Et sæt screeningsteknikker til et hurtigt overblik over neutrofilfunktionen
Summary
Denne protokol indeholder et sæt neutrofile funktionelle assays, der skal bruges som screeningsmetode til at dække funktioner fra forskellige signalveje. Protokollen indeholder en indledende og enkel evaluering af cellelevedygtighed, renhed, produktion af reaktive iltarter, realtidsmigration, fagocytose og et foreløbigt forslag til neutrofile ekstracellulære fælder.
Abstract
Neutrofiler er kendt som en af de første forsvarslinjer i det medfødte immunrespons og kan udføre mange særlige cellulære funktioner, såsom kemotaxis, omvendt migration, fagocytose, degranulering af cytotoksiske enzymer og metabolitter og frigivelse af DNA som neutrofile ekstracellulære fælder (NET’er). Neutrofiler har ikke kun stramt reguleret signalering selv, men deltager også i reguleringen af andre komponenter i immunsystemet. Da friske neutrofiler er terminalt differentierede, kortvarige og meget variable blandt individer, er det vigtigt at få mest muligt ud af de indsamlede prøver. Forskere har ofte brug for at udføre screeningsanalyser for at vurdere et overblik over de mange neutrofile funktioner, der kan påvirkes af specifikke forhold under evaluering. Et sæt tests efter en enkelt isolationsproces af neutrofiler med normal densitet blev udviklet for at imødekomme dette behov og søge en balance mellem hastighed, omfattende, omkostninger og nøjagtighed. Resultaterne kan bruges til at ræsonnere og vejlede dybdegående opfølgningsundersøgelser. Denne procedure kan udføres i en gennemsnitlig tid på 4 timer og inkluderer evaluering af cellelevedygtighed, produktion af reaktive iltarter (ROS), migration i realtid og fagocytose af gær på glasglas, hvilket efterlader nok celler til mere detaljerede tilgange som omics-undersøgelser. Desuden omfatter proceduren en måde til let at observere et foreløbigt forslag til NET’er efter hurtig panoptisk farvning observeret ved lysmikroskopi med mangel på specifikke markører, omend nok til at indikere, om yderligere bestræbelser på denne måde ville være umagen værd. Mangfoldigheden af testede funktioner kombinerer fælles punkter blandt test, hvilket reducerer analysetiden og udgifterne. Proceduren blev navngivet NeutroFun Screen, og selvom den har begrænsninger, balancerer den de førnævnte faktorer. Desuden er formålet med dette arbejde ikke et bestemt testsæt, men snarere en retningslinje, der let kan tilpasses det enkelte laboratoriums ressourcer og krav.
Introduction
Neutrofiler er de mest rigelige medfødte immunceller i humant blod og er kendt for at spille en vigtig rolle i infektion og betændelse, idet de er de første respondenter, der ankommer til stedet for vævsskade1. I de senere år har der været en voksende anerkendelse af den afgørende rolle, som neutrofiler spiller i en række sygdomme og i at støtte homeostase2. Neutrofiler har ikke kun stramt reguleret signalering selv, men deltager også i reguleringen af andre komponenter i immunsystemet 3,4,5. Derfor er det bydende nødvendigt at undersøge neutrofiler og deres mange usædvanlige cellulære funktioner, såsom kemotaxis, omvendt migration6, fagocytose7, respiratorisk burst8 og frigivelse af neutrofile ekstracellulære fælder (NETs)7, i adskillige forskningssammenhænge, hvor det er nødvendigt at vurdere de potentielle neutrofile funktionelle, morfologiske eller molekylære ændringer udløst af specifikke forhold under analyse.
Frisk isolerede neutrofiler er terminalt differentierede, kortvarige, meget dynamiske og let aktiverede9. Imidlertid er der endnu ikke opnået en effektiv lagringsmetode, der ikke påvirker neutrofilresponserne, hvilket gør det udfordrende at udføre flere assays, der skal være uafbrudte. Desuden er tidligere beskrevne funktionelle analyser 10,11, baseret på assays, der kræver cytometri og / eller fluorescerende farvning, muligvis ikke et levedygtigt valg, når en bred og indledende evaluering af neutrofilen er nødvendig.
