Normothermic Ex Vivo Karaciğer Makinesi Farede Perfüzyon
Summary
Fare karaciğerleri için normotermik ex vivo karaciğer perfüzyonu (NEVLP) sistemi oluşturuldu. Bu sistem mikrocerrahide deneyim gerektirir ancak tekrarlanabilir perfüzyon sonuçlarına izin verir. Fare karaciğerlerini kullanma yeteneği, yeni perfüzyon katkı maddelerini tanımlamak için moleküler yolakların araştırılmasını kolaylaştırır ve organ onarımına odaklanan deneylerin yürütülmesini sağlar.
Abstract
Bu protokol, fare karaciğerlerini kullanarak optimize edilmiş eritrositsiz bir NEVLP sistemi sunar. Fare karaciğerlerinin ex vivo korunması, modifiye kanüller ve geleneksel ticari ex vivo perfüzyon ekipmanlarından uyarlanmış teknikler kullanılarak sağlanmıştır. Sistem, 12 saatlik perfüzyonu takiben koruma sonuçlarını değerlendirmek için kullanıldı. C57BL / 6J fareleri karaciğer donörü olarak görev yaptı ve karaciğerler, portal ven (PV) ve safra kanalı (BD) kanüle edilerek ve daha sonra organı ılık (37 ° C) heparinize salin ile yıkayarak eksize edildi. Daha sonra ekilen karaciğerler perfüzyon odasına transfer edildi ve normotermik oksijenli makine perfüzyonuna (NEVLP) tabi tutuldu. Giriş ve çıkış perfüzyon numuneleri, perfüzyon analizi için 3 saatlik aralıklarla toplandı. Perfüzyonun tamamlanmasının ardından, histolojik analiz için karaciğer örnekleri alındı ve morfolojik bütünlük, Hematoksilin-Eozin (HE) boyaması yoluyla modifiye Suzuki-Skoru kullanılarak değerlendirildi. Optimizasyon deneyleri aşağıdaki bulguları vermiştir: (1) 30 g’ın üzerindeki fareler, safra kanallarının (BD) daha büyük boyutu nedeniyle deney için daha uygun görülmüştür. (2) 2 Fr (dış çap = 0.66 mm) poliüretan kanül, bir polipropilen kanüle kıyasla portal venin (PV) kanüllenmesi için daha uygundu. Bu, poliüretan malzemenin gelişmiş kavramasına bağlandı ve vücuttan organ odasına transfer sırasında kateter kaymasının azalmasına neden oldu. (3) Safra kanalının (BD) kanülasyonu için 1 Fr (dış çap = 0.33 mm) poliüretan kanülün polipropilen UT – 03 (dış çap = 0.30 mm) kanülüne göre daha etkili olduğu bulunmuştur. Bu optimize protokolle, fare karaciğerleri histolojik yapı üzerinde önemli bir etki yaratmadan 12 saatlik bir süre boyunca başarıyla korunmuştur. Hematoksilin-Eozin (HE) boyaması, karaciğerin iyi korunmuş morfolojik mimarisini ortaya çıkardı, açıkça görülebilen çekirdeklere sahip ağırlıklı olarak canlı hepatositler ve hepatik sinüzoidlerin hafif genişlemesi ile karakterize edildi.
Introduction
Karaciğer transplantasyonu, son dönem karaciğer hastalığı olan bireyler için altın standart tedaviyi temsil eder. Ne yazık ki, donör organlara olan talep mevcut arzı aşmakta ve önemli bir kıtlığa yol açmaktadır. 2021 yılında, yaklaşık 24.936 hasta karaciğer grefti için bekleme listesindeyken, sadece 9.234 nakil başarıyla gerçekleştirildi1. Karaciğer greftlerinin arz ve talebi arasındaki önemli eşitsizlik, donör havuzunu genişletmek ve karaciğer greftlerinin erişilebilirliğini artırmak için alternatif stratejilerin araştırılması gerekliliğini vurgulamaktadır. Donör havuzunu genişletmenin bir yolu, marjinal donörleri kullanmaktır2. Marjinal donörler arasında ileri yaş, orta veya şiddetli steatoz olanları bulunur. Marjinal organların transplantasyonu olumlu sonuçlar verse de, genel sonuçlar optimal değildir. Sonuç olarak, marjinal donörlerin işlevini arttırmayı amaçlayan terapötik stratejilerin geliştirilmesi şu anda devam etmektedir 3,4.
