JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생물학

Измерение параметров кальция и сократимости кальция в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках человека в режиме реального времени

Published: May 26, 2023
doi:
10.3791/65326
, , , , , ,
1Division of Physiology, Amsterdam UMC,Vrije University, 2Heart Failure & Arrhythmias,Amsterdam Cardiovascular Sciences, 3CytoCypher BV, 4Division of Clinical Pharmacology,Vanderbilt School of Medicine

Summary

В данной работе описан установленный метод измерения сократительной способности и кальция в индуцированных плюрипотентных кардиомиоцитах, полученных из стволовых клеток человека, с использованием оптической платформы. Эта платформа позволяет исследователям быстро и воспроизводимо изучать влияние мутаций и реакцию на различные стимулы.

Abstract

Индуцированные плюрипотентные кардиомиоциты, полученные из стволовых клеток человека (hiPSC-CMs), представляют собой мощный инструмент для изучения мутационно-опосредованных изменений функции кардиомиоцитов и определения эффектов стрессоров и медикаментозных вмешательств. В данном исследовании показано, что данная оптическая система является мощным инструментом для оценки функциональных параметров hiPSC-CM в 2D. Используя эту платформу, можно выполнять парные измерения в хорошо сохраненной температурной среде на различных макетах пластин. Более того, эта система предоставляет исследователям мгновенный анализ данных.

В данной работе описан метод измерения сократительной способности немодифицированных ИПСК-КМ. Кинетика сжатия измеряется при 37 °C на основе изменений корреляции пикселей относительно системы отсчета, взятой при релаксации при частоте дискретизации 250 Гц. Кроме того, одновременные измерения внутриклеточных транзиентов кальция могут быть получены путем загрузки в клетку кальций-чувствительного флуорофора, такого как Fura-2. С помощью гиперпереключателя можно проводить ратиометрические измерения кальция на пятне освещения диаметром 50 мкм, что соответствует площади измерений сократимости.

Introduction

Сердечная недостаточность является основной причиной смерти во всем мире. В 2019 г. сердечно-сосудистые заболевания стали причиной 18,6 миллиона случаев смерти во всем мире, что на 17,1% больше, чем запоследнее десятилетие1. Несмотря на усилия исследователей по выявлению лекарственных мишеней для профилактики и лечения сердечной недостаточности, результаты лечения пациентов по-прежнему остаются плохими. Различия в патофизиологии животных моделей по сравнению с людьми могут быть одним из основополагающих факторов ограниченного успеха оптимизации терапии сердечнойнедостаточности 3. Необходимы дополнительные человекоподобные модели для моделирования заболевания и проверки токсичности и эффективности новых лекарственных соединений.

Индуцированные плюрипотентные кардиомиоциты, полученные из стволовых клеток человека (hiPSC-CMs), представляют собой мощный инструмент для определения клеточных патомеханизмов, индуцированных стрессорами, ишемией, измененным метаболизмом или вариантами патогенных генов, а также эффективности и токсичности лекарственных вмешательств4. Для определения влияния на функциональные свойства hiPSC-CM необходима высокоскоростная система, которая измеряет систолические и диастолические свойства клеточных сокращений непредвзятым и воспроизводимым образом. Общая цель настоящего исследования состоит в том, чтобы продемонстрировать, что оптическая система является мощным инструментом для проведения анализа функциональных параметров hiPSC-CM в режиме реального времени.

В настоящее время существует несколько платформ для оценки сократительной способности hiPSC-CM. Однако современные системы либо обеспечивают медленное считывание, либо требуемое количество ячеек может быть проблемой. Безметочные системы измерения видео5,6 полагаются на анализ видео постфактум, который требует большого объема памяти и не имеет прямой обратной связи во время получения видео. Кроме того, трудно достичь достаточного временного и пространственного разрешения, что может привести к недостаточной выборке. Другие методы определения свойств кардиомиоцитов, такие как кластеризованные регулярно чередующиеся короткие палиндромные повторы (CRISPR)/Cas9-отредактированные hiPSC-CMs7 с флуоресцентными репортерами, могут влиять на стабильность генов клеток и требовать специализированных лабораторных исследований.

