JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
유전학

Ежедневные переносы, архивирование популяций и измерение приспособленности в долгосрочном эволюционном эксперименте с Escherichia coli

Published: August 18, 2023
doi:
10.3791/65342
, , , , , ,
1Department of Molecular Biosciences,The University of Texas at Austin, 2BEACON Center for the Study of Evolution in Action,Michigan State University, 3Department of Microbiology and Molecular Genetics,Michigan State University, 4Department of Integrative Biology,Michigan State University, 5Biological Sciences Program,Michigan State University

Summary

Этот протокол описывает, как поддерживать эксперимент по долгосрочной эволюции Escherichia coli (LTEE), выполняя его ежедневные переносы и периодические замораживания, а также как проводить соревновательные анализы для измерения улучшения приспособленности эволюционировавших бактерий. Эти процедуры могут служить шаблоном для исследователей, начинающих свои собственные эксперименты по эволюции микробов.

Abstract

Долгосрочный эволюционный эксперимент (LTEE) наблюдал за двенадцатью популяциями Escherichia coli , поскольку они адаптировались к простой лабораторной среде в течение более 35 лет и 77 000 бактериальных поколений. Установка и процедуры, используемые в LTEE, олицетворяют надежные и воспроизводимые методы изучения эволюции микробов. В этом протоколе мы сначала описываем, как популяции LTEE переносятся в свежую среду и культивируются каждый день. Затем мы описываем, как популяции LTEE регулярно проверяются на наличие возможных признаков загрязнения и архивируются, чтобы обеспечить постоянную замороженную «летопись окаменелостей» для последующего изучения. Многочисленные меры безопасности, включенные в эти процедуры, предназначены для предотвращения загрязнения, обнаружения различных проблем при их возникновении и восстановления после сбоев без заметного замедления хода эксперимента. Одним из способов мониторинга общего темпа и характера эволюционных изменений в LTEE является измерение конкурентной пригодности популяций и штаммов из эксперимента. Мы описываем, как проводятся анализы соревнований по совместной культуре, и предоставляем как электронную таблицу, так и пакет R (fitnessR) для расчета относительной пригодности по результатам. В ходе LTEE поведение некоторых популяций изменилось интересным образом, и новые технологии, такие как полногеномное секвенирование, предоставили дополнительные возможности для изучения того, как развивались популяции. В заключение мы обсудим, как были обновлены исходные процедуры LTEE, чтобы приспособиться к этим изменениям или воспользоваться ими. Этот протокол будет полезен исследователям, которые используют LTEE в качестве модельной системы для изучения связей между эволюцией и генетикой, молекулярной биологией, системной биологией и экологией. В более широком смысле, LTEE предоставляет проверенный шаблон для тех, кто начинает свои собственные эволюционные эксперименты с новыми микробами, окружающей средой и вопросами.

Introduction

В феврале 1988 года Ричард Ленски инокулировал двенадцать колб, содержащих определенную среду для роста с ограниченным содержанием глюкозы, клональными культурами Escherichia coli в Калифорнийском университете в Ирвине1. На следующий день он перенес 1% культуры из каждой колбы в набор новых колб со свежей питательной средой. Это разведение 1:100 позволило бактериальным популяциям увеличиться в 100 раз, прежде чем исчерпать доступную глюкозу, что соответствует примерно 62/3 поколениям клеточных делений. Эта процедура была повторена на следующий день и с тех пор повторяется каждый день с небольшими перерывами. Эти ежедневные переводы продолжались, даже несмотря на то, что эксперимент был перенесен сначала в Университет штата Мичиган в 1992 году, а затем в Техасский университет в Остине в 2022 году. Все это время новые мутации непрерывно генерировали генетические вариации в этих популяциях кишечной палочки , и естественный отбор привел к тому, что эволюционировавшие клетки превзошли своих предков.

Ленски разработал этот эксперимент, теперь известный как Долгосрочный эволюционный эксперимент (LTEE), чтобы исследовать динамику и повторяемость эволюции. Чтобы ответить на эти вопросы, он включил несколько важных особенностей в конструкцию экспериментальной установки и ее протоколов2. Одной из таких особенностей стал тщательный выбор модельного организма. Первоначальные двенадцать популяций были созданы из отдельных колоний, которые имели непосредственного общего предка, штамм Escherichia coli B REL606. Этот штамм был выбран потому, что он уже широко использовался в лабораторных условиях, размножался полностью бесполым путем и не содержал плазмид или интактных профагов 3,4 — все это упрощает изучение его эволюции. Другим вариантом, который упростил эксперимент, было использование очень низкой концентрации глюкозы в питательной среде, чтобы ограничить плотность клеток в каждой колбе после роста. Использование низкой плотности клеток было предназначено для облегчения анализа изменений в приспособленности популяций за счет снижения потенциала эволюции экологических взаимодействий внутри популяций (например, путем перекрестного кормления)5.

REL606 не может использовать ʟ-арабинозу в качестве источника углерода и энергии (Ara-) из-за точечной мутации в гене araA . Перед запуском LTEE спонтанный мутант с восстановленной последовательностью araA , обозначенный REL607, был выделен из REL6066. REL607 способен расти на ʟ-арабинозе (Ara+). REL606 использовался для запуска шести популяций LTEE, а REL607 использовался для запуска остальных шести. Арабиноза отсутствует в питательной среде, используемой во время LTEE, поэтому REL607 ведет себя так же, как REL606 в этих условиях. Однако при нанесении на агар из тетразолия арабинозы (ТА) клетки Ara– и Ara+ образуют красные и белые колонии соответственно. Этот метод различения двух предковых штаммов кишечной палочки и их потомков весьма полезен. Его можно использовать для обнаружения перекрестного загрязнения между популяциями LTEE. Это также помогает измерить приспособленность штамма или популяции Ara− по отношению к штамму Ara+ , когда они конкурируют друг с другом. Приспособленность измеряется путем создания совместной культуры противоположно отмеченных конкурентов, а затем мониторинга того, как частоты красных и белых колоний (полученных путем распределения разведения культуры на пластинах ТА) изменяются между тем, когда конкуренты изначально смешиваются, и после одного или нескольких циклов роста в тех же условиях, что и LTEE. Представленность более подходящего типа клеток будет увеличиваться в течение каждого цикла роста.

Еще одна важная особенность LTEE заключается в том, что образцы эволюционирующих популяций периодически архивируются. При смешивании с криопротектором, таким как глицерин, клетки кишечной палочки могут быть заморожены, а затем восстановлены7. В рамках протокола LTEE каждый 75-й день (что соответствует примерно 500 поколениям) часть каждой популяции, которая не была переведена в новую колбу, смешивается с глицерином, разделяется между несколькими флаконами и хранится в морозильной камере. Эта замороженная «летопись окаменелостей» позволила исследователям провести первые исследования LTEE, в которых они возродили эволюционировавшие популяции E. coli из разных временных точек и конкурировали их с предковыми штаммами, чтобы отслеживать, насколько быстро растет приспособленность1. Эволюция приспособленности периодически пересматривалась по мере того, как сохранялось больше «слоев» замороженной «летописи окаменелостей». Общий вывод из этих измерений заключается в том, что пригодность в LTEE продолжает улучшаться и по сей день, даже после стольких поколений эволюции в одной и той же среде 8,9,10.

Что позволило LTEE продолжаться так долго? Многие из тех же функций, которые позволяли задавать первоначальные вопросы и отвечать на них, также служили мерами безопасности и отказоустойчивостью от неизбежных сбоев из-за невезения, человеческой ошибки и мировых событий. Каждый день, когда культуры переносятся на свежую питательную среду, исследователь, выполняющий переносы, чередуется между популяциями Ara– и Ara+. Затем, когда популяции замораживаются, они могут быть нанесены на селективный и индикаторный агар, чтобы проверить, не были ли какие-либо «соседние» популяции случайно перекрестно загрязнены или смешаны (например, белые колонии находятся в популяции, которая должна образовывать только красные колонии) или загрязнены чужеродными микробами (например, неожиданная морфология колоний или плотность клеток). В случае, если популяция была скомпрометирована, ее прародитель может быть возрожден из морозильной камеры и перенесен на его место. Таким образом, маркеры Ara и замороженный архив служат двойным целям как экспериментальные ресурсы, так и меры безопасности.

Поскольку его история так хорошо сохранилась и легко доступна, образцы LTEE были изучены с использованием технологий, которых не существовало на момент начала эксперимента. Например, полногеномное секвенирование использовалось для изучения динамики мутаций в популяциях LTEE 11,12,13,14,15, а транскриптомика и рибосомное профилирование использовались для изучения изменений экспрессии генов16,17. Генетические инструменты были использованы для реконструкции штаммов, которые различаются единичными мутациями или комбинациями нескольких эволюционировавших мутаций, чтобы понять их влияние на приспособленность и различные фенотипы 18,19,20,21. Образцы из замороженной «летописи окаменелостей» легко пополняются, так что части или целые копии истории эксперимента могут быть отправлены в другие лаборатории. Образцы LTEE в настоящее время существуют на всех континентах, кроме Антарктиды, и они изучаются исследователями, которые моложе самого эксперимента. Надежные методы LTEE и эволюционировавших образцов и штаммов E. coli из его исторических данных также послужили отправными точками для эволюционных экспериментов, изучающих другие вопросы и среды 22,23,24,25,26,27,28,29.

Figure 1
Рисунок 1: Обзор процедур LTEE. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Здесь мы демонстрируем три основных протокола, используемых в эксперименте по долгосрочной эволюции E. coli (рис. 1). Мы описываем: (1) как выполнять ежедневные переносы, (2) как архивировать образцы популяции и клональные изоляты и (3) как проводить и анализировать анализы конкуренции в кокультуре для измерения различий в приспособленности. Мы надеемся, что эти протоколы будут способствовать дальнейшему использованию ресурсов LTEE и послужат основой для разработки новых экспериментов по эволюции микробов.