Stratejilerden biri, bu marjinal organların işlevini geliştirmek için makine perfüzyonunu, özellikle normotermik oksijenli makine perfüzyonunu kullanmaktır5. Bununla birlikte, normotermik oksijenli makine perfüzyonunun (NEVLP) yararlı etkilerinin altında yatan moleküler mekanizmaların hala sınırlı bir anlayışı vardır. Fareler, genetiği değiştirilmiş suşların bol miktarda bulunmasıyla, moleküler yolları araştırmak için değerli modeller olarak hizmet eder. Örneğin, hepatik iskemi-reperfüzyon hasarını hafifletmede otofaji yolaklarının önemi giderek daha fazla kabul görmektedir 6,7. Hepatik iskemi-reperfüzyon hasarında önemli bir moleküler yol miR-20b-5p/ATG7 yol8’dir. Şu anda, bir dizi ATG nakavt ve koşullu nakavt fare suşu mevcuttur, ancak karşılık gelen sıçan suşlarıyoktur 9.
Bu arka plana dayanarak, amaç fare karaciğer greftleri için minyatür bir NEVLP platformu oluşturmaktı. Bu platform, donörün karaciğerinin işlevselliğini iyileştirmeyi amaçlayan potansiyel genetiği değiştirilmiş stratejilerin araştırılmasını ve değerlendirilmesini kolaylaştıracaktır. Ek olarak, sistemin uzun süreli perfüzyon için uygun olması ve genellikle “organ onarımı” olarak adlandırılan karaciğerin ex vivo tedavisini sağlaması çok önemliydi.
Fare karaciğeri perfüzyonu ile ilgili in vitro verilerin sınırlı mevcudiyeti göz önüne alındığında, literatür taraması sıçanlarda yapılan çalışmalara odaklanmıştır. “Normotermik karaciğer perfüzyonu”, “ex vivo veya in vitro” ve “sıçanlar” gibi anahtar kelimeler kullanılarak 2010’dan 2022’ye kadar uzanan sistematik bir literatür taraması yapılmıştır. Bu araştırma, kemirgenlerde en uygun koşulları tanımlamayı ve en uygun yaklaşımı belirlememizi sağlamayı amaçlamıştır.
Perfüzyon sistemi, kapalı bir su ceketli cam tampon rezervuarı, bir peristaltik makaralı pompa, bir oksijenatör, bir kabarcık kapanı, bir ısı eşanjörü, bir organ odası ve kapalı bir bisiklet boru sisteminden oluşur (Şekil 1). Sistem, özel bir termostatik makine kullanarak 37 °C’lik sabit bir perfüzyon sıcaklığının hassas bir şekilde korunmasını sağlar. Peristaltik makaralı pompa, perfüzyonun akışını devre boyunca yönlendirir. Perfüzyon devresi, yalıtımlı su ceketli rezervuarda başlar. Daha sonra, perfüzyonat, özel bir gaz şişesinden% 95 oksijen ve% 5 karbondioksit gaz karışımı alan oksijenatörden yönlendirilir. Oksijenasyonu takiben, perfüzyonat kabarcık tuzağından geçer, burada sıkışmış kabarcıklar peristaltik pompa tarafından rezervuara geri yönlendirilir. Kalan perfüzyonat ısı eşanjöründen akar ve rezervuara geri döndüğü organ odasına girer.
Burada, fare karaciğerleri için bir NEVLP oluşturma deneyimlerimizi rapor ediyoruz ve oksijen taşıyıcıları olmadan oksijenli ortam kullanılarak gerçekleştirilen bir pilot deneyin umut verici sonuçlarını paylaşıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokoldeki kritik adımlar
Karaciğer eksplantasyonunda iki önemli adım, portal venin (PV) kanülasyonu ve ardından safra kanalının (BD) kanülasyonudur. Bu adımlar, başarılı organ alımı ve ardından perfüzyon veya transplantasyon prosedürlerinin sağlanmasında büyük önem taşımaktadır.
