Regeneración de escamas de pez cebra en cultivo de escamas en su totalidad y ex vivo

La Unidad Científica Universitaria de Animales (ASU) es responsable del cuidado del pez cebra bajo la guía de las pautas de cría de pez cebra. Todos los procedimientos, incluida la recolección de incrustaciones, la tinción de huesos vivos y las imágenes en vivo, fueron aprobados y realizados bajo una Licencia de Proyecto del Ministerio del Interior (PP4700996) del Reino Unido. Para este manuscrito se utilizó pez cebra transgénico adulto joven de la línea sp7:mCherry [Tg(osterix:mCherry-NTR)pd46]17. Los peces incluyeron machos y hembras de 4 meses de edad. 1. Regeneración de incrustaciones in vivo Antes de comenzar el experimento de regeneración de incrustaciones, transfiera el pez cebra de sus tanques principales a tanques individuales (ver Tabla de materiales) y regrese a estos tanques individuales después de obtener imágenes durante todo el experimento, como se muestra en la Figura 2. Esto es para garantizar que todas las escamas regeneradoras sean las cosechadas para el experimento; El alojamiento en grupo puede conducir a la pérdida esporádica de escamas debido a lesiones causadas por otros peces.NOTA: Los peces se colocan individualmente para evitar peleas y la consiguiente pérdida de escamas entre los peces. Registre la información de cada pez del experimento (es decir, genotipo, edad y sexo) de acuerdo con el diseño del experimento. Use una cámara (las cámaras de los teléfonos inteligentes funcionan bien) para tomar una imagen de cada pez junto a una regla para registrar el tamaño/longitud y el estado de salud de los peces. El día del experimento, anestesiar al pez cebra con sulfonato de metano tricaína al 0,05% (v/v) (MS222, ver Tabla de Materiales) por inmersión, luego colocarlo en una placa de Petri con un pañuelo húmedo para evitar el movimiento de los peces durante la obtención de imágenes o la recolección. Coloque el pescado de lado (por lo general, aquí se usa el flanco izquierdo para mantener la consistencia). Realizar imágenes de flanco utilizando un microscopio estereoscópico con el aumento adecuado (por lo general, se utilizaron 2x, 4x y/o 6,3x y 8x para el presente estudio para capturar tanto el área de regeneración general como el área ampliada para una observación detallada).NOTA: Los puntos de tiempo de las imágenes de flanco dependen del propósito experimental y de la elección de los reporteros transgénicos. Por ejemplo, para realizar un seguimiento de los osteoblastos durante la regeneración de las escamas, los puntos de tiempo sugeridos son el día 0 (ontogenético), 2 días después de la cosecha (dph), 4 dph, 7 dph, 10 dph, 14 dph, 21 dph. Para reducir los efectos de la anestesia repetida, mantenga los puntos de tiempo de obtención de imágenes al mínimo necesario para el experimento. Extraiga las escamas con pinzas finas y pinzas bajo el microscopio estereoscópico. Transfiera las escamas cosechadas a tubos de recolección para teñirlas más tarde.NOTA: El número máximo de escamas que se pueden cosechar dependerá de las aprobaciones éticas locales que estén vigentes. Por lo general, cosechamos alrededor de 20 a 30 escamas y las recolectamos en tubos de recolección individuales para la tinción de incrustaciones más tarde, como ALP, von Kossa14. Recoja las básculas en un tubo de recolección de 1,5 ml o 2 ml. Esto depende de la técnica de tinción utilizada.Tanto para la tinción de ALP como para la de von Kossa, transfiera las escamas a tubos de recolección que contengan agua desionizada, mientras que para la tinción TRAP o inmunohistoquímica, transfiera las escamas a tubos de recolección que contengan PFA al 4% (solución de fijación). Opcional: Antes de transferir las escamas a los tubos, capture imágenes de las escamas individuales cosechadas si es necesario.NOTA: Los puntos de tiempo sugeridos para la cosecha de escamas son el día 0 (ontogenético), el día 10 y el día 21 (escamas regeneradas). 