Echtzeitmessungen von Kalzium- und Kontraktilitätsparametern in humanen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten
Summary
Hier wird eine etablierte Methode beschrieben, um Kontraktilitäts- und Kalziummessungen in humanen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten unter Verwendung einer optischen Plattform durchzuführen. Diese Plattform ermöglicht es den Forschern, die Auswirkungen von Mutationen und die Reaktion auf verschiedene Reize schnell und reproduzierbar zu untersuchen.
Abstract
Humane induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) stellen ein leistungsfähiges Werkzeug dar, um mutationsvermittelte Veränderungen in der Kardiomyozytenfunktion zu untersuchen und die Auswirkungen von Stressoren und medikamentösen Interventionen zu definieren. In dieser Studie wird gezeigt, dass dieses optikbasierte System ein leistungsfähiges Werkzeug ist, um die Funktionsparameter von hiPSC-CMs in 2D zu bewerten. Durch die Verwendung dieser Plattform ist es möglich, paarweise Messungen in einer gut erhaltenen Temperaturumgebung auf verschiedenen Plattenlayouts durchzuführen. Darüber hinaus bietet dieses System den Forschern eine sofortige Datenanalyse.
In dieser Arbeit wird eine Methode zur Messung der Kontraktilität von unmodifizierten hiPSC-CMs beschrieben. Die Kontraktionskinetik wird bei 37 °C gemessen, basierend auf Pixelkorrelationsänderungen relativ zu einem Referenzbild, das bei Relaxation bei einer Abtastfrequenz von 250 Hz aufgenommen wurde. Darüber hinaus können simultane Messungen intrazellulärer Kalziumtransienten durchgeführt werden, indem die Zelle mit einem kalziumsensitiven Fluorophor, wie z. B. Fura-2, beladen wird. Mit Hilfe eines Hyperschalters können ratiometrische Kalziummessungen an einem Beleuchtungsfleck mit einem Durchmesser von 50 μm durchgeführt werden, der dem Bereich der Kontraktilitätsmessungen entspricht.
Introduction
Herzinsuffizienz ist weltweit die häufigste Todesursache. Im Jahr 2019 verursachten Herz-Kreislauf-Erkrankungen weltweit 18,6 Millionen Todesfälle, was einem Anstieg von 17,1 % in den letzten zehn Jahren entspricht1. Trotz der Bemühungen von Forschern, Wirkstoffziele zur Vorbeugung und Heilung von Herzinsuffizienz zu identifizieren, sind die Ergebnisse für die Patienten immer noch schlecht2. Der Unterschied in der Pathophysiologie von Tiermodellen im Vergleich zum Menschen könnte einer der zugrundeliegenden Faktoren für den begrenzten Erfolg bei der Optimierung der Herzinsuffizienztherapie sein3. Zusätzliche menschenähnliche Modelle sind erforderlich, um Krankheiten zu modellieren und die Toxizität und Wirksamkeit neuartiger Wirkstoffe zu testen.
Humane induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) stellen ein leistungsfähiges Werkzeug dar, um zelluläre Pathomechanismen, die durch Stressoren, Ischämie, veränderten Stoffwechsel oder pathogene Genvarianten induziert werden, sowie die Wirksamkeit und Toxizität von medikamentösen Interventionen zu definieren4. Um die Auswirkungen auf die funktionellen Eigenschaften von hiPSC-CMs zu definieren, ist ein Hochgeschwindigkeitssystem erforderlich, das die systolischen und diastolischen Eigenschaften zellulärer Kontraktionen unvoreingenommen und reproduzierbar misst. Das übergeordnete Ziel der aktuellen Studie ist es, zu zeigen, dass ein optikbasiertes System ein leistungsfähiges Werkzeug ist, um Echtzeitanalysen der Funktionsparameter von hiPSC-CMs durchzuführen.
Derzeit gibt es mehrere Plattformen, um die Kontraktilität von hiPSC-CMs zu evaluieren. Aktuelle Systeme bieten jedoch entweder eine langsame Ablesung, oder die erforderliche Anzahl von Zellen könnte eine Herausforderung darstellen. Markierungsfreie Videomesssysteme5,6 beruhen auf der Post-hoc-Analyse von Videos, die viel Speicherplatz benötigt und keine direkte Rückmeldung während der Videoaufnahme bietet. Darüber hinaus ist eine ausreichende zeitliche und räumliche Auflösung schwer zu erreichen und kann zu einer Unterabtastung führen. Andere Methoden zur Bestimmung der Eigenschaften von Kardiomyozyten, wie z. B. CRISPR/Cas9-editierte hiPSC-CMs7 mit fluoreszierenden Reportern, können die Genstabilität der Zellen beeinträchtigen und spezielle Laborkenntnisse erfordern.