Zorluklar ve çözümler
PV kanülasyonu üç zorluk ortaya çıkarır: damar duvarının yaralanması, kateterin yer değiştirmesi ve yerleştirme …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu yazının yazımı boyunca çok fazla destek ve yardım aldım. Takım arkadaşım XinPei Chen’e operasyonum sırasında harika işbirliği ve hasta desteği için özellikle teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| 0.5 ml Micro Tube PP | Sarstedt | 72699 | |
| 1 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
| 10 µL Micro Syringe | Hamilton | 701N | |
| 2 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
| 24 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+OF2419 | |
| 26 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+DU2619WX | |
| 30 G Hypodermic Needle | Sterican | 100246 | |
| 50 ml Syringe Pump | Braun | 110356 | |
| 6-0 Perma-Hand Seide | Ethicon | 639H | |
| Arterial Clip | Braun | BH014R | |
| Autoclavable Moist Chamber | Hugo Sachs Elektronik | 73-4733 | |
| Big Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974018 | |
| Bubble Trap | Hugo-Sachs-Elektronik | V83163 | |
| Buprenovet (0.3 mg / ml) | Elanco | / | |
| CIDEX OPA solution (2 L) | Cilag GmbH | 20391 | |
| Electrosurgical Unit for Monopolar Cutting VIO® 50 C | ERBE | / | |
| Fetal Bovine Serum(500 ml) | Sigma-Aldrich | F7524-500ML | |
| Gas Mixture (95 % oxygen & 5 % carbon dioxide) | House Supply | / | |
| Heating Circulating Baths | Harvard-Apparatus | 75-0310 | |
| Heparin 5000 (I.E. /5 ml) | Braun | 1708.00.00 | |
| Hydrocortisone (100 mg / 2 ml) | Pfizer | 15427276 | |
| Insulin(100 IE / ml) | Sigma | I0516-5ML | |
| Iris Scissors | Fine Science Instruments | 15000-03 | |
| Isofluran (250 ml) | Cp-Pharma | 1214 | |
| Membrane Oxygenator | Hugo Sachs Elektronik | T18728 | |
| Microsurgery Microscope | Leica | M60 | |
| Mouse Retractor Set | Carfil Quality | 180000056 | |
| NanoZoomer 2.0 HT | Hamamatsu | / | |
| Non-Woven Sponges | Kompressen | 866110 | |
| Penicillin Streptomycin (1 mg / ml) | C.C.Pro | Z-13-M | |
| Perfusion Extension Tube (30 cm) | Braun | 4256000 | |
| Peristaltic Pump | Harvard-Apparatus | P-70 | |
| Petri Dishc 100×15 mm | VWR® | 391-0578 | |
| Povidon-Jod (Vet-Sep Spray) | Livisto | 799-416 | |
| Pressure Transducer Simulator | UTAH Medical Products | 650-950 | |
| Reusable Blood Pressure Transducers | AD Instruments | MLT-0380/D | |
| S & T Vessel Cannulation Forceps | Fine Science Instruments | 00608-11 | |
| Small Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974116 | |
| Straight Forceps 10 cm | Fine Science Instruments | 00632-11 | |
| Suture Tying Forceps | Fine Science Instruments | 11063-07 | |
| Syringe 50ml Original Perfusor | Braun | 8728810F-06 | |
| UT – 03 Cannula | Unique Medical, Japan | / | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Instruments | 15018-10 | |
| Veterinary Saline (500 ml) | WDT | 18X1807 | |
| Water Jacketed Reservoir 2 L | Harvard-Apparatus | 73-3441 | |
| William's E Medium (500 ML) | Thermofischer Scientific | A1217601 |
References
- Kwong, A. J., et al. OPTN/SRTR 2021 Annual data report: liver. American Journal of Transplantation. 23 (2), S178-S263 (2023).
- Linares, I., Hamar, M., Selzner, N., Selzner, M. Steatosis in Liver Transplantation: Current Limitations and Future Strategies. Transplantation. 103 (1), 78-90 (2019).
- Cheng, N., et al. Pharmacological activating transcription factor 6 activation is beneficial for liver retrieval with ex vivo normothermic mechanical perfusion from cardiac dead donor rats. Frontiers in Surgery. 8, 665260 (2021).
- Porte, R. J. Improved organ recovery after oxygen deprivation. Nature. 608 (7922), 273-274 (2022).
- Goumard, C., et al. Ex-Vivo Pharmacological Defatting of the Liver: A Review. Journal of Clinical Medicine. 10 (6), 1253 (2021).
- Mao, B., Yuan, W., Wu, F., Yan, Y., Wang, B. Autophagy in hepatic ischemia-reperfusion injury. Cell Death Discovery. 9 (1), 115 (2023).
- Hale, A. N., Ledbetter, D. J., Gawriluk, T. R., Rucker, E. B. Autophagy: regulation and role in development. Autophagy. 9 (7), 951-972 (2013).
- Tang, B., Bao, N., He, G., Wang, J. Long noncoding RNA HOTAIR regulates autophagy via the miR-20b-5p/ATG7 axis in hepatic ischemia/reperfusion injury. Gene. 686, 56-62 (2019).
- Kuma, A., Komatsu, M., Mizushima, N. Autophagy-monitoring and autophagy-deficient mice. Autophagy. 13 (10), 1619-1628 (2017).
- van der, V. a. l. k. . J. Fetal bovine serum-A cell culture dilemma. Science. 375 (6577), 143-144 (2022).