2. Tinción de hueso vivo NOTA: La tinción de esqueletos vivos se puede realizar cuando los peces experimentales no son transgénicos para los reporteros fluorescentes o cuando llevan reporteros transgénicos de un solo color. La tinción viva se puede utilizar para complementar los transgénicos; por ejemplo, se puede usar un indicador de osteoblastos como sp7/osx en un color (p. ej., GFP) y luego teñir el hueso en rojo con rojo de alizarina (AR). El AR y el verde de calceína se pueden usar para el mismo pescado juntos; en este escenario, la RA se utiliza para marcar el hueso original u ontogenético mediante la unión a la matriz mineralizada del hueso envejecido, y la calceína se une a los iones de calcio que son abundantes en el hueso recién formado. Por ejemplo, cuando se tiñe una escala ontogenética, se puede visualizar AR, pero el verde de calceína puede estar ausente o ser mínimo, ya que las escalas ontogenéticas tienen bajos niveles de formación de hueso nuevo. Realice una tinción con rojo de alizarina (AR) en vivo.Prepare un frasco de 2 soluciones de tinción AR mezclando una solución de alizarina al 0,5 % (p/v) (10 ml) con 10 ml de HEPES (concentración final, 10 mM) (consulte la tabla de materiales). Rellene hasta 1 L con 1 solución Danieau (consulte la tabla de materiales). La solución debe mantenerse en la oscuridad o envolverse con papel de aluminio. El día del experimento, lleve 500 ml de 2 soluciones de RA a las instalaciones de pez cebra y agregue 500 ml de agua del sistema (del acuario) para hacer 1 solución de RA que funcione. Transfiera los peces de sus tanques a una solución de tinción AR que funcione 1x y déjelos actuar durante 15-20 minutos. Lave el exceso de manchas en el pescado con 15 minutos de “lavado” en el agua del sistema. Realice una tinción en vivo con Calceína Verde.Prepare un frasco de 2 soluciones de tinción de Calcein Green añadiendo 45 mg de polvo de calceína en 900 ml de 1 solución de Danieau (consulte la Tabla de materiales). Use un agitador magnético para permitir que el polvo se disuelva por completo. Ajusta el pH a 8. Esta es la solución 2x stock Calcein Green. La solución se puede almacenar en la oscuridad / envolver con papel de aluminio hasta por 1 mes. El día del experimento, lleve 500 ml de 2 soluciones de Calcein Green a las instalaciones de pez cebra y agregue 500 ml de agua del sistema para hacer 1 solución de Calcein Green que funcione. Se recomienda utilizar una solución de tinción de calceína recién hecha. Transfiera los peces de sus tanques a 1 solución de tinción de Calcein Green que funcione y déjelos actuar durante 1-2 h. Dependiendo del tamaño del pez, puede ser necesario un tiempo de tinción más largo. Lave el exceso de manchas en el pescado durante 15 minutos de “lavado” en el agua del sistema.NOTA: Imagine el pescado teñido de verde calceína lo antes posible, ya que esta mancha se desvanecerá en unas pocas horas. 3. Tinción de fosfatasa alcalina (ALP) en básculas después de la cosecha Prepare la solución de tinción de ALP mezclando 100 mM de Tris (pH 9,5 con HCl) con 100 mM de NaCl y 50 mM de MgCl2. Utilice una solución madre de NBT/BCIP disponible en el mercado (consulte la Tabla de materiales). Transfiera las escamas a tubos que contengan agua desionizada. Enjuague las escamas con una solución de tinción de ALP durante 5 min. Mientras tanto, prepare una solución de tinción que funcione agregando 200 μL de la solución NBT/BCIP a 10 ml de tampón de tinción ALP. Esto debe estar recién preparado en el momento de la tinción. Tiñir las escamas con la solución de tinción de ALP en funcionamiento durante 15 min. Detenga la reacción enjuagando las escamas con agua desionizada. 4. Tinción de Von KOSSA en básculas postcosecha Prepare una solución de nitrato de plata al 5% (p/v). Prepare una solución de tiosulfato de sodio al 5% (p/v). Transfiera las escamas cosechadas a tubos que contengan agua desionizada. Incubar las escamas en la solución de nitrato de plata durante 40 minutos bajo una luz intensa.NOTA: Use EPP (equipo de protección personal) ya que el nitrato de plata deja una mancha que es difícil de eliminar. Lave las escamas dos veces durante 5 minutos con agua desionizada.NOTA: Los residuos de nitrato de plata deben recolectarse y eliminarse de acuerdo con las pautas locales. Incubar las escamas en tiosulfato de sodio durante 5 min. Lave las escamas dos veces durante 5 minutos con agua desionizada. 