Для преодоления указанных выше ограничений была разработана и внедрена в данное исследование уникальная система измерений на основе оптики. Эта платформа позволяет измерять сократительную способность немодифицированных hiPSC-CM путем простого нанесения их на пластины любого требуемого формата без каких-либо ограничений по размеру пластины. Кроме того, измерения в режиме реального времени позволяют непосредственно наблюдать и анализировать функциональные параметры hiPSC-CM и, таким образом, обеспечивают экспериментальную обстановку для мгновенной корректировки и оптимизации протоколов. Кроме того, местоположение каждого измерения сохраняется, что позволяет проводить парные измерения на одном и том же образце, тем самым увеличивая мощность экспериментов.

Для демонстрации оптической системы были проведены измерения сократимости на контрольной линии hiPSC-CM. Эта контрольная линия ИПСК была получена из дермального фибробласта здорового донора-мужчины с нормальным кариотипом8. Кинетика сжатия была измерена при 37 °C на основе изменений пиксельной корреляции относительно системы отсчета, полученной во время релаксации при частоте дискретизации 250 Гц. Поскольку точное начало сокращения не всегда может быть однозначно определено, точка времени, в которую было достигнуто 20% высоты пика (время до пика 20%), была взята в качестве отправной точки для измерения времени до пика. Таким образом, была обнаружена меньшая вариабельность по этому параметру в пределах одной выборки. Точно так же, поскольку точный момент, в который сигнал возвращается к исходному уровню, трудно оценить, для описания времени релаксации использовалось время, необходимое для достижения 80% возврата к исходному уровню от пика (время до исходного уровня 80%).

Общие измерения сократимости включали частоту биений в состоянии покоя, время от 20% пика до пика сокращения (TP. Con) и время от пикового сокращения до 80% от исходного уровня (TB. Con80) (рис. 1Б). Чтобы проверить действие стрессора, клетки инкубировали с изопреналином (ISO). Кроме того, одновременно с измерениями сократимости, переходные процессы Ca 2+ были измерены путем загрузки ячеек Fura-2-ацетоксимиловым эфиром (Fura-2 AM) с частотой дискретизации 250 Гц. Ратиометрические измерения Ca2+ 9 с использованием гиперпереключателя проводились на области освещения диаметром 50 мкм, соответствующей площади измерений сократимости. Данные измерений Ca2+ отображаются как время от 20% пика до пика в переходном процессеCa2+ (TP.Ca) и время от пика до 80% от базового уровня (TB.Ca80) (рисунок 1C). С помощью быстрого автоматического инструмента анализа данных были получены средние сократительные и кинетические параметры кальция для каждой области.