Protocol

1. Ежедневная передача населения LTEE ПРИМЕЧАНИЕ: Двенадцать популяций LTEE переносятся ежедневно путем инокуляции свежей среды 1% культур из колб предыдущего дня. Этапы этого процесса кратко изложены на рисунке 1. Шесть популяций Ara- , начавшихся со штамма REL606, обозначаются как от A−1 до A−6, а шесть популяций Ara+ , начиная со штамма REL607, обозначаются от A+1 до A+6. Строгое соблюдение асептической техники, а также графика и порядка перемещения населения сводит к минимуму риск загрязнения и других нарушений. Продезинфицируйте поверхность, на которой будет осуществляться передача LTEE, протерев ее либо 70% этанолом, либо 10% раствором отбеливателя. Зажгите горелку Бунзена, чтобы создать локальный восходящий поток и включить воспламенение стеклянной посуды.ПРИМЕЧАНИЕ: Надевайте лабораторные перчатки для предотвращения загрязнения. Для безопасности вокруг открытого огня очень важно использовать только перчатки, изготовленные из такого материала, как нитрил, который не воспламеняется. Подготовьте тринадцать боросиликатных колб Эрленмейера по 50 мл, укупоренных 20 мл боросиликатных или полипропиленовых стаканов, которые были вымыты и стерилизованы автоклавированием. Проверьте колбы на наличие видимого мусора и замените те, которые не совсем чистые. Пометьте шесть колб от A-1 до A-6 красным маркером, а остальные шесть колб от A+1 до A+6 – черным маркером. Пометьте последнюю оставшуюся колбу, которая будет пустой, датой в формате месяц/день и днем недели. Наполните каждую из 13 колб 9,9 мл среды DM25 с помощью стерильной серологической пипетки объемом 10 мл. Зажгите горлышко каждой колбы после снятия стакана, служащего крышкой, и перед заменой стакана. Зажгите наконечник пипетки между наполнением каждой колбы.ПРИМЕЧАНИЕ: Инструкции по изготовлению DM25 доступны в Интернете30. Если вы используете пластиковую серологическую пипетку, откажитесь от воспламенения ее наконечника или ограничьте время нахождения в пламени, чтобы избежать расплавления пластика. Извлеките колбы LTEE предыдущего дня из встряхивающего инкубатора. Осмотрите каждую колбу, поднеся ее к свету, чтобы оценить ее мутность и цвет, проверить целостность колбы и найти наличие посторонних предметов.ПРИМЕЧАНИЕ: Невооруженным глазом все культуры Ara- и Ara+ будут выглядеть слегка мутными по сравнению с заготовкой, за исключением A-3, которая будет в ~ 10 раз более мутной, чем другие, из-за роста цитрата в среде. Многие внешние микробные загрязнители также могут расти на цитрате, поэтому повышенная мутность в популяциях, отличных от A-3, вероятно, указывает на загрязнение. В разделе «Репрезентативные результаты» см. изображения культур LTEE перед передачей. НЕОБЯЗАТЕЛЬНО: Подтвердите, что каждая культура LTEE имеет ожидаемую мутность, пипетируя 1 мл заготовки и 1 мл каждой культуры в пластиковые кюветы диаметром 1 см и снимая показания оптической плотности на длине волны 600 нм (OD600) с помощью спектрофотометра после гашения прибора.ПРИМЕЧАНИЕ: Этот дополнительный шаг может быть полезен для исследователей, которые плохо знакомы с LTEE и не уверены в том, как судить о мутности на глаз, а также для документирования и расследования предполагаемых аномалий. Отбирайте пробы для измерения OD600 из колб предыдущего дня только после завершения обычного дневного переноса в новые колбы (следующие шаги), чтобы свести к минимуму риск загрязнения клеточных популяций, которые будут продолжать размножаться, если значения OD600 будут такими, как ожидалось. Типичные значения OD600 для культур LTEE см. в разделе «Репрезентативные результаты ». Используя микропипеттор P200 со стерильным фильтрующим наконечником, перенесите 100 мкл культуры из каждой колбы LTEE в соответствующую колбу, содержащую свежий DM25. Начните с A−1, затем перенесите A+1. После этого продолжайте чередование популяций − и +. Чтобы отслеживать, какие культуры были перенесены, смещайте колбы влево после пипетки с них или на них.ПРИМЕЧАНИЕ: Строгий порядок переноса и чередования между популяциями Ara- и Ara+ помогает предотвратить и обнаружить перекрестное загрязнение и путаницу. Соблюдайте строгую асептическую технику: используйте свежий наконечник пипетки для каждой передачи, воспламеняйте горлышки колб сразу после снятия крышки и перед повторным использованием, а также протирайте ствол и эжектор микропипетки безворсовой бумажной салфеткой, смоченной 70% этанолом между каждой передачей. Отбеливатель никогда не следует использовать для дезинфекции микропипеток, так как даже следовые количества могут убить культуры. Инкубируйте только что инокулированные колбы при 37 ° C в течение 24 ± 1 ч с орбитальным встряхиванием 120 об / мин на диаметре 1 дюйм. Храните культуры предыдущего дня при температуре 4 °C. Храните эти резервные языки и региональные параметры в течение двух дней. В это время откажитесь от старых культур, которые были сохранены при температуре 4 ° C за три дня до этого.ПРИМЕЧАНИЕ: Культуры предыдущих двух дней предоставляют два полных набора резервных копий, с помощью которых можно возобновить эксперимент, если это необходимо, если произойдет какая-либо проблема или несчастный случай, или если загрязнение культур предыдущего дня будет обнаружено до переноса (например, странная окраска или неожиданные частицы). Введите время, дату, номер перевода, имя или инициалы исследователя, который выполнял передачи, были ли культуры в порядке, а также любую другую соответствующую информацию в записной книжке журнала передачи. Переходите к шагам 1.12-1.14, если происходит какая-либо из следующих ситуаций: (1) заготовка предыдущего дня загрязнена, (2) колба или ее крышка треснули или сломаны, (3) колба содержит посторонний материал, (4) колба опрокидывается или падает во время переноса, или (5) есть какое-либо другое событие или наблюдение, которое делает продолжение из этих колб сомнительным. Если есть какие-либо проблемы, несчастные случаи или подозрения на загрязнение культурами LTEE предыдущего дня, не переносите от них. Вместо этого храните весь набор из двенадцати культур при температуре 4 ° C для последующего изучения и дальнейшей характеристики. Извлеките колбы с резервными культурами, которые были перенесены накануне и хранились при температуре 4 °C. Положите их на столешницу, чтобы они прогрелись до комнатной температуры. Аккуратно перемешайте каждую колбу, чтобы ресуспендировать клетки. Пересадитесь из резервных колб в новый набор колб, содержащих свежую среду, и продолжайте эксперимент в обычном режиме, как описано на этапах 1.6-1.11. Отметьте в журнале передачи, что использовались резервные языки и региональные параметры, и запишите тот же номер передачи, что и накануне.ПРИМЕЧАНИЕ: Даже если проблема отмечена только в колбе одной популяции, перенесите все двенадцать популяций из резервных колб так, чтобы количество поколений, прошедших во всех популяциях, оставалось в фазе. Если в резервных колбах, хранящихся при температуре 4 °C, обнаружено загрязнение, то пораженные популяции LTEE должны быть перезапущены из замороженных запасов с использованием процедуры, описанной в шагах 3.1-3.2 для образцов населения. Номер передачи для LTEE не должен увеличиваться до тех пор, пока не вырастут первые культуры в DM25 после возрождения. 2. Архивирование популяций LTEE ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы популяций LTEE замораживаются каждые 75 передач. Популяции растут ~ 6 2/3 поколений каждый день после 100-кратного разведения переноса, поэтому этот период соответствует ~ 500 поколениям. Во время архивирования популяции LTEE также наносятся на различные типы агаровых сред для проверки на загрязнение. При желании репрезентативные клоны могут быть выбраны из этих пластин и заархивированы в это время. Эти шаги кратко изложены на рисунке 1. За день до запланированного замораживания или за несколько дней до него подготовьте три типа агаровых пластин: минимальную глюкозу (MG), минимальную арабинозу (MA) и тетразолиум арабинозу (TA). Сделайте двенадцать тарелок каждого вида агара, плюс несколько дополнений. Также приготовьте, по меньшей мере, 250 мл 0,85% (мас./об.) стерильного физиологического раствора и 50 мл 80% (об./об.) стерильного глицерина.ПРИМЕЧАНИЕ: Рецепты для всех сред и растворов доступны в Интернете30. За день до того, как LTEE достигнет поколения, кратного 500 для обычного графика архивирования, это 74-й день с момента последнего замораживания плюс любые дни, которые были добавленыиз-за переносов из резервных колб 4 ° C, когда были обнаружены или подозревались проблемы. НЕОБЯЗАТЕЛЬНО: При архивировании клональных изолятов из популяций LTEE подготовьте дополнительные расходные материалы: для выделения трех клонов из каждой популяции требуется 72 MG-планшета, 80 мл 80% (об./об.) глицерина и 370 мл DM1000. Подготовьте дополнительный набор из двенадцати колб при выполнении шага 1.2 ежедневных передач LTEE за день до запланированного замораживания. Пометьте шесть дополнительных колб от xA-1 до xA-6 красным маркером, а остальные шесть xA+1 – xA+6 черным маркером.ПРИМЕЧАНИЕ: «x» указывает на то, что дополнительный набор колб будет использоваться для архивирования, и отличает их от другого набора колб, которые будут использоваться для продолжения ежедневных передач LTEE параллельно. Заполните каждую из дополнительных колб, которые будут использоваться для архивирования, 14,85 мл DM25 с помощью серологической пипетки объемом 25 мл при выполнении шага 1.4 ежедневных передач LTEE. Завершите обычную передачу LTEE, как описано в шагах 1.5−1.11. Затем повторите инструкции для шага 1.8, но на этот раз перенесите 150 мкл из каждой из культур LTEE предыдущего дня в дополнительные колбы по 14,85 мл свежего DM25, которые будут использоваться для архивирования.ПРИМЕЧАНИЕ: На этом и всех последующих этапах избегайте загрязнения и путаницы, следуя этим рекомендациям. Начните с популяции A−1, затем перенесите A+1, а затем продолжайте чередовать популяции − и +. При переключении между популяциями протирайте ствол и эжектор микропипеттора безворсовой бумажной салфеткой, смоченной 70% этанолом. Перекладывайте колбы и пробирки в лотки или стойки после пипетки с них или на них, чтобы отслеживать, какие переносы были завершены. Инкубируйте набор из двенадцати колб для архивирования при 37 °C в течение 24 ± 1 ч с орбитальным встряхиванием 120 об/мин диаметром 1 дюйм вместе с двенадцатью культурами LTEE и заготовкой, как описано на шаге 1.9. Подготовьте материалы для покрытия популяций LTEE не менее чем за час до того, как передача LTEE должна быть выполнена в день замораживания.