JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
면역학 및 감염병학

Анализ жизнеспособности конидий Trichoderma stromaticum в мононуклеарных макрофагах периферической крови человека

Published: October 20, 2023
doi:
10.3791/65231
, , , ,
1Laboratory of Immunobiology – Department of Biological Sciences,State University of Santa Cruz – UESC, 2Università Degli Studi di Genova

Summary

Методика фагоцитоза грибковых конидий макрофагами широко используется для исследований, оценивающих модуляцию иммунных реакций против грибов. Целью данной статьи является представление метода оценки фагоцитоза и клиренсных способностей мононуклеарных макрофагов периферической крови человека, стимулированных конидиями Trichoderma stromaticum .

Abstract

Макрофаги представляют собой важнейшую линию защиты и отвечают за предотвращение роста и колонизации патогенов в различных тканях. Конидиальный фагоцитоз является ключевым процессом, позволяющим исследовать цитоплазматические и молекулярные события, участвующие в макрофагально-патогенных взаимодействиях, а также определять время гибели интернализованных конидий. Методика фагоцитоза грибковых конидий макрофагами широко используется для исследований, оценивающих модуляцию иммунных реакций против грибов. Уклонение от фагоцитоза и ускользание фагосом являются механизмами вирулентности грибов. Здесь мы сообщаем о методах, которые могут быть использованы для анализа фагоцитоза, клиренса и жизнеспособности T. stromaticum conidia, гриба, который используется в качестве агента биоконтроля и биоудобрения и способен вызывать инфекции человека. Протокол состоит из: 1) культивирования триходермы , 2) промывки для получения конидий, 3) выделения мононуклеарных клеток периферической крови (МПКМ) методом раствора полисахарозы и дифференцировки МПМК в макрофаги, 4) метода фагоцитоза in vitro с использованием круглых стеклянных покровных стекол и окраски, и 5) анализа клиренса для оценки жизнеспособности конидий после фагоцитоза конидий. Таким образом, эти методы могут быть использованы для измерения эффективности выведения макрофагов из грибков.

Introduction

Род Trichoderma (Отряд: Hypocreales, Семейство: Hypocreaceae) состоит из вездесущих сапрофитных грибов, которые являются паразитами других видов грибов и способны продуцировать ряд коммерчески полезных ферментов1. Эти виды грибов используются для производства гетерологичных белков2, производства целлюлозы3, этанола, пива, вина и бумаги4, в текстильной промышленности5, пищевой промышленности6 и в сельском хозяйстве в качестве агентов биологического контроля 7,8. В дополнение к промышленному интересу к этим грибковым видам, растущее число инфекций у людей придало некоторым видам Trichoderma статус условно-патогенных микроорганизмов.

Trichoderma spp. быстро растет в культуре, с первоначально белыми и хлопковыми колониями, которые становятся зеленовато-желтыми или темно-зелеными10. Они приспособлены к жизни в широком диапазоне рН и температурных условий, а условно-патогенные виды способны выживать при физиологических рН и температурах и, таким образом, колонизировать различные ткани человека 11,12,13. Важно отметить, что рост заболеваемости Trichoderma spp. может быть связан с факторами вирулентности, а они недостаточно изучены. Кроме того, исследования, направленные на понимание иммунного ответа против условно-патогенных видов Trichoderma, все еще редки.

Во время инфекции, наряду с нейтрофилами, макрофаги представляют собой линию защиты, отвечающую за фагоцитоз, и, таким образом, препятствуют росту и колонизации возбудителей в различных тканях. Используя рецепторы распознавания образов, такие как Toll-подобные рецепторы и лектиновые рецепторы C-типа, макрофаги фагоцитозируют грибы и перерабатывают их в фаголизосомы, тем самым способствуя дыхательному взрыву, высвобождению провоспалительных цитокинов и уничтожению фагоцитозированных микроорганизмов14. Механизм фагоцитоза, однако, может быть затронут и уклонен от различных микробных стратегий, таких как размер и форма грибковых клеток; наличие капсул, препятствующих фагоцитозу; уменьшение количества рецепторов, индуцирующих фагоцитоз; ремоделирование структуры актиновых волокон в цитоплазме; препятствующие образованию псевдоподий; и фагосома или фаголизосома ускользают после процесса фагоцитоза14.