Protocol

1. Подготовка питательных сред и реагентов для клеточных культур Приготовьте среду для hiPSC-CM, добавив 1 мл добавки B27 (50x) к 49 мл RPMI1640. Приготовьте среду для нанесения покрытия, предварительно добавив 5 мл нокаутной сыворотки к 45 мл среды hiPSC-CM. Затем добавьте 22,5 мкл ингибитора Y-27632 ROCK (разведение 1:2 000; концентрация сырья: 10 мМ) и тщательно перемешайте. Подготовьте плиты с мембранным покрытием фундамента, как описано ниже:Разморозьте флакон с подвальной мембраной на ночь в холодильнике или на холодильнике. Разбавьте базальную мембрану соответствующим количеством модифицированного Eagle’s medium/Ham’s F12 (DMEM/F12) от Dulbecco. Поскольку каждая партия базальной мембраны имеет разную концентрацию, рассчитайте количество DMEM/F12, необходимое для достижения разведения 1 мг/1 мл. Приготовьте аликвоты по 0,5 или 1 мл для хранения при -20 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг 1.3.2 необходимо выполнять на льду внутри проточного колпака. Разморозьте 0,5 мл аликвоты базальной мембраны и разбавьте ее 6 мл DMEM/F12. Тщательно перемешайте. Нанесите на планшет пипетирование 250 мкл разбавленной базальной мембраны/лунки в 24-луночный планшет. Рассчитайте на основе площади поверхности каждой лунки для различных форматов планшетов, например, 1 мл/лунку в 6-луночном планшете. Инкубируйте планшет в течение 1 ч в инкубаторе при температуре 37 °C. Приготовьте аликвоты Фура-2 АМ путем растворения Фура-2 АМ в диметилсульфоксиде (ДМСО), согласно руководству производителя для приготовления аликвот 1 мМ. Храните аликвоты при температуре -20 °C. 2. Культивирование hiPSC-CM Разморозьте флакон с hiPSC-CM на водяной бане с температурой 37 °C. Размороженное содержимое флакона переложить в пробирку объемом 15 мл. Добавьте в ячейки по каплям 10 мл средства для нанесения покрытия. Центрифугируют клетки в течение 5 мин при 100 × г. Удалите надосадочную жидкость и добавьте 1 мл гальванической среды. Осторожно проведите пипеткой вверх и вниз, чтобы повторно взвесить гранулу и удалить все клеточные комки. Используйте гемоцитометр или автоматический счетчик клеток, чтобы подсчитать количество клеток. Снимите базальную мембрану с инкубированной пластины и замените ее средой для нанесения покрытия. Поместите ячейки с соответствующей плотностью клеток на 6/12/24/48/96-луночную пластину, покрытую базальной мембраной (например, 250 000 клеток/лунку в 24-луночном планшете).ПРИМЕЧАНИЕ: Для переходных экспериментов Ca2+ поместите ячейки на пластины со стеклянным дном. На следующий день замените среду питательной средой hiPSC-CM, а затем обновляйте среду через день, используя 0,5 мл/лунку в 24-луночном планшете. Проведите измерения сократительной способности после того, как hiPSC-CM восстановятся после размораживания и повторного нанесения покрытия (через 3-5 дней после повторного нанесения покрытия в этом протоколе).ПРИМЕЧАНИЕ: В случае неравномерного покрытия ячеек возможно, что группа ячеек не соприкасается с остальными покрытыми ячейками и может демонстрировать нерегулярную или несинхронизированную картину биения. Чтобы избежать асинхронности, рекомендуется иметь равномерное распределение клеток и синхронизированный хорошо связанный монослой hiPSC-CM в каждой лунке. 3. Измерение сократительной способности Включите оптическую измерительную систему, светодиодный источник света микроскопа и компьютер (см. Таблицу материалов). Откройте программу и откройте новый файл. В разделе Файл в левом верхнем углу экрана нажмите Создать. Нажмите « Собрать», выберите « Эксперименты», а затем выберите «ИПСК + кальций». Включите прибор климат-контроля. Установите температуру 37 °C и уровень CO2 на 5%. Заменяйте питательную среду hiPSC-CM раствором Tyrode (0,5 мл/лунку в 24-луночном планшете). Установите крышку пластины на крышку климат-контроля.ПРИМЕЧАНИЕ: Если необходимо выполнить измерения переходных процессов кальция, загрузите ячейки Fura-2 AM, как описано в разделе 4. Поместите пластину в оптическую измерительную систему, как только климат-контроль покажет, что температура составляет 37 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: Сжатие измеряется в условиях светлого поля. Нажмите « Открыть поиск ячеек » под панелью инструментов и дождитесь появления нового экрана. В правом верхнем углу экрана выберите формат пластины и лунку. Выберите одну скважину, выберите область внутри скважины для наблюдения за синхронизированным сокращением и расслаблением, нажмите « Пуск», нажмите « Добавить измерение».  