Imaging chimico iperspettrale non lineare multimodale mediante microscopia a scansione lineare con generazione di somma-frequenza vibrazionale

La generazione di somma-frequenza vibrazionale (VSFG), una tecnica ottica non lineare del secondo ordine ^1,2, è stata ampiamente utilizzata come strumento di spettroscopia per profilare chimicamente campioni simmetrici^consentiti 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13^, 14,15,16,17,18,19,20,21,22. Tradizionalmente, il VSFG è stato applicato ai sistemi interfacciali 8,9,10,11 (cioè gas-liquido, liquido-liquido, gas-solido^, solido-liquido), che mancano di simmetria di inversione – un requisito per l’attività VSFG. Questa applicazione di VSFG ha fornito una vasta gamma di dettagli molecolari delle interfacce sepolte 12,13, delle configurazioni delle molecole d’acqua alle interfacce 14,15,16,17,18 e delle specie chimiche alle interfacce 19,20,21,22.

Sebbene il VSFG sia stato potente nel determinare le specie molecolari e le configurazioni alle interfacce, il suo potenziale nella misurazione delle strutture molecolari di materiali privi di centri di inversione non è stato realizzato. Ciò è in parte dovuto al fatto che i materiali potrebbero essere eterogenei nel loro ambiente chimico, nelle composizioni e nella disposizione geometrica, e uno spettrometro VSFG tradizionale ha un’ampia area di illuminazione dell’ordine di 100 μm². Pertanto, la spettroscopia VSFG tradizionale riporta informazioni mediate dall’ensemble del campione su una tipica area di illuminazione di 100 μm². Questa media d’insieme può portare a cancellazioni di segnale tra domini ben ordinati con orientamenti opposti e a un’errata caratterizzazione delle eterogeneità locali 15,20,23,24.

Con i progressi negli obiettivi per microscopi ad alta apertura numerica (NA), basati su riflessione (geometrie di Schwarzschild e Cassegrain), che sono quasi privi di aberrazioni cromatiche, la dimensione del fuoco dei due fasci negli esperimenti VSFG può essere ridotta da 100 μm 2 a 1-2 μm² e in alcuni casi submicron²⁵. Compreso questo progresso tecnologico, il nostro gruppo e altri hanno sviluppato VSFG in una piattaforma di microscopia 20,23,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36. Recentemente, abbiamo implementato un layout ottico invertito e uno schema di rilevamento a banda larga³⁷, che consente una raccolta senza soluzione di continuità di immagini multimodali (VSFG, generazione di seconda armonica (SHG) e ottica in campo chiaro). L’imaging multimodale consente una rapida ispezione dei campioni utilizzando l’imaging ottico, correlando tra loro vari tipi di immagini e localizzando le posizioni del segnale sulle immagini del campione. Con l’ottica di illuminazione acromatica e la scelta della sorgente di illuminazione laser pulsata, questa piattaforma ottica consente in futuro l’integrazione senza soluzione di continuità di tecniche aggiuntive come la microscopia a fluorescenza³⁸ e la microscopia Raman, tra le altre.

In questa nuova disposizione, sono stati studiati campioni come le organizzazioni gerarchiche e una classe di auto-assemblaggi molecolari (MSA). Questi materiali includono il collagene e la biomimetica, in cui sia la composizione chimica che l’organizzazione geometrica sono importanti per la funzione finale del materiale. Poiché VSFG è un segnale ottico non lineare del secondo ordine, è specificamente sensibile alle disposizioni intermolecolari^39,40, come la distanza intermolecolare o gli angoli di torsione^, il che lo rende uno strumento ideale per rivelare sia le composizioni chimiche che le disposizioni molecolari. Questo lavoro descrive le modalità VSFG, SHG e campo chiaro dello strumento principale costituito da un laser a stato solido a cavità drogato con itterbio che pompa un amplificatore parametrico ottico (OPA), un microscopio invertito multimodale costruito in casa e un analizzatore di frequenza monocromatore accoppiato a un rivelatore bidimensionale ad accoppiamento caricato (CCD)²⁷. Vengono fornite procedure dettagliate di costruzione e allineamento e un elenco completo delle parti della configurazione. Un’analisi approfondita di un MSA, la cui subunità molecolare fondamentale è costituita da una molecola di sodio-dodecilsolfato (SDS), un tensioattivo comune, e due molecole di β-ciclodestrina (β-CD), nota come SDS@2 β-CD, viene fornita anche come esempio per mostrare come VSFG può rivelare dettagli geometrici specifici della molecola della materia organizzata. È stato inoltre dimostrato che i dettagli geometrici chimicamente specifici dell’MSA possono essere determinati con un approccio risolutore di funzioni di rete neurale.