Um die oben genannten Einschränkungen zu überwinden, wurde ein einzigartiges optisches Messsystem entwickelt und in dieser Studie eingeführt. Diese Plattform ermöglicht Kontraktilitätsmessungen an unmodifizierten hiPSC-CMs, indem sie einfach auf jedem erforderlichen Plattenformat neu beschichtet werden, ohne dass die Plattengröße begrenzt ist. Darüber hinaus ermöglichen Echtzeitmessungen die direkte Beobachtung und Analyse der Funktionsparameter von hiPSC-CMs und bieten damit eine experimentelle Umgebung zur sofortigen Anpassung und Optimierung von Protokollen. Darüber hinaus wird der Ort jeder Messung gespeichert, was paarweise Messungen an derselben Probe ermöglicht und dadurch die Aussagekraft der Experimente erhöht.
Zur Demonstration des optikbasierten Systems wurden Kontraktilitätsmessungen an einer Kontroll-hiPSC-CM-Linie durchgeführt. Diese Kontroll-hiPSC-Linie wurde aus dem dermalen Fibroblasten eines gesunden männlichen Spenders mit einem normalen Karyotyp8 generiert. Die Kontraktionskinetik wurde bei 37 °C gemessen, basierend auf Änderungen der Pixelkorrelation relativ zu einem Referenzbild, das während der Relaxation bei einer Abtastfrequenz von 250 Hz aufgenommen wurde. Da der genaue Beginn der Kontraktion nicht immer eindeutig bestimmt werden kann, wurde der Zeitpunkt, zu dem 20 % der Peakhöhe erreicht wurden (Time to Peak 20 %), als Ausgangspunkt für Messungen der Zeit bis zum Peak genommen. Auf diese Weise wurde eine geringere Variabilität für diesen Parameter innerhalb einer Stichprobe gefunden. Da der genaue Moment, in dem das Signal zum Ausgangswert zurückkehrt, schwer zu beurteilen ist, wurde die Zeit, die benötigt wurde, um 80 % der Rückkehr zum Ausgangswert vom Höchststand (Zeit bis zum Ausgangswert 80 %) zu erreichen, zur Beschreibung der Relaxationszeit verwendet.
Die Gesamtmessungen der Kontraktilität umfassten die Ruheschlagfrequenzen, die Zeit von 20 % Peak- bis Peak-Kontraktion (TP. Con) und die Zeit von der Spitzenkontraktion bis zu 80 % des Ausgangswerts (TB. Con80) (Abbildung 1B). Um die Wirkung eines Stressors zu testen, wurden die Zellen mit Isoprenalin (ISO) inkubiert. Zusätzlich wurden zeitgleich mit den Kontraktilitätsmessungen Ca2+-Transienten gemessen, indem die Zellen mit Fura-2-Acetoxymethylester (Fura-2 AM) bei einer Abtastfrequenz von 250 Hz beladen wurden. Ratiometrische Ca2+-Messungen 9 mit einem Hyperschalter wurden auf einer Beleuchtungsfläche mit einem Durchmesser von 50 μm durchgeführt, die der Fläche der Kontraktilitätsmessungen entspricht. Ca2+-Messdaten werden als Zeit von 20 % Spitze zu Spitze in derCa2+-Transienten (TP.Ca) und als Zeit von Spitze bis 80 % der Basislinie (TB.Ca80) dargestellt (Abbildung 1C). Ein schnelles, automatisches Datenanalysewerkzeug wurde verwendet, um die durchschnittlichen kontraktilen und kinetischen Parameter für jeden Bereich zu ermitteln.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Studie wird eine Methode beschrieben, mit der Kontraktilitäts- und Kalziumtransientenmessungen an hiPSC-CMs durchgeführt und die Wirkung von Stressoren/Medikamenten auf diese Zellen untersucht werden kann. Kontraktilitätsmessungen, ratiometrische Kalziummessungen und die Reaktion auf ISO wurden in drei verschiedenen Differenzierungsrunden als biologische Replikate durchgeführt. Für jedes biologische Replikat wurden Messungen an drei Wells als technische Replikate durchgeführt. Der Grund, die Messungen auf diese Weise durchzuführen, bestand darin, sicherzustellen, dass die biologische Variabilität und die technische Variabilität der Probe und der Plattform bewertet werden können. Neben der Berücksichtigung der angemessenen Anzahl biologischer und technischer Replikate könnte die hiPSC-CM-Kultivierungsbedingung eine wichtige Rolle spielen, um konstante und robuste Ergebnisse zu erzielen. Es ist wichtig, bei den Messungen Kriterien wie dem Alter der hiPSC-CMs, der Zusammensetzung des Mediums, den Umplattungsbedingungen und der Inkubationszeit der Verbindung konsistent zu sein. In dieser Studie dauerte es durchschnittlich 568 ± 24 s, um 11 Bereiche zweimal für 10 s in einer Vertiefung zu messen. Dazu gehört eine ISO-Inkubationszeit von 79 ± 11 s. Dies entspricht etwa 10 Minuten pro Well, was es den Forschern ermöglichen sollte, eine vollständige 24-Well-Platte in ~4 h zu messen. Die Klimatisierung dient dazu, den CO2 –Stand stabil zu halten. Dies ermöglicht es, die Wirkung von Verbindungen/Stressoren auf hiPSC-CMs mit hoher Geschwindigkeit zu messen.