Выберите продолжительность измерений в настройках (10 с на область). Немедленно откажитесь от асинхронных измерений сокращений и выберите новую область.ПРИМЕЧАНИЕ: Переходные процессы сократимости в реальном времени можно увидеть на мониторе. Для синхронизированных сокращений наблюдается плавный непрерывный переходный процесс, в то время как для асинхронных сокращений наблюдаются небольшие дополнительные пики. Измерьте несколько областей внутри скважины в зависимости от размера скважины. Например, чтобы следовать этому исследованию, измерьте 10 площадей на лунку в 24-луночном планшете. В случае, если необходимы только базовые измерения и нет плана по тестированию какого-либо соединения, перейдите к шагу 3.13. После того, как области внутри скважины измерены, нажмите кнопку «Завершить » и откройте оптический измерительный прибор, чтобы добавить в скважину стрессор/соединение (например, 500 нМ ISO, растворенное в Tyrode). Выберите время инкубации в зависимости от интересующего вас соединения (2 минуты с ISO в этом протоколе). Нажмите кнопку автоматического измерения, чтобы позволить оптическому измерительному прибору выполнять измерения в тех же областях, где были выполнены базовые измерения, что приводит к парным измерениям в скважине. Нажмите кнопку «Завершить » после того, как все измерения в скважине будут выполнены. Выберите следующую ячейку в правом верхнем углу экрана. Продолжайте измерения для всех необходимых скважин. Нажмите кнопку «Стоп » после того, как все необходимые скважины будут измерены, и сохраните файл.ПРИМЕЧАНИЕ: Климат-контроль используется для поддержания стабильного уровняCO2. Это позволяет с высокой скоростью измерять влияние соединений/стрессоров на hiPSC-CM. 4. Измерения переходных процессов кальция Приготовьте 37 °C раствор Тироде. Растворите аликвоты Fura-2 AM в растворе Tyrode так, чтобы окончательная концентрация Fura-2 AM была добавлена в ячейки в размере 1 мкМ.ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании Fura-2 AM убедитесь, что лампы в вытяжке выключены, чтобы свести к минимуму воздействие света. Отсасывайте среду и заменяйте ее раствором Tyrode, содержащим Fura-2 AM. Инкубируют в течение 15 мин при 37 °C в инкубаторе или в оптической измерительной системе. Удалите раствор Tyrode, содержащий Fura-2 AM, а затем промойте 2 раза свежим раствором Tyrode. Наконец, инкубируют клетки в растворе Tyrode еще 5 мин при 37 °C, чтобы обеспечить деэтерификацию Fura-2 AM. Поместите пластину в оптическую измерительную систему и начните измерения, как описано в разделе 3.ПРИМЕЧАНИЕ: На шаге 4.6. При одновременном запуске измерений с измерениями сокращения регистрируется ратиометрический кальциевый переходный процесс: возбуждение на длине волны 340 нм и 385 нм в пятне размером 100 мкм; Излучение собрано на длине волны 510 ± 40 нм. В дополнение к следам сократимости на экране будут появляться ратиометрические кальциевые переходные процессы в реальном времени. 5. Анализ данных Чтобы проанализировать данные, нажмите CytoSolver на рабочем столе. Нажмите на импорт и выберите файл (файлы) для анализа. После того, как программа выполнит анализ, обратите внимание на принятые (синий) и отвергнутые (красный) переходные процессы, появляющиеся на экране (рис. 1A).ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь использовались следующие критерии подавления по умолчанию, определяемые отношением сигнал/шум (SNR) и хорошим соответствием (R 2): R 2 > 0,9 и SNR > 4 для переходных процессов сжатия и R2 > 0,5 и SNR > 3 для кальциевых переходных процессов. Эти критерии отбраковки могут быть скорректированы пользователем в зависимости от качества измерений, качества клеток и первичного результата для исследователя. Например, если исследователя интересует в основном кинетика релаксации, критерии могут быть снижены для переменных времени до пика. Если получены очень сильные кальциевые переходные процессы, возможно, придется увеличить отношение сигнал/шум, чтобы исключить более шумные данные. Нажмите на экспорт и отметьте галочкой средние переходные данные. Проверьте проанализированные данные, представленные в электронной таблице. Выключите компьютер и все остальные приборы.