- Haque, O., et al. Twenty-four hour ex-vivo normothermic machine perfusion in rat livers. Technology (Singapore World Science). 8 (1-2), 27-36 (2020).
- Op den Dries, S., et al. Normothermic machine perfusion reduces bile duct injury and improves biliary epithelial function in rat donor livers. Liver Transplantation. 22 (7), 994-1005 (2016).
- Izamis, M. L., et al. Machine perfusion enhances hepatocyte isolation yields from ischemic livers. Cryobiology. 71 (2), 244-255 (2015).
- Gassner, J. M. G. V., et al. Improvement of normothermic ex vivo machine perfusion of rat liver grafts by dialysis and kupffer cell inhibition with glycine. Liver Transplantation. 25 (2), 275-287 (2019).
- Casado, J., et al. Rat splanchnic net oxygen consumption, energy implications. The Journal of Physiology. 431, 557-569 (1990).
- Tolboom, H., et al. A model for normothermic preservation of the rat liver. Tissue Engineering. 13 (8), 2143-2151 (2007).
- Yamada, S., et al. Effects of short-term normothermic and subnormothermic perfusion after cold preservation on liver transplantation from donors after cardiac death. Transplantation Proceedings. 52 (6), 1639-1642 (2020).
- Behrends, M., et al. Acute hyperglycemia worsens hepatic ischemia/reperfusion injury in rats. Journal of Gastrointestinal Surgery. 14 (3), 528-535 (2010).
- Tolboom, H., et al. Sequential cold storage and normothermic perfusion of the ischemic rat liver. Transplant Proceeding. 40 (5), 1306-1309 (2008).
- Daemen, M. J., et al. Liver blood flow measurement in the rat. The electromagnetic versus the microsphere and the clearance methods. Journal of Pharmacological Methods. 21 (4), 287-297 (1989).
- Koo, A., Liang, I. Y. Microvascular filling pattern in rat liver sinusoids during vagal stimulation. The Journal of physiology. 295, 191-199 (1979).
- Beal, E. W., et al. [D-Ala2, D-Leu5] Enkephalin improves liver preservation during normothermic ex vivo perfusion. Journal of Surgical Research. 241, 323-335 (2019).
- Birnie, J. H., Grayson, J. Observations on temperature distribution and liver blood flow in the rat. The Journal of Physiology. 116 (2), 189-201 (1952).
- Silitonga, M., Silitonga, P. M. Haematological profile of rats (Rattus norvegicus) induced BCG and provided leaf extract of Plectranthus amboinicus Lour Spreng). AIP Conference Proceedings. 1868, 090008090008 (2017).
- Jacob Filho, W., et al. Reference database of hematological parameters for growing and aging rats. Aging Male. 21 (2), 145-148 (2018).
- Tian, X., et al. Heme oxygenase-1-modified bone marrow mesenchymal stem cells combined with normothermic machine perfusion repairs bile duct injury in a rat model of DCD liver transplantation via activation of peribiliary glands through the Wnt pathway. Stem Cells International. 2021, 9935370 (2021).
- Yang, L., et al. Normothermic machine perfusion combined with bone marrow mesenchymal stem cells improves the oxidative stress response and mitochondrial function in rat donation after circulatory death livers. Stem Cells Development. 29 (13), 835-852 (2020).
- Wang, L., He, H. W., Zhou, X., Long, Y. Ursodeoxycholic Acid (UDCA) promotes lactate metabolism in mouse hepatocytes through cholic acid (CA) – farnesoid x receptor (FXR) pathway. Current Molecular Medicine. 20 (8), 661-666 (2020).
- Akateh, C., Beal, E. W., Whitson, B. A., Black, S. M. Normothermic ex-vivo liver perfusion and the clinical implications for liver transplantation. Journal of Clinical and Translational Hepatology. 6 (3), 276-282 (2018).
- Westerkamp, A. C., et al. Metformin preconditioning improves hepatobiliary function and reduces injury in a rat model of normothermic machine perfusion and orthotopic transplantation. Transplantation. 104 (9), e271-e280 (2020).
- Nösser, M., et al. Development of a rat liver machine perfusion system for normothermic and subnormothermic conditions. Tissue Engineering. Part A. 26 (1-2), 57-65 (2020).
- Yao, J., et al. Extracellular vesicles derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate rat hepatic ischemia-reperfusion injury by suppressing oxidative stress and neutrophil inflammatory response. FASEB Journal. 33 (2), 1695-1710 (2019).
- Haque, O., et al. The effect of blood cells retained in rat livers during static cold storage on viability outcomes during normothermic machine perfusion. Scientific Reports. 11 (1), 23128 (2021).