Um die kontraktile Funktion von iPSC-CMs zu messen, gibt es mehrere bestehende Systeme, die auf der Optogenetik13 oder der markierungsfreien videobasierten Mikroskopie 5,6 basieren. Optogenetische Systeme sind recht komplex und erfordern spezielle Techniken, um entweder elektrophysikalische und/oder Kontraktilitätsdaten zu erhalten. Andere Systeme setzen auf die Post-hoc-Analyse von Videos, die viel Speicherplatz benötigt und bei der Videoaufnahme kein direktes Feedback gibt. Darüber hinaus ist eine ausreichende zeitliche und räumliche Auflösung schwer zu erreichen, was zu einer Unterabtastung führen kann. Ebenso können CRISPR/CAS-9-editierte hiPSC-CMs mit fluoreszierenden Reportern7 unerwünschte Wirkungen auf das Verhalten von Kardiomyozyten haben. Die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen für Kontraktions-Relaxations-Messungen ist ebenfalls ein eleganter Ansatz, schränkt jedoch die Durchführung von Experimenten an derselben Probe über einen längeren Zeitraum ein14.
Diese auf Optik basierende Messplattform könnte jedoch zur Messung von Kontraktions- und Relaxationszeiten verwendet werden, ohne Fluoreszenzfarbstoffe oder invasive Methoden zu verwenden. Da die Pixelkorrelation jedoch keine räumlichen Informationen liefert, kann diese Methode nicht zur Messung der Kontraktionsstärke verwendet werden, sondern nur Änderungen der Kontraktions- und Relaxationsgeschwindigkeit zuverlässig erkennen. Das vorgestellte Messsystem ist temperaturgeregelt und kann Kalzium- und Kontraktilitätsdaten in Echtzeit mit einer Auflösung von >200 Bildern pro Sekunde erfassen. Zusätzlich wird der Ort jeder Messung gespeichert, was paarweise Messungen ermöglicht und dadurch die Aussagekraft der Experimente erhöht. Darüber hinaus bietet diese Plattform den Forschern die Möglichkeit, Daten zu speichern und sofort nach dem Experiment zu analysieren. Insgesamt erweist sich dieses optische Messsystem als vielversprechende Methode zur Untersuchung zellulärer Pathomechanismen, kann die Wirkung von Substanzen auf die Funktionalität von hiPSC-CMs bewerten und kann für den präklinischen Prozess im Wirkstoffscreening hilfreich sein.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde zum Teil durch das Eurostars-Stipendium Estars2 113937 CARDIOMYO (EM & DK) und das NWO-VICI-Stipendium 91818602 (JV) finanziert.
Materials
| µ-Plate 24 Well Black ID 14 mm | ibidi | 82421 | |
| B-27 Supplement (50x) | Thermo Fisher | 17504044 | |
| CytoSolver transient analysis tool | CytoCypher | A fast automatic data analysis tool | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher | 11320033 | |
| Fura-2, AM | Thermo Fisher | F1221 | |
| Isoprenaline hydrochloride | Merck | 15627 | |
| KnockOut™ Serum Replacement | Thermo Fisher | 10828010 | |
| Matrigel | Merck | CLS3542C | Basement membrane |
| MultiCell CytoCypher with Nikon 20x Super Fluor objective and 730 nm LED light source and Ionwizard software | CytoCypher | Optics-based measurement system | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher | 11875119 | |
| Tyrode | Self-made solution with final concentration of the following components: NaCl 134 mM, KCl 5 mM, Hepes 12 mM, MgSO4 1.2 mM, NaH2PO4 H2O 1.2 mM, Glucose 11 mM, Sodium Pyrovate 5 mM, 1 mM CaCl2 |
References
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