For at løse disse problemer beskriver denne protokol et sæt tests, der kan udføres efter en enkelt isolationsproces, herunder evaluering af cellelevedygtighed, produktion af reaktive iltarter (ROS), migration i realtid og fagocytose af Saccharomyces cerevisiae, hvis resultater kan bruges til at begrunde dybdegående opfølgningsundersøgelser. Denne procedure, kaldet NeutroFun Screen, blev designet til at omfatte de førende effektoraktiviteter, undtagen degranulering, og kan afsluttes i en gennemsnitlig tid på 4 timer, inklusive 1 times aktivering. Derudover kan de resterende celler bruges til mere detaljerede tilgange som omics-undersøgelser. Fordelen ved denne metode ligger i dens balance mellem hastighed, omfattende, omkostninger og nøjagtighed.
Desuden er der en måde, hvorpå man let kan observere et foreløbigt forslag om NET’er uden specifikke markører, men nok til at indikere, om yderligere bestræbelser i den retning ville være umagen værd. Mangfoldigheden af testede funktioner sigter mod at kombinere fælles punkter blandt test, hvilket reducerer analysetiden og omkostningerne. Hovedformålet med denne metode er at give en afbalanceret, funktionel analyse vedrørende hastighed, omfattende, omkostninger og nøjagtighed, der giver mulighed for et overblik over neutrofilens respons, hvilket gør det til et nyttigt indledende skridt i undersøgelsen af virkningerne af nye stimuli på neutrofiler med normal densitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neutrofiler er meget dynamiske og lydhøre celler, der er kortvarige og endnu ikke kan kryopræserveres19, hvilket gør undersøgelser af deres biologi udfordrende. Derfor er det vigtigt at følge omhyggelige trin for at opnå levedygtige, berigede og hvilende neutrofiler 11,20. Denne undersøgelse anvendte en tæthedsbaseret isolationsteknik, der understreger blid og minimal manipulation samt brugen af lave temperaturer indtil aktiverings…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkender følgende finansieringsorganer: FAPDF, CNPq, CAPES, UnB, FINEP og FINATEC.
Materials
| CIM-Plate 16 | Agilent | 5665825001 | |
| CLARIOstar Plate Reader | BMG LABTECH | US Patent Number 9,733,124 Product details: MARS Data Analysis Software |
|
| Dimethyl sulfoxide | Dinâmica | 1582 | |
| DNAse I | Sigma – Aldrich | DN 25 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma – Aldrich | E5134 | |
| Fast panoptic stain | Laborclin | 620529 | |
| Glass slide | Exacta | 7102 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution with calcium, with magnesium, without phenol red. | Sigma – Aldrich | 55037C | |
| Hank’s Balanced Salt Solution without calcium chloride, magnesium sulfate and sodium bicarbonate. | Sigma – Aldrich | H4641 | |
| Heparin | Blau | 7896014655229 | |
| Laminar flow cabinet | Veco | VLFS-12 | |
| Microscope | Zeiss | 415501-0101-002 | Product details: Primostar 1 |
| Mixing Block | BIOER | MB-102 | |
| Neubauer improved bright-lined | New Optik | 1110000 | |
| N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine | Sigma – Aldrich | F3506 | |
| Nitroblue tetrazolium | Neon | CAS 298-83-9 | |
| Percoll | Cytiva | 17089101 | separation media |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma – Aldrich | P8139 | |
| Phosphate buffered saline tablet | Sigma – Aldrich | P4417 | |
| ROTOFIX 32 A | Hettich | 1206 | |
| Saccharomyces cerevisiae | Fleischmann | ||
| Safranin | Sigma – Aldrich | 50240 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Cytiva | 17-1313-01 | |
| Sonicator | Qsonica | Q125 | |
| Trypan blue solution | Vetec | C.I. 23850 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries, Inc. | 0K-0500-902 | |
| xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) DP (dual purpose) | Agilent | 380601050 | Product details: RTCA system composed of detection hardware, cell plates and software |
References
- Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nature Immunology. 15 (7), 602-611 (2014).
- Groeneweg, L., Hidalgo, A. Emerging roles of infiltrating granulocytes and monocytes in homeostasis. Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (19), 3823-3830 (2020).