Representative Results

В соответствии с этим протоколом были проведены измерения сократительной способности, транзиентов Ca2+ и реакции на соединение в hiPSC-CM. Используя эту оптическую измерительную систему, hiPSC-CM можно просто нанести на необходимые пластины и выполнить измерения сократительной способности. Сократимость измеряется в области интереса (ROI) 100 мкм x 100 мкм при частоте 250 кадров в секунду путем вычисления корреляции пикселей относительно эталонной системы. Система отсчёта автоматически распознаётся системой при конечной диастоле. Одновременно с измерениями сокращения регистрируется ратиометрический кальциевый переходный процесс. В этом исследовании в качестве трех биологических репликаций использовались три различных раунда дифференциации. Для каждой партии дифференциации были измерены три скважины в качестве технических копий. Это исследование было выполнено с использованием 24-луночных планшетов, и было измерено 10 областей внутри каждой скважины. После измерений была использована программа CytoSolver для немедленного анализа данных. Сообщалось о следующих параметрах: частота биений в покое, TP. Кон и ТБ. Кон80 контрольных ИПСК-КМ (рис. 2А-С). Для визуализации изменчивости данных по каждому указанному параметру измерения внутри каждой скважины и средние значения трех скважин для каждого раунда дифференциации представлены в виде суперграфиков10. Для более точной оценки вариабельности данных для каждого раунда дифференциации и между тремя раундами был рассчитан коэффициент дисперсии (рис. 2D) для каждого параметра. Как показано на рисунке 2D, значения технических репликаций, соответствующие одному биологическому репликату, находятся в очень близком диапазоне друг к другу (т.е. низкий коэффициент дисперсии), что иллюстрирует надежность этого метода. Это приложение очень хорошо подходит для проверки эффектов лекарств. Здесь было проверено влияние 500 нМ ISO, неселективного агониста β-адренорецепторов, на сократительную способность контрольных hiPSC-CM. Известно, что это соединение увеличивает частоту сердечных сокращений и оказывает положительное лузитропное действие. Как показано на рисунке 3А, ISO значительно увеличил частоту биений во всех скважинах. ISO также увеличила кинетику, что проявилось в снижении TP. Кон и туберкулез. Con80 (рис. 3B,C). В целом, при инкубации с помощью ISO частота биений была значительно увеличена во всех лунках, наряду с сокращением времени сокращения и релаксации, что указывало на то, что ожидаемая реакция на это соединение была зарегистрирована этой платформой. Параллельно с измерениями сократительной способности проводились также измерения кальция. Точно так же, как и данные о сократительной способности (рис. 2), данные измерений кальция с помощью hiPSC-CM показаны на рисунке 4. TB.Ca80 значительно медленнее, чем в изолированных кардиомиоцитах крыс или мышей, что частично объясняется видовыми различиями и различиями в частоте сердечных сокращений11, а также незрелой обработкой кальция в ИПСК-КМ из-за более низкой динамики кальция в саркоплазматическом ретикулуме и более низкой экспрессии белков, отвечающих за кальций, по сравнению с первичными клетками12. Аналогично данным о сократимости, был рассчитан дисперсионный коэффициент для измерений кальция, который показал низкую вариабельность в пределах технических и биологических репликатов (рис. 4C). Рисунок 1: Немедленное использование инструмента анализа переходных процессов CytoSolver после эксперимента для анализа данных. (A) Пример принятых переходных процессов (все выделены синим цветом) одной области, измеренной в скважине. На панели А1 изображены сократительные переходные процессы. На панели А2 представлены кальциевые переходные процессы. (Б) Средняя переходная способность сократимости, полученная при измерениях в трех скважинах одного витка дифференциации. Из каждого отдельного или среднего переходного процесса данные из разных моментов времени до пика (TP. Con) и время до исходного уровня (TB. Con) переходной способности сократимости. Поскольку точное начало сокращения не всегда может быть определено однозначно, время до пика 20% принимается в качестве отправной точки для измерения времени до пика. Точно так же трудно оценить точный момент, когда сигнал возвращается к исходному уровню. Таким образом, время до исходного уровня 80% используется для описания времени релаксации. Вот, ТП. Минус (время до пика – время до пика 20%) и ТБ. Используются Con 80 (время до исходного уровня80% – время до пика). (C) Средние данные о переходных процессах кальция, полученные в результате измерений в трех скважинах одного цикла дифференциации. Из каждого отдельного или среднего кальциевого переходного процесса можно извлечь данные из разных временных моментов времени до пика (TP.Ca) и времени до исходного уровня (TB.Ca) кальциевых переходных процессов. Для измерений времени до пика начальной точкой является время достижения пика 20 %, а для времени до базового уровня конечная точка — время до базового уровня 80 %. В данном исследовании используются TP.Ca(время до пика – время до пика 20%) и TB.Ca 80 (время до исходного уровня 80% – время до пика). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 2: Базовые измерения сократительной способности, выполненные в трех различных раундах дифференциации. Три биологические репликации и три скважины для каждого раунда дифференциации (т.е. три технических репликации). Три основных символа для каждого раунда дифференциации представляют собой среднее значение измеренных областей (фоновые символы блеклых цветов) в пределах каждой скважины. Данные отображаются в виде среднего значения ± SEM. Данные о частоте биений в состоянии покоя представлены в герцах и для TP. Кон и туберкулез. Con80, данные указываются в секундах. (А) Частота биений в состоянии покоя. (B) Время достижения пика (TP. Против). (C) Время достижения исходного уровня 80% (ТБ. Кон80). (D) Для оценки разницы между данными, полученными в каждом раунде, и между всеми тремя раундами дифференциации был рассчитан коэффициент дисперсии в процентах с использованием средних значений каждой скважины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 3: Измерения сократимости на исходном уровне (-) и после инкубации с ISO (+) на трех лунках из трех циклов дифференциации. (A) Частота биений в покое (-) и частота биений после инкубации при 500 нМ ISO (+). (B) Время достижения пика (TP. Con) измерения на исходном уровне и после инкубации с помощью ISO. (C) Время достижения исходного уровня 80% (ТБ. Con80) измерения на исходном уровне и после инкубации с помощью ISO. Для оценки влияния ISO на параметры сократимости была выполнена двусторонняя коррекция Anova с поправкой Бонферрони. Данные отображаются в виде среднего значения ± SEM. Данные о частоте биений в состоянии покоя представлены в герцах и для TP. Кон и туберкулез. Вверсии 80 данные представлены в секундах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 4: Исходные измерения переходных процессов кальция, выполненные на трех скважинах из трех циклов дифференциации. (A) Время достижения пика (TP.Ca) и (B) время до исходного уровня 80% (TB.Ca 80) переходных процессов кальция. Данные отображаются в виде среднего значения ± SEM. Данные TP.Ca и TB.Ca80 представлены в секундах. (C) Для оценки разброса между данными, полученными в каждом раунде, и между всеми тремя раундами дифференциации был рассчитан коэффициент дисперсии в процентах с использованием среднего значения каждой скважины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Discussion