- Gillooly, A. R., Perry, J., Martins, P. N. First report of siRNA uptake (for RNA interference) during ex vivo hypothermic and normothermic liver machine perfusion. Transplantation. 103 (3), e56-e57 (2019).
- Beal, E. W., et al. A small animal model of ex vivo normothermic liver perfusion. Journal of visualized experiments. (136), e57541 (2018).
- Claussen, F., et al. Dual versus single vessel normothermic ex vivo perfusion of rat liver grafts using metamizole for vasodilatation. PLoS One. 15 (7), (2020).
- Yang, L., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells combine with normothermic machine perfusion to improve rat donor liver quality-the important role of hepatic microcirculation in donation after circulatory death. Cell and Tissue Research. 381 (2), 239-254 (2020).
- Wu, L., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells modified with heme oxygenase-1 alleviate rejection of donation after circulatory death liver transplantation by inhibiting dendritic cell maturation in rats. International Immunopharmacology. 107, 108643 (2022).
- Lonati, C., et al. Quantitative Metabolomics of Tissue, Perfusate, and Bile from Rat Livers Subjected to Normothermic Machine Perfusion. Biomedicines. 10 (3), (2022).
- Oldani, G., et al. The impact of short-term machine perfusion on the risk of cancer recurrence after rat liver transplantation with donors after circulatory death. PLoS One. 14 (11), e0224890 (2019).
- Abraham, N., et al. Two compartment evaluation of liver grafts during acellular room temperature machine perfusion (acRTMP) in a rat liver transplant model. Frontiers in Medicine (Lausanne). 9, 804834 (2022).
- Scheuermann, U., et al. Sirtuin-1 expression and activity is diminished in aged liver grafts. Scientific Reports. 10 (1), 11860 (2020).
- Scheuermann, U., et al. Damage-associated molecular patterns induce inflammatory injury during machine preservation of the liver: potential targets to enhance a promising technology. Liver Transplantation. 25 (4), 610-626 (2019).
- Carnevale, M. E., et al. The novel N, N-bis-2-hydroxyethyl-2-aminoethanesulfonic acid-gluconate-polyethylene glycol-hypothermic machine perfusion solution improves static cold storage and reduces ischemia/reperfusion injury in rat liver transplant. Liver Transplantation. 25 (9), 1375-1386 (2019).
- Von, C., Horn, H., Zlatev, J., Pletz, B., Lüer, T., Minor, Comparison of thermal variations in post-retrieval graft conditioning on rat livers. Artificial Organs. 46 (2), 239-245 (2022).
- Tomizawa, M., et al. Oncostatin M in William’s E medium is suitable for initiation of hepatocyte differentiation in human induced pluripotent stem cells. Molecular Medicine Reports. 15 (5), 3088-3092 (2017).
- Dondossola, D., et al. Human red blood cells as oxygen carriers to improve ex-situ liver perfusion in a rat model. Journal of Clinical medicine. 8 (11), (2019).
- Jägers, J., Wrobeln, A., Ferenz, K. B. Perfluorocarbon-based oxygen carriers: from physics to physiology. European Journal of Physiology. 473 (2), 139-150 (2021).
- Jia, J., et al. A promising ex vivo liver protection strategy: machine perfusion and repair. Surgery and Nutrition. 8 (2), 142-143 (2019).
- Jennings, H., et al. The immunological effect of oxygen carriers on normothermic ex vivo liver perfusion. Frontiers in Immunology. 13, 833243 (2022).
- Kim, J. S., et al. Carbamazepine suppresses calpain-mediated autophagy impairment after ischemia/reperfusion in mouse livers. Toxicology and Applied Pharmacology. 273 (3), 600-610 (2013).
- Imber, C. J., et al. Advantages of normothermic perfusion over cold storage in liver preservation. Transplantation. 73 (5), 701-709 (2002).
- Tolboom, H., et al. Recovery of warm ischemic rat liver grafts by normothermic extracorporeal perfusion. Transplantation. 87 (2), 170-177 (2009).
- Rigo, F., Navarro-Tableros, V., De Stefano, N., Calleri, N., Romagnoli, A. Ex vivo normothermic hypoxic rat liver perfusion model: an experimental setting for organ recondition and pharmacological intervention. Methods in Molecular Biology. 2269, 139-150 (2021).
- van Dyk, J. C., Pieterse, G. M., van Vuren, J. H. Histological changes in the liver of Oreochromis mossambicus (Cichlidae) after exposure to cadmium and zinc. Ecotoxicology and Environmental Safety. 66 (3), 432-440 (2007).