5. Tinción colorimétrica TRAP NOTA: Para conocer el procedimiento detallado, consulte el trabajo publicado anteriormente18. Prepara las soluciones de tinción.Prepare 10 mg/mL de solución de fosfato de naftol AS-MX.Pesar 5 mg de fosfato de naftol AS-MX (ver Tabla de Materiales). En la campana extractora, prepare un tubo con 0,5 ml de N, N’-dimetilformamida y disuelva 5 mg de fosfato de naftol AS-MX en 0,5 ml de N, N’-dimetilformamida para hacer una solución madre de 10 mg/ml de fosfato de naftol AS-MX (agitar suavemente). Prepare 1,6 mM de solución madre Fast Red Violet LB en 50 mM de tartrato de sodio.Preparar 50 mL de acetato de sodio 0,1 M a pH 5 (añadir 0,41015 g de acetato de sodio en 50 mL de agua desionizada y ajustar el pH a 5 con ácido acético al 100%). Disolver 0,575 g de L-tartrato de sodio dibásico dihidratado (ver Tabla de Materiales) en 50 mL de tampón de acetato de sodio 0,1 M (pH = 5). Agregue 30 mg de sal LB roja violeta rápida. Prepare PBS-0.1Tx (disuelva 500 μL de Triton-X en 500 mL de PBS).Preparar PBS-0.1Tw (disolver 500 μL de Tween-20 en 500 mL de PBS). Prepare una solución TRAP que funcione.Mezcle ambas soluciones madre en la campana extractora (0,5 ml de solución de fosfato de naftol AS-MX de 10 mg/ml y 50 ml de solución madre de 1,6 mM de solución madre rápida de rojo violeta LB en tartrato de sodio de 50 mM).NOTA: La solución de trabajo ahora se puede usar fuera de la campana extractora. Se puede almacenar en el refrigerador (envuelto en papel de aluminio) hasta por un mes. Almacenar en recipientes separados de anticuerpos u otros reactivos sensibles a los fijadores. Manténgase alejado de la luz tanto como sea posible. Opcional: preparar la solución blanqueadora (en muestras postfijadas que se tiñeron con TRAP) en PBS y Tween-20 al 0,1 % (PBS-0,1 % Tw). Preparar una mezcla de concentración final de hidróxido de potasio (KOH) al 0,5% (a partir de solución madre al 10% (p/v)) y peróxido de hidrógeno al 3% (H2O2) (solución madre al 33 %, almacenada en la nevera). Realice la fijación de la muestra.Fije las escalas en PFA al 4% en 1x PBS balanceándose o girando durante 40 minutos a temperatura ambiente (RT). Retire el PFA al 4% y lave con PBS-0.1Tx al menos 3 veces durante 5 minutos cada lavado. Pase directamente a la tinción TRAP (el mejor enfoque) o guárdelo en PBS-0.1 Tx durante la noche. Realice la tinción TRAP de las escamas.Retire la solución de PBS-0.1 Tx y agregue la solución de trabajo colorimétrica TRAP (paso 5.2.1) para cubrir las muestras por completo (es decir, 1 ml en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml). Incubar durante 1-2 h a RT, meciéndose en la oscuridad. Retire la solución de tinción y lave al menos 3 veces con PBS-0.1 Tw durante 5 minutos cada lavado. Fije las muestras en PFA al 4% durante 30 minutos en RT, meciéndose suavemente en la oscuridad. Retire la solución de PFA lavando 3 veces con PBS-0.1 Tw durante 5 minutos en cada paso.NOTA: Las muestras pueden almacenarse (en soluciones de almacenamiento/montadas en portaobjetos de microscopio) a 4 °C en la oscuridad indefinidamente. 6. Montaje de escamas manchadas Prepare el medio de montaje añadiendo 2,4 g de cristales de Mowiol 4-88 a 6 g de glicerol (véase la tabla de materiales). Se puede utilizar cualquier medio de montaje preferido. Añadir 6 mL de agua desionizada y dejar en un agitador magnético durante una hora. Añadir 12 mL de Tris 0,2 M (pH 8,5) e incubar a 53°C aproximadamente hasta que los cristales de Mowiol se disuelvan por completo. Clarificar la solución centrifugando a 2000 x g durante 20 min a temperatura ambiente. Transfiera la solución a un contenedor de almacenamiento. El medio de montaje se puede conservar en el congelador durante unos 12 meses. La solución descongelada de Mowiol es estable hasta por 1 mes. Monte las escamas en un portaobjetos de microscopio en el montaje del medio, cúbralas con un cubreobjetos y obsérvelas bajo un microscopio. 