Выберите двенадцать агаровых пластин MG, двенадцать MA и двенадцать TA. Визуально осмотрите каждый из них, чтобы убедиться, что на нем нет явных загрязнений. Пометьте по одной пластине каждого типа для каждой из двенадцати популяций LTEE (от A-1 до A+6).ПРИМЕЧАНИЕ: При маркировке тарелок пишите по бокам дна чашки Петри. Это важно для того, чтобы не затенять колонии, когда кто-то хочет рассмотреть или сфотографировать их из-под агара. Не пишите на крышках, так как их можно перепутать. Поместите агаровые пластины в инкубатор с температурой 37 °C не менее чем на 20 минут, чтобы нагреть их перед использованием на шаге 2.10. Подготовьте 24 пробирки, содержащие 9,9 мл физиологического раствора. Разложите их в двенадцать наборов по две трубочки в каждом. Маркируйте каждый из двух наборов из двенадцати пробирок так же, как и планшеты, добавляя «1» или «2» под идентификатором популяции LTEE, чтобы обозначить порядок, в котором они будут использоваться для разведения этой популяции. Выполните шаги 1.1-1.11 с помощью колб, которые будут продолжать ежедневные передачи LTEE в обычном режиме. На шаге 1.5 также извлеките из встряхивающего инкубатора двенадцать колб с дополнительными культурами для архивирования. Пипетка 100 мкл культуры из каждой из двенадцати дополнительных колб для архивирования в первую пробирку физиологического раствора в паре для этой популяции LTEE. Тщательно перемешайте трубки с этими 100-кратными разведениями. Затем пипеткой по 100 мкл от каждого до соответствующей второй пробирки физиологического раствора. Тщательно перемешайте последние 10 000-кратные разбавления культуры. Пипетка 80 мкл из каждой пробирки, содержащей 10 000-кратное разведение культуры, на меченые планшеты TA, MG и MA для этой популяции. Равномерно распределите жидкость по поверхности агара, используя либо стерильный разбрасывающий стержень, либо стерильные растекающиеся шарики, в зависимости от предпочтений. Повторяйте до тех пор, пока все двенадцать популяций не будут нанесены на все три типа носителей. При необходимости дайте пластинам высохнуть, пока на агаре не станет видно жидкости. Поместите тарелки вверх дном (агаровой стороной вверх) в гравитационный конвекционный инкубатор с температурой 37 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: Перевернутые инкубационные пластины предотвращают высыхание агара и предотвращают попадание конденсата на поверхность агара. Движение клеток в жидкости на поверхности агара во время инкубации может привести к размазыванию колоний и неправильному подсчету колоний. Добавьте 3 мл стерильного 80% (об./об.) глицерина в каждую из двенадцати дополнительных колб, предназначенных для архивирования. Тщательно перемешайте, взбалтывая и осторожно перемешивая. Распределите смесь из каждой колбы по стерильным криовилам, которые были помечены уникальным идентификатором образца, популяцией LTEE, к которой принадлежит образец, поколением, при котором он был заморожен, что это смешанный (популяционный) образец, и датой. Пипетка по 6 мл в один большой флакон и по 1,25 мл в каждый из шести маленьких флаконов.ПРИМЕЧАНИЕ: Большой флакон является рабочим материалом. Один маленький флакон является запасным на случай, если рабочий запас исчерпан или загрязнится. Остальные пять маленьких флаконов — это копии, которые можно отправить в другие лаборатории. Заморозьте заполненные флаконы при температуре -80 °C. Изучите и задокументируйте рост и морфологию колоний на планшетах TA, MG и MA после 24 и 48 часов инкубации.ПРИМЕЧАНИЕ: В разделе « Репрезентативные результаты » приведены изображения и описания колоний, образованных предками REL606 и REL607 и каждой из двенадцати популяций LTEE, когда они были покрыты 76 000 поколений. НЕОБЯЗАТЕЛЬНО: При архивации клональных изолятов выполните следующие действия.Выберите три клональных изолята (колонии) для каждой популяции LTEE из планшетов MG, нанесите каждую отдельно на новую пластину MG и инкубируйте эти пластины в течение 16-24 ч при 37 ° C.ПРИМЕЧАНИЕ: Если присутствуют колонии с разной морфологией, стандартной практикой в LTEE является отбор проб для максимального разнообразия, сначала выбирая наиболее распространенный тип, а затем отбирая дальнейшие колонии из типов меньшинств. Можно также использовать стратегию случайной выборки, отмечая точки на нижней стороне дна чашки Петри перед распространением клеток, а затем выбирая изолированную колонию, ближайшую к каждой отметке после роста. На следующий день нанесите репрезентативную колонию из каждой пластины на новую пластину MG и инкубируйте эти пластины в течение 16-24 ч при 37 ° C. На следующий день инокулируют по одной изолированной колонии из каждой пластины MG в колбу, содержащую 10 мл свежего DM1000. Кроме того, наполните одну дополнительную колбу 10 мл DM1000, чтобы она служила неинокулированной заготовкой для проверки на загрязнение среды. Инкубируйте колбы при 37 ° C в течение 16-24 часов с орбитальным встряхиванием 120 об / мин на диаметре 1 дюйм. После инкубации добавьте 2 мл стерильного 80% (об./об.) глицерина в каждую колбу и перемешайте. Распределите аликвоты по 1,25 мл из каждой колбы в небольшие стерильные флаконы, помеченные уникальным идентификатором для каждого клона, его популяции LTEE и поколения происхождения, того, что это клональный образец, и даты. Заморозьте заполненные флаконы при температуре -80 °C. 3. Соревновательные анализы пригодности ПРИМЕЧАНИЕ: В LTEE репродуктивная пригодность количественно определяется с точки зрения относительного числа удвоений, которые различные бактерии достигают в течение одного или нескольких 24-часовых циклов культивирования в тех же условиях, что и ежедневные переносы. В частности, относительная приспособленность одного конкурента к другому – это отношение их реализованных темпов удвоения, когда они соревнуются лицом к лицу в совместной культуре. Каждый конкурент в паре может быть полной популяцией или клональным изолятом, который ранее был заархивирован как часть замороженной «летописи окаменелостей» LTEE. В качестве альтернативы, один или оба конкурента могут быть клоном, который был генетически модифицирован для добавления или удаления определенных мутаций для проверки их эффектов. Два конкурента должны иметь противоположные состояния Ara+/Ara- , потому что этот генетический маркер используется для их дифференциации во время этого анализа. Общий рабочий процесс конкурсного анализа показан на рисунке 2. Продолжительность фазы совместного культивирования может быть увеличена с одного до трех (или более) дней, чтобы повысить точность оценок пригодности при тестировании различий между конкурентами, которые почти равны. Другие критические соображения и возможные модификации этого протокола см. в разделе «Обсуждение ». Рисунок 2: Блок-схема анализа конкуренции. Показана полная процедура проведения однодневного конкурсного анализа. Трехдневная процедура продолжается альтернативным путем в 1-й и 2-й дни до покрытия в 3-й день так же, как показано на рисунке в 1-й день однодневного соревнования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Подготовьте расходные материалыРешите, сколько конкурирующих штаммов и/или популяций LTEE будет использовано и сколько повторных анализов конкуренции будет выполнено для каждой пары конкурентов. Подготовьте необходимые расходные материалы, как описано в следующих шагах.ПРИМЕЧАНИЕ: Рецепты для всех сред и растворов доступны в Интернете30. Колбы и пробирки, необходимые для всех дней соревновательного эксперимента, могут быть заполнены заранее или по мере необходимости в дни, когда они будут использоваться. Если колбы и пробирки заполнены заранее, храните их при комнатной температуре в темноте, чтобы свести к минимуму испарение. Тарелки ТА должны быть подготовлены как минимум за два дня до того, как они будут использоваться, чтобы они могли достаточно высохнуть после заливки, чтобы можно было разбавлять культуру. Всегда готовьте несколько дополнительных колб, пробирок и планшетов ТА, чтобы эксперимент можно было продолжить, если есть ошибки пипетки, загрязненные пластины или другие незначительные неудачи. В день пробуждения (день −2) наполните одну стерильную колбу Эрленмейера объемом 50 мл, закрытую стаканом объемом 20 мл, 9,9 мл DM1000 или лизогенного бульона (LB) на штамм или популяцию кишечной палочки , которая будет использоваться в качестве конкурента. Наполните еще одну колбу 9,9 мл той же среды, чтобы она служила неинокулированной заготовкой. В течение дня предварительного кондиционирования (день −1) заполните одну пробирку 9,9 мл 0,85% (мас./об.) стерильного физиологического раствора на каждого конкурента, две колбы с 9,9 мл DM25 на повторный анализ между парой конкурентов и еще одну колбу с 9,9 мл DM25 для заготовки. В день начала соревнований (День 0) наполните одну колбу 9,9 мл DM25, заполните одну пробирку 9,9 мл 0,85% (мас./об.) стерильного физиологического раствора и подготовьте по одной тарелке ТА на повторение соревновательного анализа. Наполните еще одну колбу 9,9 мл DM25, чтобы она служила заготовкой. АЛЬТЕРНАТИВА: На каждый день многодневного соревнования после первого заполняйте одну колбу 9,9 мл DM25 на повторение соревнований и заполняйте еще одну колбу 9,9 мл DM25 для заготовки. В последний день соревнований (например, в 1-й или 3-й день) заполните две пробирки 9,9 мл 0,85 % (мас./об.) стерильного физиологического раствора и подготовьте по одной тарелке ТА на каждую соревновательную реплику. День −2: Оживляйте конкурентов отдельно в DM1000 или LBДля каждого из участников наклейте этикетку на колбу, наполненную 9,9 мл DM1000 или LB. Маркируйте дополнительную колбу, наполненную 9,9 мл из той же партии среды, которая будет служить неинокулированной заготовкой для проверки на загрязнение.ПРИМЕЧАНИЕ: Замороженные запасы восстанавливаются в LB или DM1000 для более равномерного и предсказуемого восстановления криоконсервированных клеток. Глицерин, используемый в качестве криопротектора, может метаболизироваться кишечной палочкой, что приведет к более высокой плотности клеток, чем ожидалось, если образцы будут восстановлены в DM25. LB и DM1000 поддерживают рост до такой высокой плотности клеток, что это осложнение становится незначительным. Извлеките криопрепараты, содержащие замороженные запасы конкурирующих штаммов, из морозильной камеры при температуре -80 °C. Храните флаконы охлажденными в ведре со льдом во время их использования. После того, как каждый замороженный бульон оттает, тщательно перемешайте его, чтобы ресуспендировать клетки кишечной палочки . При реанимации клона инокулируйте колбу, содержащую свежую среду, 12 мкл замороженного бульона. Если вы возрождаете популяцию, привите колбу 120 мкл замороженного запаса.