Многие патогены, в том числе Cryptococcus neoformans, используют макрофаги в качестве ниши для выживания в организме хозяина, распространения и индуцирования инфекции15. Анализ фагоцитоза и клиренса используется для оценки иммунного ответа против патогенов и определения микробных стратегий, используемых для уклонения от врожденной иммунной системы 15,16,17. Этот тип метода также может быть использован для изучения дифференциальной кинетики фагоцитоза, замедленного закисления фагосом и окислительного взрыва, которые приводят к уменьшению гибели грибков18.

Различные методы могут быть использованы для оценки фагоцитоза, выживаемости грибов и уклонения от процесса созревания фагосом. К ним относятся флуоресцентная микроскопия, которая используется для наблюдения за фагоцитозом, расположением клеток и молекулами, образующимися во время фагоцитоза19; проточная цитометрия, которая дает количественные данные о фагоцитозе и используется для оценки различных маркеров, участвующих в процессе20,21; прижизненная микроскопия, которая используется для оценки микробного захвата и созревания фагосом22; антитело-опосредованный фагоцитоз, который используется для оценки специфичности процесса фагоцитоза для возбудителя23; и другие 24,25,26,27.

Протокол, представленный здесь, использует обычный, недорогой и прямой метод с использованием оптического микроскопа и анализа роста пластин для оценки фагоцитоза и гибели грибковых конидий. Этот протокол предоставит читателям пошаговую инструкцию по проведению анализа фагоцитоза и клиренса с использованием мононуклеарных макрофагов периферической крови человека, подвергшихся воздействию T. stromaticum. ПБМК были использованы в связи с тем, что конидии Trichoderma применяются в качестве биоконтроля против фитопатогенов и биоудобрения для растительных культур во всем мире и вызывают несколько инфекций человека, называемых триходермозами. Кроме того, существует только две предыдущие работы, посвященные взаимодействию между конидиями Trichoderma и иммунной системой человека, в которых мы изучали нейтрофилы28 и аутофагию у макрофагов29. В данной статье сначала показано, как можно изучать фагоцитоз конидий T. stromaticum макрофагами, полученными из PBMC, а затем как можно оценить жизнеспособность поглощенных конидий с помощью простых методов, основанных на микроскопии. Этот протокол может способствовать дальнейшему изучению макрофаг-ассоциированного иммунного ответа или механизмов, связанных с модуляцией иммунной системы.

Protocol

Этические соображения и люди-субъектыВсе эксперименты на людях, описанные в этом исследовании, были проведены в соответствии с Хельсинкской декларацией и федеральными законами Бразилии и одобрены Комитетом по этике Государственного университета Санта-Крус (идентификацио…

Representative Results

Методика фагоцитоза грибковых конидий макрофагами широко используется для исследований, оценивающих модуляцию иммунных реакций против грибов. Мы использовали фагоцитоз конидий T. stromaticum для оценки жизнеспособности конидий после фагоцитоза, поскольку уклонение от фагоцитоза и в?…

Discussion

Для некоторых грибковых патогенов, включая Aspergillus fumigatus, Cryptococcus, Candida albicans и другие, конидиальный или дрожжевой фагоцитоз является ключевым процессом, позволяющим исследовать цитоплазматические и молекулярные события во взаимодействиях макрофагов и патогенов, а также оп…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана следующими бразильскими финансовыми учреждениями: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) с грантами RED0011/2012 и RED008/2014. U.R.S., J.O.C. и M.E.S.M. признают стипендию, предоставленную Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) и FAPESB, соответственно.