- Rosales, C., Lowell, C. A., Schnoor, M., Uribe-Querol, E. Neutrophils: their role in innate and adaptive immunity 2017. Journal of Immunology Research. 2017, 9748345 (2017).
- Castro, M., et al. Proteome analysis of resting human neutrophils. Protein & Peptide Letters. 13 (5), 481-487 (2006).
- Li, Y., et al. The regulatory roles of neutrophils in adaptive immunity. Cell Communication and Signaling. 17, 147 (2019).
- de Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. Neutrophil migration in infection and wound repair: going forward in reverse. Nature Reviews Immunology. 16 (6), 378-391 (2016).
- Burn, G. L., Foti, A., Marsman, G., Patel, D. F., Zychlinsky, A. The neutrophil. Immunity. 54 (7), 1377-1391 (2021).
- El-Benna, J., et al. Priming of the neutrophil respiratory burst: role in host defense and inflammation. Immunological Reviews. 273 (1), 180-193 (2016).
- Castro, M. S., Cilli, E. M., Fontes, W. Combinatorial synthesis and directed evolution applied to the production of alpha-helix forming antimicrobial peptides analogues. Current Protein & Peptide Science. 7 (6), 473-478 (2006).
- Mihaila, A. C., et al. Transcriptional profiling and functional analysis of N1/N2 neutrophils reveal an immunomodulatory effect of S100A9-blockade on the pro-inflammatory N1 subpopulation. Frontiers in Immunology. 12, 708770 (2021).
- Kuhns, D. B., Priel, D. A. L., Chu, J., Zarember, K. A. Isolation and functional analysis of human neutrophils. Current Protocols in Immunology. 111 (1), 7-23 (2015).
- Paulíková, E., Kociková, A., Sabol, M. Modification of a panoptic method of staining isolated cells. Bratislavske Lekarske Listy. 94 (12), 638-640 (1993).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111 (1), 1-3 (2015).
- Libério, M. S., et al. Anti-proliferative and cytotoxic activity of pentadactylin isolated from Leptodactylus labyrinthicus on melanoma cells. Amino Acids. 40 (1), 51-59 (2011).
- Cano, P. M., Vargas, A., Lavoie, J. P. A real-time assay for neutrophil chemotaxis. BioTechniques. 60 (5), 245-251 (2016).
- Stefanowicz-Hajduk, J., Adamska, A., Bartoszewski, R., Ochocka, J. R. Reuse of E-plate cell sensor arrays in the xCELLigence Real-Time Cell Analyzer. BioTechniques. 61 (3), 117-122 (2016).
- Björkstén, B., Nyström, K., Lindqvist, B. The nitroblue tetrazolium (NBT) test in endemic benign (epidemic) nephropathy. Acta Medica Scandinavica. 199 (1-6), 147-150 (1976).
- Aquino, E., et al. Proteomic analysis of neutrophil priming by PAF. Protein & Peptide Letters. 23 (2), 142-151 (2016).
- Blanter, M., Gouwy, M., Struyf, S. Studying neutrophil function in vitro: cell models and environmental factors. Journal of Inflammation Research. 14, 141-162 (2021).
- Hsu, A. Y., Peng, Z., Luo, H., Loison, F. Isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats. Journal of Visualized Experiments. (175), e62837 (2021).
- Moghadam, Z. M., Henneke, P., Kolter, J. From flies to men: ROS and the NADPH oxidase in phagocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 628991 (2021).
- Pattan, S. S., Bhat, K. G., Pattar, G. D., Kuntagi, M. Comparison of three different techniques for isolation of neutrophils from blood and their utility in performing nitroblue tetrazolium test. International Journal of Basic and Applied Physiology. 8 (1), 41 (2019).
- Gooty, J. R., Shashirekha, A., Guntakala, V. R., Palaparthi, R. Estimation of phagocytic activity of polymorphonuclear leukocytes in chronic and aggressive periodontitis patients with nitroblue tetrazolium test. Journal of Indian Society of Periodontology. 23 (4), 316 (2019).
- Langer, S., et al. Clinical and laboratory profiles of 17 cases of chronic granulomatous disease in north India. Indian Journal of Hematology and Blood Transfusion. 37 (1), 45-51 (2021).