ПРИМЕЧАНИЕ: Объем замороженного сырья 120 мкл используется для популяций, так что количество оживляемых клеток примерно такое же, как ежедневное узкое место, когда 1% популяции LTEE переносится в новую колбу. Многократное размораживание и встряхивание замороженных запасов может вызвать стресс у клеток и со временем снизить жизнеспособность запасов. Если данная популяция или клон LTEE будет использоваться в соревнованиях несколько раз, хорошей практикой является повторное выращивание и замораживание нескольких копий запасов, чтобы ни одна из них не была разморожена и повторно заморожена много раз. Инкубируйте колбы возрождения и заготовку при 37 ° C в течение ночи (16-24 часа) с орбитальным встряхиванием 120 об / мин на диаметре 1 дюйм. День −1: Подготовка участников отдельно в DM25Для каждого участника наклейте этикетку на пробирку, заполненную 9,9 мл физиологического раствора. Для каждого повторного соревновательного анализа между парой конкурентов пометьте две колбы по 50 мл, наполненные 9,9 мл DM25, каждая с номером репликации и именем одного из участников. Наклейте этикетку на одну дополнительную колбу, наполненную 9,9 мл DM25, чтобы она служила заготовкой. Достаньте из инкубатора колбы с культурами оживших конкурентов. Исследуйте их мутность на глаз, чтобы убедиться, что они выросли и что нет явного загрязнения. Пипетка по 100 мкл из каждой колбы в пробирку с физиологическим раствором для этого конкурента.ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг разбавляет культуру в 100 раз, что необходимо, потому что плотность клеток намного выше в LB и DM1000, чем в среде DM25, используемой в LTEE (см. Репрезентативные результаты). Тщательно перемешайте каждую пробирку для разбавления непосредственно перед пипеткой 100 мкл из разбавленной культуры в колбу со свежим DM25. Инокулируйте две из этих колб предварительного кондиционирования для каждого повторного анализа, по одной для каждого из конкурентов. Инкубируйте колбы предварительного кондиционирования и заготовку при 37 °C в течение 24 ± 1 ч при встряхивании орбиты 120 об/мин диаметром 1 дюйм. День 0: Начните соревнование, смешав конкурентов и тарелку для начального подсчетаДля каждого повторного анализа соревнований маркируйте одну колбу, наполненную 9,9 мл DM25, и одну пробирку, заполненную 9,9 мл физиологического раствора. Маркируйте колбы и пробирки таким образом, чтобы однозначно идентифицировать каждую пару конкурентов и повторный номер конкурсной пробы. Наклейте этикетку на одну дополнительную колбу, наполненную 9,9 мл DM25, чтобы она служила заготовкой. Достаньте колбы для предварительного кондиционирования из инкубатора. Исследуйте их мутность на глаз, чтобы убедиться, что они выросли и что нет явного загрязнения. Перелейте 50 мкл конкурента Ara− в первую колбу для повторения конкурса, наполненную свежим DM25. Немедленно перелейте 50 мкл конкурента Ara+ в ту же соревновательную колбу и перемешайте, осторожно перемешивая. Повторите шаг 3.4.3 для всех реплик всех пар конкурентов.ПРИМЕЧАНИЕ: Соревновательные колбы теперь имеют общее 100-кратное разведение культур E. coli , выращенных в DM25, те же клетки состояния в опыте LTEE после каждого ежедневного переноса. Важен порядок выполнения переносов и микширования. Добавляйте обоих конкурентов в каждую колбу сразу по одному, чтобы ни один из них не получил фору при выращивании в свежей среде. Например, не добавляйте культуры Ara− во все колбы для соревнований, а затем вернитесь и добавьте все штаммы Ara+ . Пипетку 100 мкл из каждой вновь инокулированной соревновательной колбы в пробирку с физиологическим раствором, меченым для этого анализа конкуренции, реплицируют так, чтобы каждая из этих пробирок содержала общее 10 000-кратное разведение предварительно кондиционированных культур DM25, которые были объединены. Поместите соревновательные колбы и заготовку в встряхивающий инкубатор. Инкубируйте соревновательные колбы при 37 °C в течение 24 ± 1 ч при встряхивании орбиты 120 об/мин диаметром 1 дюйм. В тот же день, сразу после помещения соревновательных колб в инкубатор, тщательно перемешайте каждую пробирку с шага 3.4.5 и распределите 80 мкл этих 10 000-кратных разведений на планшеты ТА, как описано на этапе 2.10. Пометьте нижнюю часть каждой пластины парой штаммов, которые были смешаны, номером репликации и «День 0», чтобы указать, что он будет использоваться для определения первоначального представления каждого конкурента. Инкубируйте пластины ТА вверх ногами в гравитационном конвекционном инкубаторе при 37 ° C до тех пор, пока колонии конкурентов Ara- и Ara+ не станут видимыми и различимыми. Как правило, это происходит в течение 16-24 часов, но для некоторых развившихся штаммов это может занять больше времени. Подсчитайте количество колоний Ara− (красный) и Ara+ (белый) на каждой пластине изапишите результаты.ПРИМЕЧАНИЕ: Различия между цветами колоний Ara- и Ara+ на пластинах TA со временем становятся менее отчетливыми, даже когда пластины хранятся при температуре 4 °C, поэтому их необходимо подсчитывать как можно быстрее после извлечения из инкубатора. Изображения пластин ТА, показывающие типичный внешний вид колоний, образованных клетками Ara- и Ara+ , включены в репрезентативные результаты. В этом разделе также есть изображения общих колоний «крайнего случая» (например, перекрытие или рост разных типов колоний) и объясняется, как их считать. Если скорость роста и морфология колоний, образованных на пластинах ТА каким-либо из конкурентов, ранее не были охарактеризованы, распределите 80 мкл 10 000-кратного разбавления в физиологическом растворе из колб предварительного кондиционирования в день 0, когда конкуренты все еще отделены друг от друга. Затем исследуйте колонии на этих контрольных пластинах после инкубации при 37 ° C в течение 16-24 ч или дольше. АЛЬТЕРНАТИВА: Дни 1 и 2: Продолжение трехдневного соревнованияДля каждого повторного анализа конкурса маркируйте одну колбу, наполненную 9,9 мл DM25. Маркируйте колбы таким образом, чтобы однозначно идентифицировать каждую пару участников, номер реплики и день проведения конкурса. Наклейте этикетку на одну дополнительную колбу, наполненную 9,9 мл DM25, чтобы она служила заготовкой. Достаньте из инкубатора соревновательные колбы предыдущего дня. Изучите их мутность на глаз, чтобы проверить ожидаемый рост и обнаружить загрязнение. Перенесите 100 мкл из каждой соревновательной колбы в соответствующую колбу со свежей средой на следующий день соревнований. Поместите новые соревновательные колбы и заготовку в встряхивающий инкубатор. Инкубируйте их при 37 ° C в течение 24 ± 1 ч при встряхивании орбиты 120 об / мин на диаметре 1 дюйм. Повторите шаги 3.5.1-3.5.4 во 2-й день соревнований, прежде чем продолжить. День 1 или 3: Финишное соревнование и тарелка для окончательного подсчетаДля каждой соревновательной колбы подготовьте две пробирки, наполненные 9,9 мл физиологического раствора. Пометьте их таким образом, чтобы однозначно идентифицировать каждую пару конкурентов, количество реплик и то, предназначены ли они для первого или второго разбавления. Достаньте из инкубатора соревновательные колбы. Исследуйте их мутность на глаз, чтобы обнаружить, что они росли и не было явного загрязнения. Пипетка 100 мкл из каждой соревновательной колбы в первую пробирку с физиологическим раствором для этой реплики. Полученные пробирки содержат 100-кратные разведения культур DM25. Вкрутите каждую 100-кратную пробирку для разбавления, чтобы тщательно перемешать ее, и пипетку 100 мкл во вторую пробирку физиологического раствора для повторения. Полученные пробирки содержат 10 000-кратные разведения культур DM25. Тщательно перемешайте каждую пробирку, содержащую 10 000-кратное разведение, и распределите 80 мкл ее на пластине ТА, как описано на шаге 2.10. Пометьте нижнюю часть каждой пластины парой штаммов, которые были смешаны, номером репликации и «День 1» для однодневного соревнования или «День 3» для трехдневного соревнования, чтобы указать, что он будет использоваться для определения окончательного представления каждого участника. Инкубируйте планшеты TA при 37 °C и подсчитайте колонии Ara- и Ara+ после роста, как описано на шаге 3.4.8.ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за повторным номером каждого конкурсного анализа на всех этапах переноса и нанесения покрытия. Путаница в том, какие окончательные и начальные подсчеты соответствуют между различными повторными анализами, даже если одни и те же два конкурента были смешаны в каждом из них, приведет к неправильным оценкам пригодности. Расчет и пригодность участкаЕсли вы используете Excel для расчета и построения графика относительной пригодности, загрузите электронную таблицу XLS (дополнительный файл 1). Если вы используете R, установите пакет31 fitnessR и загрузите шаблон значений, разделенных запятыми (CSV) (дополнительный файл 2), или создайте новую копию этого файла, следуя указаниям в его виньетке. Введите «разбавление переноса» 100 для конкурсных анализов, проводимых в специально отведенной ячейке или столбце в загруженном файле. Введите общее количество ежедневных циклов роста, в течение которых участники совместно культивировались, как «количество переносов» (например, 3 для трехдневного соревнования). Введите имена каждой пары конкурентов в обозначенные ячейки или столбцы с эталонным штаммом как «конкурент1» и тестовым штаммом или популяцией как «конкурент2». Для каждой репликации конкурсного анализа введите соответствующие начальные и конечные подсчеты колоний в назначенные столбцы загруженного файла. При использовании электронной таблицы Excel теперь будет отображаться среднее значение относительной пригодности и 95% доверительные ограничения для этой оценки. Скопируйте результаты по разным комбинациям конкурентов на другой лист и создайте диаграмму, которая суммирует результаты. Если вы используете R для анализа данных, следуйте указаниям в виньетке для пакета fitnessR, чтобы выполнить эти вычисления, вывести CSV-файл с вычисленными значениями и построить график результатов.