Materials

15 mL centrifuge tubes Corning CLS431470 15 mL centrifuge tubes, polypropylene, conical bottom with lid, individually sterile
24-Well Flat Bottom Cell Culture Plate Kasvi K12-024 Made of polystyrene with alphanumeric identification; The Cell Culture Plate is DNase, RNase and pyrogen-free and free of cytotoxic substances; Sterilized by gamma radiation;
Cell culture CO2 incubator Sanyo 303082 A CO2 incubator serves to create and control conditions similar to a human body, thus allowing the in vitro growth and proliferation of different cell types.
Centrifuge Microtube (eppendorf type) 1.5 mL Capp 5101500 Made from polypropylene, with a cap attached to the tube for opening and closing with just one hand. It has a polished interior against protein adhesion and for sample visibility, being free of DNase, RNase and Pyrogens
Circular coverslip 15 mm Olen K5-0015 Circular coverslips are used for microscopy techniques in cell culture. Made of super transparent translucent glass; with thickness of 0.13 mm
Class II Type B2 (Total Exhaust) Biosafety Cabinets Esco Lifesciences group 2010274 Airstream Class II Type B2 Biosafety Cabinets (AB2) provide product, operator and environmental protection and are suitable for work with trace amounts of toxic chemicals and agents assigned to biological safety levels I, II or III. In a Class II Type B2 cabinet, all inflow and downflow air is exhausted after HEPA/ULPA filtration to the external environment without recirculation across the work surface.
Dextrose Potato Agar medium Merck 145 Potato Dextrose Agar is used in the cultivation and enumeration of yeasts and fungi
EDTA vacuum blood collection tube FirstLab FL5-1109L EDTA is the recommended anticoagulant for hematology routines as it is the best anticoagulant for preserving cell morphology.
Entellan Merck 1.07961  Fixative agent; Entellan is a waterless mounting medium for permanent mounting for microscopy.
Fetal Bovine Serum Gibco A2720801 Fetal bovine serum (FBS) is a universal growth supplement of cell and tissue culture media. FBS is a natural cocktail of most of the factors required for cell attachment, growth, and proliferation, effective for most types of human and animal (including insect) cells.
Flaticon  database of images
Glycerol Merck 24900988 The cryoprotectant agent glycerol is used for freezing cells and spores
Histopaque-1077 polysucrose solution
Image J  Image analysis software
Microscopy slides Precision 7105 Slide for Microscopy 26 x 76 mm Matte Lapped Thickness 1.0 to 1.2 mm. Made of special optical glass and packaged with silk paper divider with high quality transparency free of imperfections
Mini centrifuge Prism C1801 The Prism Mini Centrifuge was designed to be extremely compact with an exceptionally small footprint. Includes 2 interchangeable quick-release rotors that spin up to 6000 rpm. An electronic brake provides quick deceleration and the self-opening lid allows easy access to the sample, reducing handling time.
Neubauer chamber Kasvi K5-0011 The Neubauer Counting Chamber is used for counting cells or other suspended particles.
Panoptic fast  Laborclin 620529 Laborclin's  panoptic fast c is a kit for quick staining in hematology
Penicillin/Streptomycin Solution – 10,000U LGC- Biotechnology  BR3011001 antibiotic is used in order to avoid possible contamination by manipulation external to the laminar flow.
Petri dish 90 x 15 mm Smooth Cralplast 18248 Disposable Petri dish; Made of highly transparent polystyrene (PS); flat bottom; Smooth;Size: 90 x 15 mm.
Phosphate buffered saline (PBS) thermo fisher Scientific 10010001 PBS is a water-based saline solution with a simple formulation. It is isotonic and non-toxic to most cells. It includes sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock while maintaining the water balance of living cells.
Pipette Pasteur 3 mL Sterile Accumax AP-3-B-S STERILE ACCUMAX PASTEUR 3 ML PIPETTE with 3 mL capacity, made of transparent low-density polyethylene (LDPE) and individually sterile
Refrigerated Centrifuge Thermo Scientific TS-HM16R The Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R Refrigerated Centrifuge is a refrigerated centrifuge with the user-friendly control panel makes it easy to pre-set the speed, RCF value, running time, temperature, and running profile. The Megafuge 16R can reach maximum speeds of 15,200 RPM and maximum RCF of 25,830 x g.
RPMI-1640 Medium Merck MFCD00217820 HEPES Modification, with L-glutamine and 25 mM HEPES, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture
The single channel micropipettes Eppendorf Z683809 Single-channel micropipettes are used to accurately transfer and measure very small amounts of liquids.
Tip for Micropipettor Corning 4894 Capacity of 10 µL and 1,000 µL Autoclavable