В данном исследовании описан метод проведения измерений сократительной способности и транзиторного состояния кальция на ИПСК-КМ и изучения влияния стрессоров/лекарств на эти клетки. Измерения сократимости, ратиометрические измерения кальция и реакция на ISO были выполнены в трех различных раундах дифференциации в качестве биологических репликаций. Для каждого биологического репликатора были проведены измерения на трех скважинах в качестве технических репликаций. Причина, по которой измерения проводились таким образом, заключалась в том, чтобы обеспечить возможность оценки биологической и технической изменчивости образца и платформы. Помимо рассмотрения соответствующего количества биологических и технических репликаций, условия культивирования hiPSC-CM могут играть важную роль для достижения постоянных и надежных результатов. Во время измерений важно соответствовать таким критериям, как возраст ИПСК-КМ, состав среды, условия нанесения покрытия и время инкубации соединения. В этом исследовании потребовалось в среднем 568 ± 24 с для измерения 11 участков дважды в течение 10 секунд в одной скважине. Это включает в себя время инкубации по ISO 79 ± 11 с. Это составляет примерно 10 минут на лунку, что должно позволить исследователям измерить полную 24-луночную пластину за ~4 часа. Климат-контроль используется для поддержания стабильного уровняCO2. Это позволяет с высокой скоростью измерять влияние соединений/стрессоров на hiPSC-CM.

Для измерения сократительной функции ИПСК-КМ существует несколько систем, основанных на оптогенетике13 или безметочной видеоскопии 5,6. Оптогенетические системы достаточно сложны и требуют специальных методов для получения электрофизических данных и/или данных о сократимости. Другие системы полагаются на анализ видео post-hoc, который требует большого объема памяти и не имеет прямой обратной связи во время сбора видео. Кроме того, трудно достичь достаточного временного и пространственного разрешения, что может привести к недостаточной выборке. Аналогичным образом, отредактированные CRISPR/CAS-9 hiPSC-CM с флуоресцентными репортерами7 могут оказывать нежелательное влияние на поведение кардиомиоцитов. Использование флуоресцентных красителей для измерений сжатия-релаксации также является элегантным подходом, но ограничивает проведение экспериментов на одном и том же образце в течение более длительного периодавремени.

Однако эта измерительная платформа на основе оптики может быть использована для измерения времени сокращения-релаксации без использования каких-либо флуоресцентных красителей или инвазивных методов. Однако, поскольку пиксельная корреляция не дает пространственной информации, этот метод не может быть использован для измерения силы сжатия, а может только надежно обнаружить изменения скорости сжатия и релаксации. Представленная измерительная система контролирует температуру и может получать данные о кальции и сократительной способности в режиме реального времени с разрешением >200 кадров в секунду. Кроме того, сохраняется местоположение каждого измерения, что позволяет проводить парные измерения, тем самым увеличивая мощность экспериментов. Более того, эта платформа предоставляет исследователям возможность хранить данные и анализировать их сразу после эксперимента. В целом, эта оптическая измерительная система является перспективным методом для изучения клеточных патомеханизмов, может оценить влияние соединений на функциональность hiPSC-CM и может быть полезна в доклиническом процессе скрининга лекарственных средств.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование было частично профинансировано грантом Eurostars Estars2 113937 CARDIOMYO (EM & DK) и грантом NWO-VICI 91818602 (JV).