Representative Results

Внешний вид и мутность культур LTEEИз-за низкой концентрации глюкозы в DM25 мутность полностью выросших популяций LTEE едва заметна только в одиннадцати из двенадцати колб. При исследовании культур LTEE на глаз на предмет нормального роста и признаков загрязнения (этап 1.6) каждую колбу, содержащую популяцию LTEE, следует сравнивать рядом с заготовкой (рис. 3A). Исключением является популяция A-3, которая эволюционировала, чтобы использовать цитрат в качестве дополнительного источника углерода и энергии и, следовательно, достигает более высокой плотности клеток32. Мутность культур DM25 штаммов-предков REL606 и REL607 аналогична таковой у типичной эволюционировавшей популяции (рис. 3B). Штаммы и популяции LTEE растут до более высокой плотности в DM1000 из-за более высокой концентрации глюкозы и гораздо более высокой плотности в LB (рис. 3B). Плотность культур DM25 популяции A−3 LTEE занимает промежуточное положение между плотностями культур REL606 в DM25 и DM1000 (рис. 3C). Рисунок 3: Внешний вид культур LTEE. (A) Колбы, содержащие двенадцать популяций LTEE после 24 ч роста в DM25 в день, когда эксперимент достиг 76 253 1/3 поколений, изображены рядом с бланком. (B) Колбы, содержащие культуры предков REL606 и REL607, выращенные в течение 24 часов в DM25, DM1000 и LB, изображены рядом с заготовками носителей. (C) Увеличенные изображения тех же колб бок о бок, показывающие, как мутность колбы популяции A-3 в DM25 сравнивается с предком REL606 в DM25 и DM1000. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Показания спектрофотометра оптических плотностей при 600 нм (OD600) культур, выращенных в DM25 (шаг 1.7), соответствуют этим визуальным наблюдениям как для популяций LTEE (рис. 4A), так и для их предков (рис. 4B). Эти показания могут быть использованы для количественного сравнения и документирования роста при подозрении на загрязнение или ошибку. Для измерений популяций LTEE между 76 000 и 76 500 поколениями мы обнаружили, что OD600 A-3, популяции, которая эволюционировала, чтобы расти на цитрате, составляла в среднем 0,223 (0,218-0,227, 95% доверительный интервал). OD600 других одиннадцати популяций составлял в среднем 0,0252 (0,0239-0,0265, 95% доверительный интервал). Наблюдались небольшие, но значимые различия в показаниях OD600 среди одиннадцати нормальных популяций (F 10,88 = 5,1035, p = 7,5×10−6). Популяции LTEE достигают стационарной фазы примерно через 5-6 часов инкубации. Если их перенести утром, рост будет виден к середине-концу дня того же дня. Многие виды микробов способны аэробно расти на цитрате. Таким образом, повышенная мутность в популяциях, отличных от A-3, вероятно, является признаком внешнего загрязнения. Рисунок 4: Мутность культур LTEE. (A) Оптическая плотность при 600 нм (OD600) двенадцати популяций LTEE после 24-часового цикла роста в три разных дня между 76 000 и 76 500 поколениями эксперимента. Значения OD600 трех аликвот по 1 мл в каждый из трех разных дней отображаются в виде точек. Из этих значений было вычтено среднее значение OD600 трех разных аликвот бланка за один и тот же день. Заполненные столбцы показывают средние значения. Полосы погрешности — это 95% доверительные пределы. (B) OD600 культур предков REL606 и REL607 в DM25, DM1000 и LB. Значения OD600 трех аликвот по 1 мл в каждый из трех разных дней двух отдельных культур для каждого состояния и штамма отображаются в виде точек. Из этих значений было вычтено среднее значение OD600 трех разных аликвот бланка за один и тот же день. Заполненные столбцы показывают средние значения, а полосы погрешности являются 95% доверительными пределами. Серые затененные области между панелями показывают, как масштабируется ось OD600 между панелью DM25 и панелями DM1000 и LB. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рост и морфология колоний LTEEПри проверке популяций на загрязнение путем нанесения их на различные среды (этап 2.15) предки REL606 и REL607 и все эволюционировавшие популяции образуют белые колонии с полупрозрачными и несколько неровными краями на агаровых пластинах с минимальным содержанием глюкозы (MG) (рис. 5A). Состав MG-агара такой же, как и у DM25, используемого в ежедневных передачах LTEE, за исключением более высокой концентрации глюкозы, поэтому эволюционировавшие популяции LTEE часто образуют более крупные колонии на MG, чем предки. Из-за более высокой плотности клеток в DM25 популяция A-3 будет иметь в несколько раз больше колоний, если для нее будет выделен тот же объем, что и для других популяций, и это может ограничить размер колоний. Наиболее распространенные типы загрязняющих микробов образуют совершенно белые, непрозрачные и идеально круглые колонии на MG. На агаре с минимальным содержанием арабинозы (MA) предок REL607 и популяции Ara+ обычно образуют слегка полупрозрачные белые колонии. Эта типичная модель роста сохранялась для популяций Ara+ на протяжении 76 000 поколений, за исключением A+6, которая развила дефект роста на арабинозе и больше не образует колонии на MA (рис. 5B). Не существует отбора для поддержания роста арабинозы во время переноса LTEE в DM25, поэтому другие популяции Ara+ также могут в конечном итоге перестать образовывать колонии на агаровых пластинах MA по мере продолжения эксперимента. За исключением A-3, популяции Ara- не образуют колоний на MA-агаре, хотя при внимательном рассмотрении могут быть обнаружены микроколонии из-за следовых питательных веществ в агаре. Популяция А-3 образует многочисленные небольшие колонии на МА, так как эти клетки могут расти на цитрате, который также присутствует в этой среде. Колонии загрязняющих веществ на МА встречаются редко. Рисунок 5: Покрытие популяций LTEE для обнаружения загрязнения. Разведения предков REL606 и REL607 и двенадцати популяций LTEE в день, когда эксперимент достиг 76 026 2/3 поколений, были нанесены на агаровые пластины (A) MG, (B) MA и (C) TA и сфотографированы через 24 ч и 48 ч. Одинаковые разведения были сделаны для всех культур, но для предков был выделен вдвое меньший объем, чем описано в протоколе для популяций LTEE, чтобы в некоторой степени объяснить их более высокую плотность клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Ожидается, что на агаре tetrazolium arabinose (TA) предок REL606 и все популяции Ara- образуют красные колонии, в то время как предок REL607 и все популяции Ara+ обычно образуют колонии белого цвета (которые могут включать светло-розовые или персиковые оттенки) (рис. 5C). Предки LTEE образуют крепкие колонии, которые легко идентифицировать как Ara- и Ara+ на агаре TA в течение 16-24 часов. Первоначально эта разница могла быть использована для обнаружения перекрестного загрязнения между популяциями Ara- и Ara+. Тем не менее, агар TA имеет более сложный питательный состав, чем химически определенная среда DM25, используемая в ежедневных переносах, и не было эволюционного давления на E. coli в LTEE, чтобы поддерживать способность к устойчивому росту в этих условиях. Следовательно, некоторые эволюционировавшие популяции LTEE теперь демонстрируют плохой рост на пластинах TA, им требуется 48 часов для формирования колоний или они вообще не растут. Цвета и морфология колоний, сформированных на ТА эволюционировавшими популяциями LTEE, также изменились по сравнению с предками и разошлись друг от друга. Наличие нескольких аберрантных колоний не всегда является признаком заражения. Могут возникать спонтанные мутации, которые переключают состояние маркера Ara штаммов LTEE, особенно с Ara+ на Ara-, из-за более высокой вероятности мутаций с потерей функции, влияющих на использование арабинозы, по сравнению с реверсивными мутациями, которые восстанавливают активность araA. Мутации, переключающие состояния маркера Ara, чаще встречаются в популяциях с развившейся гипермутацией (A−1, A−2, A−3, A−4, A+3 и A+6)13. На ТА-агаре загрязняющие микробы других видов часто (но не всегда) образуют небольшие, идеально круглые колонии с красными центрами, окруженными отчетливыми белыми границами, которые не похожи на те, которые образованы любыми штаммами или популяциями LTEE. Результаты конкурса «Кокультура»Соревнования между всеми парами Ara- и Ara+ двух предков LTEE (REL606 и REL607 соответственно) и образцами популяций A-5 и A+5, заархивированными в 20 000 поколений (REL8597 и REL8604 соответственно), показывают, как колонии с различными состояниями маркеров Ara могут быть дифференцированы и подсчитаны на агаре TA (шаги 3.4.8 и 3.6.6) (рис. 6). Колонии подсчитывались по шести повторным колбам для каждой пары конкурентов до и после однодневных и трехдневных анализов, которые начинались с оживления в DM1000 (таблица 1). Общее количество колоний, наблюдаемых при одном и том же разведении и объемном покрытии, варьируется, с какими конкурентами были смешаны, поскольку культуры эволюционировавших популяций LTEE достигают более низкой плотности клеток, чем культуры предковых штаммов в DM25. Это различие является следствием эволюции увеличения размера клеток, которая произошла во всех популяциях LTEE в течение первых нескольких тысяч поколений эксперимента 8,33. Рисунок 6: Конкурсные анализы, нанесенные на агаровые пластины ТА. Примеры агаровых пластин ТА из конкурсных анализов. REL606 и REL607 являются предками LTEE в Ara- и Ara+ соответственно. REL8597 и REL8604 представляют собой 20 000 популяций поколения A-5 и A+5 соответственно из замороженной «летописи окаменелостей» LTEE. Планшеты ТА, соответствующие одному реплицирующему анализу между каждой парой штаммов, показаны для Дня 0, Дня 1 и Дня 3 соревнований. Пластины были сфотографированы после 24 ч роста при 37°C. Клетки конкурентов REL606 и REL8597 являются Ara- и образуют красные колонии. Клетки конкурентов REL607 и REL8604 являются Ara+ и образуют белые колонии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Большинство колоний на типичной конкурентной тарелке ТА будут хорошо разделены или перекрыты таким образом, что легко подсчитать, сколько первоначально круглых колоний разных типов срослось вместе (рис. 7А). Однако могут возникнуть некоторые ситуации, в которых неочевидно, как подсчитать атипичную колонию или рост, представляющий собой смесь двух цветов. Во-первых, когда белая колония Ara+ и красная колония Ara− перекрываются, колония Ara+ имеет тенденцию разрастаться и охватывать колонию Ara−. В этой ситуации следует считать небольшое красное пятно или полупрозрачный «промежуток» в более крупной колонии Ara+ колонией Ara− колонией Ara− (рис. 7B). Во-вторых, спонтанные мутанты Ара+ будут время от времени возникать в колониях Ара-. Эти мутанты обычно появляются в виде белых секторов (сосочков), которые быстрее распространяются из внутренней части красной колонии, потому что они растут быстрее, как только получают доступ к арабинозе в качестве дополнительного питательного вещества (рис. 7C). Эти колонии с белым сектором считаются одной колонией Ara− и ни одной колонией Ara+. Такая ситуация становится более распространенной, если пластины инкубируются в течение 48 ч или дольше. В-третьих, иногда наблюдаются полупрозрачные розоватые колонии (рис. 7D). Они образованы конкурентом Ара. Наконец, небольшое количество круглых колоний с внутренностями, которые имеют немного другой оттенок красного, иногда вырастают на пластинах ТА, когда они загрязнены несколькими внешними микробными клетками во время приготовления агара или при распределении культуральных разведений по их поверхностям (рис. 7E). Эти колонии загрязняющих веществ не следует подсчитывать. Если есть подозрение на загрязнение конкурентной культуры из-за того, что на любой из ее пластин ТА много атипичных колоний, эту репликацию следует исключить. Рисунок 7: Крайние случаи, встречающиеся при подсчете колоний Ara- и Ara+ на агаре TA. На каждой панели некоторые колонии Ara- и Ara+ , которые должны быть подсчитаны, отмечены сплошными красными и черными стрелками соответственно. Колонии, которые не следует подсчитывать, обозначены пунктирными стрелками, соответствующими тому типу, к которому они относятся. Все фотографии были сделаны после 24 часов инкубации, за исключением панели C. (A) Примеры нормальных колоний Ara- и Ara+ . (B) Примеры колоний Ara+ , зарастающих близлежащими колониями Ara- , включая одну, которая едва видна как прозрачный промежуток снаружи белой колонии. Считайте каждый из этих случаев как две колонии, по одной каждого типа. (C) Примеры колоний Ara- , дающих начало мутантным секторам Ara+ . Считайте каждый случай только одной колонией Ара− . Белый сектор (сосочек), который возникает, возникает из-за мутанта Ara+ , возникающего внутри колонии. Одно и то же поле колоний показано после 24 ч, 48 ч и 72 ч роста. (D) Пример полупрозрачной розовой колонии. Считайте это как Ара-. (E) Примеры колоний, образованных в результате внешнего загрязнения микробом, который не является кишечной палочкой. Они красные, но меньше по размеру и идеально круглые с четкой белой границей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Анализ количества колоний в этих соревнованиях с использованием электронной таблицы Excel (дополнительный файл 1) или путем запуска функций пакета fitnessR в R по подсчету колоний, введенных в шаблон CSV (дополнительный файл 2), показывает, что два предка неразличимы с точки зрения их пригодности с точностью анализа, что популяции A-5 и A+5 поколения 20 000 значительно более приспособлены, чем предки, и что ни одна из эволюционировавших популяций не является значительно более приспособленной, чем другая ( t-критерии Уэлча, p > 0,05) (рис. 8). Точность оценки относительной пригодности улучшается в трехдневных соревнованиях по сравнению с однодневными соревнованиями для одной из близко подобранных пар (REL606 против REL607). Точность этих измерений может быть дополнительно повышена за счет проведения более длительных соревнований с большим количеством циклов роста, если это необходимо. Тем не менее, результаты многодневных соревнований не являются информативными, когда один конкурент становится настолько многочисленным по отношению к другому после дополнительных дней соревнований, что соотношение двух штаммов не может быть точно определено, потому что колоний менее пригодного типа для подсчета очень мало или вообще нет. Так обстоит дело с трехдневными соревнованиями предков против эволюционировавших популяций поколения 20 000 (REL606 против REL8604 и REL607 против REL8597) (рис. 6 и таблица 1). Таблица 1: Количество колоний по соревновательным анализам пригодности. Однодневные и трехдневные соревновательные анализы с шестью повторами были выполнены для всех парных комбинаций двух конкурентов Ara- и двух конкурентов Ara+ . REL606 и REL607 являются предками LTEE в Ara- и Ara+ соответственно. REL8597 и REL8604 представляют собой популяции A-5 и A+5 поколения 20 000 соответственно из замороженной «летописи окаменелостей» LTEE. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу. Рисунок 8: Относительная приспособленность, измеренная с помощью конкурсных анализов. Результаты одно- и трехдневных соревновательных анализов между предками LTEE и 20 000 популяций LTEE поколения A-5 и A+5. На диаграмме слева показаны четыре парных соревнования в виде цветных двунаправленных стрелок. Каждая комбинация двух конкурентов Ara- (красные метки) и двух Ara+ (черные метки) была протестирована с шестикратной репликацией. Количество колоний из таблицы 1 было проанализировано в R с использованием пакетаfitnessR 31, а результаты были построены с использованием пакета ggplot2 (версия 3.4.0)34. Фитнес отображается как участник, к которому направляется стрелка на метке, относительно участника, от которого исходит стрелка (например, REL8604 относительно REL606). Показаны относительные значения пригодности, рассчитанные на основе количества колоний для каждого повторения анализа соревнований (баллы), средние значения относительной пригодности для пары участников (столбцы, заполненные тем же цветовым кодированием, что и диаграмма) и 95% доверительные интервалы (полосы ошибок). Относительные значения приспособленности не могли быть определены (N.D.) для трехдневных соревнований между предками и развитыми популяциями, потому что на пластинах 3-го дня было ноль или очень мало колоний предков (см. Таблицу 1). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Дополнительный файл 1. Файл электронной таблицы Excel для расчета относительной пригодности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный файл 2. Шаблон входного файла значений, разделенных запятыми, для вычисления относительной пригодности в R с помощью пакета fitnessR. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

