
| Synergy 4 Fluorometer | BioTek (Winooski, VT) | S4MLFPTA |
References
- Lacy, P. E., Walker, M. M., Fink, C. J. Perifusion of isolated rat islets in vitro: Participation of the microtubular system in the biphasic release of insulin. Diabetes. 21 (10), 987-998 (1972).
- Doliba, N. M., et al. Metabolic and ionic coupling factors in amino acid-stimulated insulin release in pancreatic beta-HC9 cells. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 292 (6), E1507-E1519 (2007).
- Sweet, I. R., et al. Regulation of ATP/ADP in pancreatic islets. Diabetes. 53 (2), 401-409 (2004).
- Chertov, A. O., et al. Roles of glucose in photoreceptor survival. The Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34700-34711 (2011).
- Kooragayala, K., et al. Quantification of Oxygen Consumption in Retina Ex Vivo Demonstrates Limited Reserve Capacity of Photoreceptor Mitochondria. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (13), 8428-8436 (2015).
- Bisbach, C. M., et al. Succinate Can Shuttle Reducing Power from the Hypoxic Retina to the O2-Rich Pigment Epithelium. Cell Reports. 31 (5), 107606 (2020).
- Du, J., et al. Inhibition of mitochondrial pyruvate transport by zaprinast causes massive accumulation of aspartate at the expense of glutamate in the retina. The Journal of Biological Chemistry. 288 (50), 36129-36140 (2013).
- Hass, D. T., et al. Succinate metabolism in the retinal pigment epithelium uncouples respiration from ATP synthesis. Cell Reports. 39 (10), 110917 (2022).
- Kamat, V., et al. Fluidics system for resolving concentration-dependent effects of dissolved gases on tissue metabolism. Elife. 10, e66716 (2021).
- Stryer, L. . 생화학. , (1995).
- Gu, X., Ma, Y., Liu, Y., Wan, Q. Measurement of mitochondrial respiration in adherent cells by Seahorse XF96 Cell Mito Stress Test. STAR Protocols. 2 (1), 100245 (2021).
- Engel, A. L., et al. Extracellular matrix dysfunction in Sorsby patient-derived retinal pigment epithelium. Experimental Eye Research. 215, 108899 (2022).
- Zhang, R., et al. Inhibition of Mitochondrial Respiration Impairs Nutrient Consumption and Metabolite Transport in Human Retinal Pigment Epithelium. Journal of Proteome Research. 20 (1), 909-922 (2021).
- Hurley, J. B. Retina Metabolism and Metabolism in the Pigmented Epithelium: A Busy Intersection. Annual Review of Vision Science. 7, 665-692 (2021).
- Xiao, J., et al. Autophagy activation and photoreceptor survival in retinal detachment. Experimental Eye Research. 205, 108492 (2021).
- Okawa, H., Sampath, A. P., Laughlin, S. B., Fain, G. L. ATP consumption by mammalian rod photoreceptors in darkness and in light. Current Biology. 18 (24), 1917-1921 (2008).
- Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progress in Retinal and Eye Research. , 100846 (2020).
- Yu, J., et al. Emerging strategies of engineering retinal organoids and organoid-on-a-chip in modeling intraocular drug delivery: Current progress and future perspectives. Advanced Drug Delivery Reviews. 197, 114842 (2023).
- Arjamaa, O., Nikinmaa, M. Oxygen-dependent diseases in the retina: role of hypoxia-inducible factors. Experimental Eye Research. 83 (3), 473-483 (2006).
- Kamat, V., et al. A Versatile Multi-Channel Fluidics System for the Maintenance and Real-Time Metabolic and Functional Assessment of Tissue or Cells. Cell Reports Methods. In Press. , (2023).
- Neal, A., et al. Quantification of Low-Level Drug Effects Using Real-Time, in vitro Measurement of Oxygen Consumption Rate. Toxicological Sciences. 148 (2), 594-602 (2015).
- Jung, S. R., et al. Reduced cytochrome C is an essential regulator of sustained insulin secretion by pancreatic islets. The Journal of Biological Chemistry. 286 (20), 17422-17434 (2011).
- Rountree, A. M., et al. Control of insulin secretion by cytochrome C and calcium signaling in islets with impaired metabolism. The Journal of Biological Chemistry. 289 (27), 19110-19119 (2014).
- Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Benchorin, G., Vollrath, D. Method for measuring extracellular flux from intact polarized epithelial monolayers. Molecular Vision. 24, 425-433 (2018).
- Jarrett, S. G., Rohrer, B., Perron, N. R., Beeson, C., Boulton, M. E. Assessment of mitochondrial damage in retinal cells and tissues using quantitative polymerase chain reaction for mitochondrial DNA damage and extracellular flux assay for mitochondrial respiration activity. Methods in Molecular Biology. 935, 227-243 (2013).
- Perron, N. R., Beeson, C., Rohrer, B. Early alterations in mitochondrial reserve capacity; a means to predict subsequent photoreceptor cell death. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 45 (1-2), 101-109 (2013).
- Cabrera, O., et al. high-throughput assays for evaluation of human pancreatic islet function. Cell Transplantation. 16 (10), 1039-1048 (2008).
- Doliba, N. M., Qin, W., Vinogradov, S. A., Wilson, D. F., Matschinsky, F. M. Palmitic acid acutely inhibits acetylcholine- but not GLP-1-stimulated insulin secretion in mouse pancreatic islets. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 299 (3), E475-E485 (2010).