Triocular inverted microscope LABOMED VU-7125500 It allows you to observe cells inside tubes and bottles, without having to open them, thus avoiding contamination problems.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Samuels, G. J. Trichoderma: A review of biology and systematics of the genus. Mycological Research. 100 (8), 923-935 (1996).
  2. Nevalainen, H., Peterson, R., Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. Chapter 7 – Heterologous expression of proteins in Trichoderma. Biotechnology and Biology of Trichoderma. , (2014).
  3. Do Vale, L. H. F., Filho, E. X. F., Miller, R. N. G., Ricart, C. A. O., de Sousa, M. V., Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. Chapter 16 – Cellulase systems in Trichoderma: An overview. Biotechnology and Biology of Trichoderma. , (2014).
  4. Ferreira, N. L., Margeot, A., Blanquet, S., Berrin, J. G., Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. Chapter 17 – Use of cellulases from Trichoderma reesei in the twenty-first century part I: Current industrial uses and future applications in the production of second ethanol generation. Biotechnology and Biology of Trichoderma. , (2014).
  5. Puranen, T., Alapuranen, M., Vehmaanperä, J., Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. Chapter 26 – Trichoderma enzymes for textile industries. Biotechnology and Biology of Trichoderma. , (2014).
  6. Kunamneni, A., Plou, F. J., Alcalde, M., Ballesteros, A., Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. Chapter 24 – Trichoderma enzymes for food industries. Biotechnology and Biology of Trichoderma. , (2014).
  7. Mukherjee, P. K., Horwitz, B. A., Herrera-Estrella, A., Schmoll, M., Kenerley, C. M. Trichoderma research in the genome era. Annual Review of Phytopathology. 51 (1), 105-129 (2013).
  8. Mukherjee, M., et al. Trichoderma-plant-pathogen interactions: Advances in genetics of biological control. Indian Journal of Microbiology. 52 (4), 522-529 (2012).
  9. dos Santos, U. R., dos Santos, J. L. Trichoderma after crossing kingdoms: Infections in human populations. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part B. 26 (2), 97-126 (2023).
  10. Asis, A., et al. Identification patterns of Trichoderma strains using morphological characteristics, phylogenetic analyses and lignocellulolytic activities. Molecular Biology Reports. 48 (4), 3285-3301 (2021).
  11. Antal, Z., et al. Comparative study of potential virulence factors in human pathogenic and saprophytic Trichoderma longibrachiatum strains. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica. 52 (3-4), 341-350 (2005).
  12. Hatvani, L., Manczinger, L., Vágvölgyi, C., Kredics, L., Mukherjee, P. K., Horwitz, B. A., Singh, U. S., Mukherjee, M., Schmoll, M. Trichoderma as a human pathogen. Trichoderma: Biology and Applications. , (2013).
  13. Kredics, L., et al. Clinical importance of the genus Trichoderma: A review. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica. 50 (2-3), 105-117 (2003).
  14. Erwig, L. P., Gow, N. A. R. Interactions of fungal pathogens with phagocytes. Nature Reviews Microbiology. 14 (3), 163-176 (2016).
  15. Nicola, A. M., Casadevall, A. In vitro measurement of phagocytosis and killing of Cryptococcus neoformans by macrophages. Methods in Molecular Biology. 844, 189-197 (2012).
  16. Medina, E., Goldmann, O. In vivo and ex vivo protocols for measuring the killing of extracellular pathogens by macrophages. Current Protocols in Immunology. , 1-17 (2011).
  17. Drevets, D. A., Canono, B. P., Campbell, P. A. Measurement of bacterial ingestion and killing by macrophages. Current Protocols in Immunology. 109, 1-17 (2015).
  18. Gresnigt, M. S., et al. Differential kinetics of Aspergillus nidulans and Aspergillus fumigatus phagocytosis. Journal of Innate Immunity. 10 (2), 145-160 (2018).
  19. Steinberg, B. E., Grinstein, S. Analysis of macrophage phagocytosis: Quantitative assays of phagosome formation and maturation using high-throughput fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 531, 45-56 (2009).
  20. Yan, Q., Ahn, S. H., Fowler, V. G. Macrophage phagocytosis assay of Staphylococcus aureus by flow cytometry. Bio-Protocol. 5 (4), 1406 (2015).
  21. Marr, K. A., Koudadoust, M., Black, M. Early events in macrophage killing of Aspergillus fumigatus conidia New flow cytometric viability assay. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1240-1247 (2001).
  22. Surewaard, B. G. J., Kubes, P. Measurement of bacterial capture and phagosome maturation of Kupffer cells by intravital microscopy. Methods. 128, 12-19 (2017).
  23. Siggins, M. K., et al. Differential timing of antibody-mediated phagocytosis and cell-free killing of invasive African Salmonella allows immune evasion. European Journal of Immunology. 44 (4), 1093-1098 (2014).