7. Cultivo ex vivo de escamas NOTA: Este paso es una adaptación de de De Vrieze et al.12. Antes de cosechar las escamas en un ambiente estéril, prepare el medio osteogénico y la placa de cultivo.Medio de cultivo osteogénico (OCM): En un tubo de centrífuga estéril, realice 15 ml de OCM en medio de cultivo celular estándar (alto contenido de glucosa, sin glutamina, sin rojo de fenol) a las concentraciones finales de suero de ternero bovino al 1%, 1% (200 mM de dipéptido L-alanil-L-glutamina en NaCl al 0,85%), solución antibiótica/antimicótica al 1% (100x), 4 mM de CaCl2, 10 mM de β-glicerofosfato, 1 nM de piruvato de sodio y 1 % de anfotericina B (opcional) (ver Tabla de materiales). Vierta el OCM en un depósito de reactivo estéril y, con una pipeta multicanal, agregue 100 μL a cada pocillo de la placa de 96 pocillos. Selle la placa de 96 pocillos y guárdela. El OCM puede almacenarse en el frigorífico durante un breve periodo de tiempo (de la noche a 1 semana) y mantenerse a 28 °C antes de su uso. Realice la recolección de incrustaciones y el lavado de PBS.Recoja las escamas con pinzas/pinzas estériles y deposíguelas en una placa de Petri que contenga una solución estéril de PBS. Realice la configuración de la placa.Transfiera cada escama de la placa de Petri a cada pocillo en la placa de 96 pocillos con 100 μL de OCM (calentado a 28 °C) utilizando pinzas estériles. Una vez que todas las escamas se hayan transferido a la placa, coloque la placa bajo un microscopio estereoscópico. Usar una punta de pipeta fina y estéril para mover suavemente cada escama al fondo del pocillo y mantenerlas alejadas del costado de los pocillos para evitar el reflejo de la luz durante la adquisición de imágenes.NOTA: Este paso solo es necesario si se realizan imágenes en vivo. Transfiera con cuidado la placa a la incubadora o al sistema de imágenes en vivo (LIS, consulte la tabla de materiales) (ajustado a 28 °C, 5% de CO2), donde las escamas se pueden cultivar hasta por 7 días. Actualice OCM (opcional).Calentar el OCM almacenado en la nevera a 28 °C. Transfiera con cuidado la placa de 96 pocillos a un ambiente estéril. Con una pipeta multicanal, aspire 50 μL de cada pocillo. Para ello, presione las puntas contra las paredes y no las sumerja hasta el fondo para evitar aspirar/mover/quitar las escamas. Use nuevas puntas para diferentes condiciones. Vierta el OCM en un depósito de reactivo estéril y, con la pipeta multicanal, agregue 60 μL de OCM a cada pocillo. Coloque la placa bajo el microscopio estereoscópico y compruebe si hay escamas mal colocadas (demasiado cerca de las paredes, flotando o en posición vertical dentro del medio). Vuelva a colocarlos con una punta de pipeta fina y estéril si es necesario. Vuelva a colocar la placa en la incubadora/LIS.NOTA: No refresque el medio si el experimento involucra ritmo circadiano (RC), ya que el choque sérico puede afectar el reloj biológico. Tenga en cuenta que si estudia CR, observe que las condiciones de luz también reinician el reloj. Realice la tinción y la obtención de imágenes a escala posteriores al cultivo (opcional).Después de 6 días de cultivo, fíjelos y diríjalos para una tinción adecuada, como von Kossa y ALP mencionados anteriormente. Alternativamente, si los peces experimentales tienen una etiqueta fluorescente, coloque la placa en un sistema de imágenes en vivo.NOTA: Si utiliza un sistema de imágenes en vivo, asegúrese de que esté ajustado a una temperatura y un nivel deCO2 apropiados para el experimento. Típicamente, en este estudio, se utilizaron 28 °C y 5% de CO2 . Seleccionar filtros y puntos de tiempo de imagen apropiados (en este caso, se utilizó un intervalo de 2 o 4 h, que es suficiente para seguir la migración de los osteoblastos) y objetivos de bajo aumento (es decir, 4x) para garantizar una obtención de imágenes uniforme de todos los pocillos. Esto se debe a que las básculas tienden a moverse dentro de los pozos, particularmente durante los cambios de medios.