- Oualha, R., et al. Infection of human neutrophils with Leishmania infantum or Leishmania major strains triggers activation and differential cytokines release. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 9, 153 (2019).
- Zilinskas, J., Zekonis, J., Zekonis, G., Valantiejiene, A., Periokaite, R. The reduction of nitroblue tetrazolium by total blood in periodontitis patients and the aged. Stomatologijal. 9 (4), 105-108 (2007).
- Benov, L. Improved formazan dissolution for bacterial MTT assay. Microbiology Spectrum. 9 (3), e01637 (2021).
- Chen, Y., Junger, W. G. Measurement of oxidative burst in neutrophils. Methods in Molecular Biology. 844, 115-124 (2012).
- Richardson, M. P., Ayliffe, M. J., Helbert, M., Davies, E. G. A simple flow cytometry assay using dihydrorhodamine for the measurement of the neutrophil respiratory burst in whole blood: comparison with the quantitative nitrobluetetrazolium test. Journal of Immunological Methods. 219 (1-2), 187-193 (1998).
- Jancinová, V., et al. The combined luminol/isoluminol chemiluminescence method for differentiating between extracellular and intracellular oxidant production by neutrophils. Redox Report. 11 (3), 110-116 (2006).
- Nosál, R., et al. Pharmacological intervention with oxidative burst in human neutrophils. Interdisciplinary Toxicology. 10 (2), 56-60 (2017).
- Mol, S., et al. Efficient neutrophil activation requires two simultaneous activating stimuli. International Journal of Molecular Sciences. 22 (18), 10106 (2021).
- Schneider, L., et al. Flow cytometry evaluation of CD14/CD16 monocyte subpopulations in systemic sclerosis patients: a cross sectional controlled study. Advances in Rheumatology. 61 (1), 27 (2021).
- Akin, E., Pelen, N. N., Tiryaki, I. U., Yalcin, F. Parameter identification for gompertz and logistic dynamic equations. PLoS One. 15 (4), e0230582 (2020).
- Guy, J. B., et al. Evaluation of the cell invasion and migration process: A comparison of the video microscope-based scratch wound assay and the boyden chamber assay. Journal of Visualized Experiments. (129), e56337 (2017).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- de Bont, C. M., Koopman, W. J. H., Boelens, W. C., Pruijn, G. J. M. Stimulus-dependent chromatin dynamics, citrullination, calcium signalling and ROS production during NET formation. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1865, 1621-1629 (2018).
- Masuda, S., et al. Measurement of NET formation in vitro and in vivo by flow cytometry. Cytometry Part A. 91 (8), 822-829 (2017).
- Zharkova, O., et al. A flow cytometry-based assay for high-throughput detection and quantification of neutrophil extracellular traps in mixed cell populations. Cytometry Part A. 95 (3), 268-278 (2019).
- Hosseinnejad, A., et al. DNase I functional microgels for neutrophil extracellular trap disruption. Biomaterials Science. 10 (1), 85-99 (2022).
- Chrysanthopoulou, A., et al. Neutrophil extracellular traps promote differentiation and function of fibroblasts. The Journal of Pathology. 233 (3), 294-307 (2014).
- Tong, M., Abrahams, V. M. Visualization and quantification of neutrophil extracellular traps. Methods in Molecular Biology. 2255, 87-95 (2021).
- Santana, C. J. C., et al. Biological properties of a novel multifunctional host defense peptide from the skin secretion of the chaco tree frog, boana raniceps. Biomolecules. 10 (5), 790 (2020).
- Murphy, M. P., et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nature Metabolism. 4 (6), 651-662 (2022).
- Boero, E., et al. Use of flow cytometry to evaluate phagocytosis of staphylococcus aureus by human neutrophils. Frontiers in Immunology. 12, 635825 (2021).
- Karsten, C. B., et al. A versatile high-throughput assay to characterize antibody-mediated neutrophil phagocytosis. Journal of Immunological Methods. 471, 46-56 (2019).
- Smirnov, A., Solga, M. D., Lannigan, J., Criss, A. K. Using imaging flow cytometry to quantify neutrophil phagocytosis. Methods in Molecular Biology. 2087, 127-140 (2020).