Долгосрочная устойчивость LTEE и ее методов
Эксперимент по долгосрочной эволюции кишечной палочки (LTEE) продолжается уже четвертый десяток лет. Для эксперимента по эволюции микробов любой продолжительности крайне важно поддерживать воспроизводимую среду, избегать загрязнения, архивировать образцы и точно измерять пригодность. LTEE демонстрирует несколько проверенных временем стратегий для достижения этих целей, включая использование хорошо встряхнутых колб, создающих однородную среду, и химически определенной питательной среды, поддерживающей низкую плотность клеток. Кроме того, LTEE использует штаммы-предки, которые отличаются генетическим маркером, который дает фенотип (цвет колонии), который легко проверяется и избирательно нейтрален в эволюционной среде. Эта особенность экспериментального дизайна обеспечивает средства идентификации внутреннего и внешнего загрязнения и облегчает измерение пригодности. Однако не все процедуры и меры безопасности, которые использовались LTEE с 1988 года, оказались одинаково надежными. Некоторые методы, которые были надежными, когда началась LTEE, стали менее эффективными по мере развития популяций кишечной палочки . К счастью, эти проблемные методы теперь могут быть дополнены или заменены с помощью технологий, разработанных с момента начала эксперимента.

Обнаружение загрязнений
Обнаружение загрязнения имеет решающее значение для LTEE. Загрязнение может быть двух видов: между популяциями LTEE (перекрестное загрязнение) и микробами из окружающей среды (внешнее загрязнение). По большей части, осторожное использование асептических методов и пристальное внимание во время подготовки среды и ежедневной транспортировки предотвращают оба типа загрязнения, но они случаются. В начале эксперимента нанесение покрытия на агар TA может быть использовано для обнаружения случаев перекрестного загрязнения, поскольку переносы всегда чередовались между популяциями Ara– и Ara+. Отпечаток чувствительности и резистентности этих кишечных палочек к определенным бактериофагам также должен был стать конструктивной особенностью, которая могла бы дифференцировать популяции LTEE от широко используемых лабораторных штаммов E. coli, которые могут их заразить4. Однако эти генетические маркеры стали ненадежными по мере продвижения эксперимента (например, некоторые популяции больше не образуют колонии на ТА-агаре)10,35. К счастью, популяции генетически разошлись, поскольку они испытали отдельные эволюционные истории во время эксперимента, который создал новые генетические маркеры, которые теперь можно использовать для обнаружения перекрестного загрязнения. Например, каждая популяция развила уникальную комбинацию мутаций в генах pykF и nadR 14,36,37. Иногда мы амплифицируем ПЦР и секвенируем эти два гена, чтобы проверить, являются ли колонии с необычной морфологией или цветом результатом перекрестного загрязнения. Поскольку затраты на секвенирование всего генома и всей популяции продолжают снижаться, в скором времени может стать возможным рутинное секвенирование популяций LTEE, что открывает новые возможности для мониторинга их на наличие признаков загрязнения.

Измерение соревновательной пригодности
Другой случай, когда LTEE переросла свои первоначальные методы, заключается в том, что приспособленность эволюционировавшей кишечной палочки возросла в экспериментальной среде до такой степени, что больше нельзя напрямую измерить приспособленность современных популяций по сравнению с их предками, используя протокол, описанный здесь. Эволюционировавшие популяции превосходят предков до такой степени, что после однодневного соревнования осталось мало или совсем не осталось колоний предков. Один из подходов к решению этой большой разницы в приспособленности состоит в том, чтобы использовать неравные начальные соотношения штаммов, взвешивая исходные объемы, которые смешиваются в сторону менее подходящего конкурента (например, 90 мкл предка и 10 мкл эволюционировавшего конкурента). Второй подход заключается в том, чтобы идентифицировать эволюционировавший клон Ara–, который имеет более высокую приспособленность, чем предок LTEE, изолировать его спонтанный ревертантный мутант Ara+ путем отбора на агаре MA, а затем убедиться, что ревертантный штамм имеет ту же приспособленность, что и его родитель, используя конкурентный анализ 6,38. Эта новая пара Ara−/Ara+ может быть использована в качестве набора общих штаммов-конкурентов вместо REL606/REL607. В идеале эволюционировавший клон Ara−, выбранный в качестве общего конкурента (и его ревертант Ara+), будет иметь промежуточную приспособленность по отношению ко всем штаммам, представляющим интерес в эксперименте. В течение первых 50 000 поколений LTEE эти два подхода (с использованием неравных начальных коэффициентов или общего конкурента) не давали существенно отличающихся измерений пригодности по сравнению с типичным подходом39.