Materials

µ-Plate 24 Well Black ID 14 mm ibidi 82421
B-27 Supplement (50x) Thermo Fisher 17504044
CytoSolver transient analysis tool CytoCypher A fast automatic data analysis tool
DMEM/F-12 Thermo Fisher 11320033
Fura-2, AM Thermo Fisher F1221
Isoprenaline hydrochloride Merck 15627
KnockOut™ Serum Replacement Thermo Fisher 10828010
Matrigel Merck CLS3542C Basement membrane
MultiCell CytoCypher with Nikon 20x Super Fluor objective and 730 nm LED light source and Ionwizard software CytoCypher Optics-based measurement system
ROCK inhibitor Y-27632 Tocris 1254
RPMI 1640 Thermo Fisher 11875119
Tyrode Self-made solution with final concentration of the following components: NaCl 134 mM, KCl 5 mM, Hepes 12 mM, MgSO4 1.2 mM, NaH2PO4 H2O 1.2 mM, Glucose 11 mM, Sodium Pyrovate 5 mM, 1 mM CaCl2
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tsao, C. W., et al. Heart disease and stroke statistics-2022 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 145 (8), e153 (2022).
  2. Ghionzoli, N., et al. Current and emerging drug targets in heart failure treatment. Heart Failure Reviews. 27 (4), 1119-1136 (2022).
  3. Criscione, J., et al. Heart-on-a-chip platforms and biosensor integration for disease modeling and phenotypic drug screening. Biosensors and Bioelectronics. 220, 114840 (2023).
  4. vander Velden, J., et al. Animal models and animal-free innovations for cardiovascular research: current status and routes to be explored. Consensus document of the ESC Working Group on Myocardial Function and the ESC Working Group on Cellular Biology of the Heart. Cardiovascular Research. 118 (15), 3016-3051 (2022).
  5. Maddah, M., et al. A non-invasive platform for functional characterization of stem-cell-derived cardiomyocytes with applications in cardiotoxicity testing. Stem Cell Reports. 4 (4), 621-631 (2015).
  6. Sala, L., et al. MUSCLEMOTION: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo. Circulation Research. 122 (3), e5-e16 (2018).
  7. Sharma, A., et al. CRISPR/Cas9-mediated fluorescent tagging of endogenous proteins in human pluripotent stem cells. Current Protocols in Human Genetics. 96 (1), 1-20 (2018).
  8. Wang, L., et al. Hypertrophic cardiomyopathy-linked mutation in troponin T causes myofibrillar disarray and pro-arrhythmic action potential changes in human iPSC cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 114, 320-327 (2018).
  9. Luo, X., et al. IP3R-mediated compensatory mechanism for calcium handling in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes with cardiac ryanodine receptor deficiency. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 772 (2020).
  10. Lord, S. J., Velle, K. B., Mullins, R. D., Fritz-Laylin, L. K. SuperPlots: communicating reproducibility and variability in cell biology. The Journal of Cellular Biology. 219 (6), e202001064 (2020).
  11. Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacology and Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).
  12. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
  13. Klimas, A., Ortiz, G., Boggess, S. C., Miller, E. W., Entcheva, E. Multimodal on-axis platform for all-optical electrophysiology with near-infrared probes in human stem-cell-derived cardiomyocytes. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 154, 62-70 (2020).
  14. van Meer, B. J., et al. Simultaneous measurement of excitation-contraction coupling parameters identifies mechanisms underlying contractile responses of hiPSC-derived cardiomyocytes. Nature Communications. 10 (1), 4325 (2019).

Tags

Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived CardiomyocytesHiPSC-CMsContractilityCalcium HandlingReal-time MeasurementsPixel CorrelationCalcium-sensitive FluorophoreFura-22D PlatformPreclinical Drug Screening

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Dinani, R., Manders, E., Helmes, M., Wang, L., Knollmann, B. C., Kuster, D. W. D., van der Velden, J. Real-Time Measurements of Calcium and Contractility Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (195), e65326, doi:10.3791/65326 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image