Эти изменения в протоколе соревнований делают определенные упрощающие допущения, которые не всегда могут быть верными. Одна из них заключается в том, что измерения физической подготовки являются транзитивными. То есть, если мы конкурируем с двумя популяциями по отдельности с общим конкурирующим штаммом, то мы можем сделать вывод об относительной пригодности двух популяций друг к другу. Было обнаружено, что эта связь справедлива для LTEE40, по большей части, но не для других экспериментов41. Одной из причин этого несоответствия может быть эволюция отрицательных частотно-зависимых эффектов приспособленности. Такая ситуация возникает, когда штаммы, выделенные из двух разных расходящихся линий из популяции A-2 LTEE, конкурируют друг с другом19,42. Каждый из них имеет преимущество, когда встречается редко, из-за перекрестного кормления, что стабилизирует их сосуществование. Данные секвенирования, показывающие долгосрочное сосуществование линий с различными наборами мутаций, позволяют предположить, что подобные взаимодействия могли возникнуть и в других популяциях LTEE14,43, хотя неясно, достаточно ли они сильны, чтобы заметно изменить оценки приспособленности. Наконец, эволюция аэробного роста цитрата в популяции A-3 LTEE32 означает, что приспособленность этих клеток теперь включает использование «частного» ресурса, когда они конкурируют с клетками, которые не могут использовать цитрат, что усложняет интерпретацию этих результатов. Несмотря на эти исключения, использование низкой концентрации глюкозы и хорошо встряхнутой среды, несомненно, упростило сравнение приспособленности между штаммами LTEE и популяциями.

В более поздних поколениях некоторые популяции LTEE больше не образуют колонии на агаре TA, что затрудняет или делает невозможным проведение конкурентных экспериментов с использованием даже модифицированных протоколов10. Альтернативные методы, не требующие роста колоний, потенциально могут быть использованы для определения относительного представительства двух конкурентов, такие как FREQ-seq, который использует секвенирование следующего поколения для подсчета доли считываний, содержащих два альтернативных аллеля в ампликоне44. Этот или аналогичный метод потенциально может быть использован с аллелями Ara или с недавно эволюционировавшими мутациями, такими как мутации в pykF и nadR, по сравнению с предковой последовательностью. Выполнение генетических модификаций, которые вводят другие типы нейтральных маркеров, также может быть использовано для измерения относительной приспособленности. Например, гены флуоресцентных белков были вставлены в хромосомы клеток в экспериментах с ответвлением LTEE, чтобы конкурентов можно было подсчитать с помощью проточной цитометрии45. Другой подход, который открывает возможность смешивания более двух штаммов в одной конкурирующей колбе, заключается во вставке штрих-кодов, которые могут быть амплифицированы ПЦР и секвенированы в геномы разных конкурентов. Этот подход был использован для отслеживания происхождения в эволюционных экспериментах46. Как проточная цитометрия, так и секвенирование штрих-кода могут точно измерить гораздо более экстремальные соотношения двух штаммов по сравнению с подсчетом колоний (потому что они могут запрашивать 10 000 клеток/геномов > сравнению с < 500, которые можно насчитать на агаровой пластине), поэтому использование этих методов также обещает увеличить динамический диапазон с точки зрения различий в приспособленности, которые могут быть измерены по сравнению с общим конкурентом.

Альтернативные проекты для долгосрочных экспериментов по эволюции микробов
Несмотря на все свои достоинства, LTEE не идеален. Некоторые аспекты его конструкции делают его трудоемким и подверженным человеческим ошибкам. Например, каждый день исследователь должен приходить в лабораторию и вставлять пипетку между колбами Эрленмейера, чтобы продолжить эксперимент. Конкурентные эксперименты также могут создавать огромные логистические препятствия, учитывая, что требования к стерильной стеклянной посуде, средам, пространству инкубатора и подсчету колоний быстро возрастают, когда даже небольшое количество конкурентов тестируется со скромной репликацией. Нас часто спрашивают, почему мы не пользуемся системами автоматизации лабораторий, такими как роботы-пипетки, которые работают на 96-луночных микропланшетах, или системами непрерывного культивирования, такими как хемостаты или турбидостаты. Ответ прост: LTEE в каком-то смысле является пленником своей долгой истории. Мы не осмеливаемся отклоняться от 10 мл культур, встряхиваемых с определенной скоростью в колбах Эрленмейера объемом 50 мл, потому что это может коренным образом изменить эксперимент. Тонкие аспекты окружающей среды, к которой эти популяции приспосабливались в течение десятилетий (например, количество аэрации), будут изменены в микропланшетах или системах непрерывного культивирования. Узкое место популяции при каждом переносе также может быть разным (например, меньше на микропланшетах), что изменяет эволюционную динамику. Короче говоря, отклонение от описанных здесь методов сделало бы LTEE другим экспериментом или, по крайней мере, рискнуло бы внести разрыв, который нарушил бы эволюционные траектории.

Исследователи, разрабатывающие новые эволюционные эксперименты, должны учитывать эти другие способы размножения микробных популяций, зная об их потенциальных преимуществах и недостатках. Использование роботов-пипетчиков для переноса популяций в микролуночных планшетах в некотором смысле проще с точки зрения логистики и может оказаться довольно мощным из-за большого количества реплицированных популяций, которые могут быть распространены таким образом47,48,49. Однако автоматическая передача в большинстве современных установок не происходит в полностью стерильных условиях, что увеличивает вероятность внешнего загрязнения. Чтобы предотвратить заражение, питательную среду часто дополняют антибиотиками, которые становятся особенностью среды, влияющей на эволюцию. Переносы в микролуночных планшетах также более склонны к перекрестному загрязнению. Наконец, среда пластин с микролунками, особенно если они не встряхиваются, имеет тенденцию выбирать рост стенок, агрегацию и другие явления, которые могут усложнить эволюцию, создавая несколько ниш в одной лунке. Использование богатых сред или высоких концентраций питательных веществ для поддержания больших размеров популяции в небольших колодцах, вероятно, усугубит эти сложности. Если такие взаимодействия возникают, они могут значительно затруднить измерение и интерпретацию пригодности.

Системы непрерывного культивирования микробной эволюции включают хемостаты, в которые постоянно закачивается свежая среда и откачивается культура, и турбидостаты, в которых культуры периодически разбавляются с помощью автоматизированного зондирования и накачки для поддержания клеток в состоянии постоянного роста. Эти системы очень полезны, когда кто-то хочет смоделировать физиологию и эволюцию микробов, потому что они избегают перехода микробов между ростом и голоданием, удерживая их в среде, в которой всегда есть питательные вещества50. Можно даже добавить датчики, которые в режиме реального времени измеряют оптическую плотность, потреблениеO2, pH и другие аспекты окружающей среды и роста культуры. Однако современные системы непрерывного культивирования требуют либо дорогостоящих закупок оборудования, либо специальных знаний для создания пользовательских установок51,52,53,54. Кроме того, рост стенок, при котором клетки избегают разбавления, прилипая к камере культуры, нарушает эволюционную динамику в непрерывных культурных системах, если их периодически не стерилизовать. Из-за этих ограничений большинство экспериментов по эволюции хемостата и турбидостата до настоящего времени имели ограниченную продолжительность и/или включали относительно небольшое количество независимо эволюционирующих популяций по сравнению с экспериментами по эволюции серийного переноса.

Заключение
Методы, которые мы демонстрируем здесь для LTEE, имеют решающее значение для изучения его уникальной исторической записи и продолжения открытой эволюции этих популяций кишечной палочки . Они также служат отправной точкой для тех, кто рассматривает новые эволюционные эксперименты, которые могут использовать преимущества лабораторной автоматизации или добавить различные элементы сложности, обнаруженные в естественной среде, которые были намеренно исключены из LTEE. С 1988 года экспериментальная эволюция процветает как область. За это время исследователи в лабораториях по всему миру продемонстрировали огромную гибкость этого подхода к изучению эволюции, внедряя инновации путем внедрения творческих экспериментальных проектов и мониторинга результатов с использованием новых технологий. Методы LTEE не представляют собой конечную точку, но мы надеемся, что они будут продолжать вдохновлять и обеспечивать основу для этой области в далеком будущем.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Ричарда Ленски и многих исследователей, которые изучали и внесли свой вклад в проведение долгосрочного эволюционного эксперимента с кишечной палочкой, в том числе особенно Нирджа Хаджела. В настоящее время LTEE поддерживается Национальным научным фондом (DEB-1951307).

Materials

2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC) Sigma-Aldrich T8877
20 mL Glass Beaker Sigma-Aldrich CLS100020
50 mL Erlenmeyer Flasks Sigma-Aldrich CLS498050
Agar Sigma-Aldrich A1296
Ammonium Sulfate Sigma-Aldrich AX1385
Antifoam Sigma-Aldrich A5757
Arabinose Sigma-Aldrich A3256
Freezer Box (2") VWR 82007-142
Freezer Box (3") VWR 82007-144
Freezer Box Cell Divider (49-place) VWR 82007-150
Freezer Box Cell Divider (81-place) VWR 82007-154
Freezer Vials (1/2-Dram) VWR  66009-816 
Freezer Vials (2-Dram) VWR  66010-560 
Glucose Sigma-Aldrich G8270
Glycerol Fisher Scientific G33
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich M7506
Metal Tray Winco SPJP-202
Petri Dish Fisher Scientific FB0875712
Potassium Phosphate Dibasic Trihydrate Sigma-Aldrich P5504
Potassium Phosphate Monobasic Sigma-Aldrich P5379
Sodium Chloride Sigma-Aldrich M7506
Sodium Citrate Tribasic Dihydrate Sigma-Aldrich C7254
Test Tube Cap (18mm) VWR 10200-142
Test Tube Rack (18mm, steel) Adamas-Beta N/A Test Tube Racks Stainless Steel Grid Arrangement 72 Holes (17-19 mm)
Test Tubes (18 x 150 mm) VWR 47729-583
Thiamine, Hydrochloride Millipore 5871
Tryptone Gibco 211705
Yeast Extract Gibco 212750
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lenski, R. E., Rose, M. R., Simpson, S. C., Tadler, S. C. Long-term experimental evolution in Escherichia coli. I. Adaptation and divergence during 2,000 generations. The American Naturalist. 138 (6), 1315-1341 (1991).
  2. Fox, J. W., Lenski, R. E. From here to eternity-the theory and practice of a really long experiment. PLoS Biology. 13 (6), e1002185 (2015).
  3. Daegelen, P., Studier, F. W., Lenski, R. E., Cure, S., Kim, J. F. Tracing ancestors and relatives of Escherichia coli B, and the derivation of B strains REL606 and BL21(DE3). Journal of Molecular Biology. 394 (4), 634-643 (2009).
  4. Studier, F. W., Daegelen, P., Lenski, R. E., Maslov, S., Kim, J. F. Understanding the differences between genome sequences of Escherichia coli B strains REL606 and BL21(DE3) and comparison of the E. coli B and K-12 genomes. Journal of Molecular Biology. 394 (4), 653-680 (2009).
  5. Barrick, J. E., Lenski, R. E. Genome dynamics during experimental evolution. Nature Reviews Genetics. 14 (12), 827-839 (2013).
  6. Lenski, R. E. Experimental studies of pleiotropy and epistasis in Escherichia coli. II. Compensation for maladaptive pleiotropic effects associated with resistance to virus T4. Evolution. 42 (3), 425-432 (1988).
  7. Calcott, P. H., Gargett, A. M. Mutagenicity of freezing and thawing. FEMS Microbiology Letters. 10 (2), 151-155 (1981).
  8. Lenski, R. E., Travisano, M. Dynamics of adaptation and diversification: a 10,000-generation experiment with bacterial populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (15), 6808-6814 (1994).
  9. Wiser, M. J., Ribeck, N., Lenski, R. E. Long-term dynamics of adaptation in asexual populations. Science. 342 (6164), 1364-1367 (2013).
  10. Lenski, R. E., et al. Sustained fitness gains and variability in fitness trajectories in the long-term evolution experiment with Escherichia coli. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 282 (1821), 20152292 (2015).
  11. Barrick, J. E., et al. Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature. 461 (7268), 1243-1247 (2009).
  12. Blount, Z. D., Barrick, J. E., Davidson, C. J., Lenski, R. E. Genomic analysis of a key innovation in an experimental Escherichia coli population. Nature. 489 (7417), 513-518 (2012).
  13. Tenaillon, O., et al. Tempo and mode of genome evolution in a 50,000-generation experiment. Nature. 536 (7615), 165-170 (2016).
  14. Good, B. H., McDonald, M. J., Barrick, J. E., Lenski, R. E., Desai, M. M. The dynamics of molecular evolution over 60,000 generations. Nature. 551 (7678), 45-50 (2017).
  15. Consuegra, J., et al. Insertion-sequence-mediated mutations both promote and constrain evolvability during a long-term experiment with bacteria. Nature Communications. 12 (1), 980-980 (2021).
  16. Cooper, T. F., Rozen, D. E., Lenski, R. E. Parallel changes in gene expression after 20,000 generations of evolution in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (3), 1072-1077 (2003).
  17. Favate, J. S., Liang, S., Cope, A. L., Yadavalli, S. S., Shah, P. The landscape of transcriptional and translational changes over 22 years of bacterial adaptation. eLife. 11, e81979 (2022).
  18. Khan, A. I., Dinh, D. M., Schneider, D., Lenski, R. E., Cooper, T. F. Negative epistasis between beneficial mutations in an evolving bacterial population. Science. 332 (6034), 1193-1196 (2011).
  19. Plucain, J., et al. Epistasis and allele specificity in the emergence of a stable polymorphism in Escherichia coli. Science. 343 (6177), 1366-1369 (2014).
  20. Quandt, E. M., Deatherage, D. E., Ellington, A. D., Georgiou, G., Barrick, J. E. Recursive genomewide recombination and sequencing reveals a key refinement step in the evolution of a metabolic innovation in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (6), 2217-2222 (2014).
  21. Leon, D., D’Alton, S., Quandt, E. M., Barrick, J. E. Innovation in an E. coli evolution experiment is contingent on maintaining adaptive potential until competition subsides. PLoS Genetics. 14 (4), e1007348 (2018).
  22. Bennett, A. F., Lenski, R. E., Mittler, J. E. Evolutionary adaptation to temperature. I. Fitness responses of Escherichia coli to changes in its thermal environment. Evolution. 46 (1), 16-30 (1992).
  23. Kibota, T. T., Lynch, M. Estimate of the genomic mutation rate deleterious to overall fitness in E. coli. Nature. 381 (6584), 694-696 (1996).
  24. Friesen, M. L., Saxer, G., Travisano, M., Doebeli, M. Experimental evidence for sympatric ecological diversification due to frequency-dependent competition in Escherichia coli. Evolution. 58 (2), 245-260 (2004).
  25. Cooper, T. F. Recombination speeds adaptation by reducing competition between beneficial mutations in populations of Escherichia coli. PLoS Biology. 5 (9), e225 (2007).
  26. Cooper, T. F., Lenski, R. E. Experimental evolution with E. coli in diverse resource environments. I. Fluctuating environments promote divergence of replicate populations. BMC Evolutionary Biology. 10, 11 (2010).
  27. Quan, S., et al. Adaptive evolution of the lactose utilization network in experimentally evolved populations of Escherichia coli. PLoS Genetics. 8 (1), e1002444 (2012).
  28. Deatherage, D. E., Kepner, J. L., Bennett, A. F., Lenski, R. E., Barrick, J. E. Specificity of genome evolution in experimental populations of Escherichia coli evolved at different temperatures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), E1904-E1912 (2017).
  29. Izutsu, M., Lake, D. M., Matson, Z. W. D., Dodson, J. P., Lenski, R. E. Effects of periodic bottlenecks on the dynamics of adaptive evolution in microbial populations. BioRixv. , 4457 (2021).
  30. Chavarria-Palma, J. E., Blount, Z. D., Barrick, J. E. . LTEE Media Recipes. , (2022).
  31. Barrick, J. E., Lake, D. M. fitnessR: fitnessR-v1.0.0. barricklab. , (2023).
  32. Blount, Z. D., Borland, C. Z., Lenski, R. E. Historical contingency and the evolution of a key innovation in an experimental population of Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (23), 7899-7906 (2008).
  33. Grant, N. A., Magid, A. A., Franklin, J., Dufour, Y., Lenski, R. E. Changes in cell size and shape during 50,000 generations of experimental evolution with Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 203 (10), 22 (2021).
  34. Wickham, H. . ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. , (2016).
  35. Meyer, J. R., et al. Parallel changes in host resistance to viral infection during 45,000 generations of relaxed selection. Evolution. 64 (10), 3024-3034 (2010).
  36. Woods, R., Schneider, D., Winkworth, C. L., Riley, M. A., Lenski, R. E. Tests of parallel molecular evolution in a long-term experiment with Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (24), 9107-9712 (2006).
  37. . LTEE-Ecoli: genomics resources for the Long-Term Evolution Experiment with Escherichia coli Available from: https://github.com/barricklab/LTEE-Ecoli (2022)
  38. Izutsu, M., Lenski, R. E. Experimental test of the contributions of initial variation and new mutations to adaptive evolution in a novel environment. Frontiers in Ecology and Evolution. 10, 958406 (2022).
  39. Wiser, M. J., Lenski, R. E. A comparison of methods to measure fitness in Escherichia coli. PLoS One. 10 (5), 0126210 (2015).
  40. de Visser, J. A. G. M., Lenski, R. E. Long-term experimental evolution in Escherichia coli. XI. Rejection of non-transitive interactions as cause of declining rate of adaptation. BMC Evolutionary Biology. 2 (1), 19 (2002).
  41. Paquin, C. E., Adams, J. Relative fitness can decrease in evolving asexual populations of S. cerevisiae. Nature. 306 (5941), 368-371 (1983).
  42. Rozen, D. E., Lenski, R. E. Long-Term Experimental Evolution in Escherichia coli. VIII. Dynamics of a balanced polymorphism. The American Naturalist. 155 (1), 24-35 (2000).
  43. Quandt, E. M., Gollihar, J., Blount, Z. D., Ellington, A. D., Georgiou, G., Barrick, J. E. Fine-tuning citrate synthase flux potentiates and refines metabolic innovation in the Lenski evolution experiment. eLife. 4, e09696 (2015).
  44. Chubiz, L. M., Lee, M. -. C., Delaney, N. F., Marx, C. J. FREQ-Seq: a rapid, cost-effective, sequencing-based method to determine allele frequencies directly from mixed populations. PLoS One. 7 (10), e47959 (2012).
  45. Gallet, R., Cooper, T. F., Elena, S. F., Lenormand, T. Measuring selection coefficients below 10-3: method, questions, and prospects. 유전학. 190 (1), 175-186 (2012).
  46. Levy, S. F., et al. Quantitative evolutionary dynamics using high-resolution lineage tracking. Nature. 519 (7542), 181-186 (2015).
  47. Lang, G. I., Botstein, D., Desai, M. M. Genetic variation and the fate of beneficial mutations in asexual populations. 유전학. 188 (3), 647-661 (2011).
  48. Frenkel, E. M., et al. Crowded growth leads to the spontaneous evolution of semistable coexistence in laboratory yeast populations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (36), 11306-11311 (2015).
  49. Jordt, H., et al. Coevolution of host-plasmid pairs facilitates the emergence of novel multidrug resistance. Nature Ecology and Evolution. 4 (6), 863-869 (2020).
  50. Gresham, D., Dunham, M. J. The enduring utility of continuous culturing in experimental evolution. Genomics. 104 (6), 399-405 (2014).
  51. Miller, A. W., Befort, C., Kerr, E. O., Dunham, M. J. Design and use of multiplexed chemostat arrays). Journal of Visualized Experiments. (72), e50262 (2013).
  52. Toprak, E., et al. Building a morbidostat: an automated continuous-culture device for studying bacterial drug resistance under dynamically sustained drug inhibition. Nature Protocols. 8 (3), 555-567 (2013).
  53. Wong, B. G., Mancuso, C. P., Kiriakov, S., Bashor, C. J., Khalil, A. S. Precise, automated control of conditions for high-throughput growth of yeast and bacteria with eVOLVER. Nature Biotechnology. 36 (7), 614-623 (2018).
  54. Ekkers, D. M., Branco Dos Santos, F., Mallon, C. A., Bruggeman, F., Van Doorn, G. S. The omnistat: A flexible continuous-culture system for prolonged experimental evolution. Methods in Ecology and Evolution. 11 (8), 932-942 (2020).

Tags

Daily TransfersArchivingFitness MeasurementLong-term Evolution ExperimentEscherichia ColiGlucose-limited MediumREL606REL607Ara+Ara-Colony ColorCo-culture Competition AssaysRelative Fitness

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Barrick, J. E., Blount, Z. D., Lake, D. M., Dwenger, J. H., Chavarria-Palma, J. E., Izutsu, M., Wiser, M. J. Daily Transfers, Archiving Populations, and Measuring Fitness in the Long-Term Evolution Experiment with Escherichia coli. J. Vis. Exp. (198), e65342, doi:10.3791/65342 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image