  24. Cannon, G. J., Swanson, J. A. The macrophage capacity for phagocytosis. Journal of Cell Science. 101 (4), 907-913 (1992).
  25. Harvath, L., Terle, D. A. Assay for phagocytosis. Methods in Molecular Biology. 115, 281-290 (1999).
  26. dos Santos, A. G., et al. Trichoderma asperelloides spores downregulate dectin1/2 and TLR2 receptors of mice macrophages and decrease Candida parapsilosis phagocytosis independent of the M1/M2 polarization. Frontiers in Microbiology. 8, 1681 (2017).
  27. Souza, J. A. M., et al. Characterization of Aspergillus fumigatus extracellular vesicles and their effects on macrophages and neutrophils functions. Frontiers in Microbiology. 10, 2008 (2019).
  28. Oliveira-Mendonça, L. S., et al. Inhibition of extracellular traps by spores of Trichoderma stromaticum on neutrophils obtained from human peripheral blood. Molecular Immunology. 141, 43-52 (2022).
  29. Oliveira-Mendonça, L. S., et al. Trichoderma stromaticum spores induce autophagy and downregulate inflammatory mediators in human peripheral blood-derived macrophages. Current Research in Microbial Sciences. 3, 100145 (2022).
  30. Johnston, L., Harding, S. A., La Flamme, A. C. Comparing methods for ex vivo characterization of human monocyte phenotypes and in vitro responses. Immunobiology. 220 (12), 1305-1310 (2015).
  31. Abedon, S. T., Bartom, E., Maloy, S., Hughes, K. Multiplicity of infection. Brenner’s Encyclopedia of Genetics. Second Edition. , (2013).
  32. Rios, F. J., Touyz, R. M., Montezano, A. C. Isolation and differentiation of human macrophages. Methods in Molecular Biology. 1527, 311-320 (2017).
  33. Lombard, Y., Giaimis, J., Makaya-Kumba, M., Fonteneau, P., Poindron, P. A new method for studying the binding and ingestion of zymosan particles by macrophages. Journal of Immunological Methods. 174 (1-2), 155-165 (1994).
  34. Ghoneum, M., Gollapudi, S. Phagocytosis of Candida albicans by metastatic and non metastatic human breast cancer cell lines in vitro. Cancer Detection and Prevention. 28 (1), 17-26 (2004).
  35. Nunes, J. P. S., Dias, A. A. M. ImageJ macros for the user-friendly analysis of soft-agar and wound-healing assays. BioTechniques. 62 (4), 175-179 (2017).
  36. Alves-Filho, E. R., et al. The biocontrol fungus Trichoderma stromaticum downregulates respiratory burst and nitric oxide in phagocytes and IFN-gamma and IL-10. Journal of Toxicology and Environmental Health – Part A: Current Issues. 74 (14), 943-958 (2011).
  37. Slesiona, S., et al. Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages. PLoS One. 7 (2), 31223 (2012).
  38. Johnston, S. A., May, R. C. Cryptococcus interactions with macrophages: Evasion and manipulation of the phagosome by a fungal pathogen. Cellular Microbiology. 15 (3), 403-411 (2013).
  39. Alonso, M. F., et al. The nature of the fungal cargo induces significantly different temporal programmes of macrophage phagocytosis. The Cell Surface. 8, 100082 (2022).
  40. Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. Interaction of phagocytes with filamentous fungi. Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).
  41. Dos Santos, U. R., et al. Exposition to biological control agent Trichoderma stromaticum increases the development of cancer in mice injected with murine melanoma. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 252 (2020).
  42. Wang, G., et al. Exopolysaccharide from Trichoderma pseudokoningii induces macrophage activation. Carbohydrate Polymers. 149, 112-120 (2016).
  43. Xu, Y., et al. Exopolysaccharide from Trichoderma pseudokoningii promotes maturation of murine dendritic cells. International Journal of Biological Macromolecules. 92, 1155-1161 (2016).
  44. Schmoll, M., Esquivel-Naranjo, E. U., Herrera-Estrella, A. Trichoderma in the light of day – Physiology and development. Fungal Genetics and Biology. 47 (11), 909-916 (2010).
  45. Zhang, G., Li, D. Trichoderma longibrachiatum-associated skin inflammation and atypical hyperplasia in mouse. Frontiers in Medicine. 9, 865722 (2022).
  46. Paredes, K., Capilla, J., Mayayo, E., Guarro, J. Virulence and experimental treatment of Trichoderma longibrachiatum, a fungus refractory to treatment. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (8), 5029-5032 (2016).
  47. Perkhofer, S., Speth, C., Dierich, M. P., Lass-Flörl, C. In vitro determination of phagocytosis and intracellular killing of Aspergillus species by mononuclear phagocytes. Mycopathologia. 163 (6), 303-307 (2007).

Tags

TrichodermaMacrophagesPhagocytosisImmune SystemViability AssayConidial ClearanceBiocontrol AgentPathogenicityPeripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs)

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
dos Santos, U. R., de Castro, J. O., Santos Matos, M. E., De Bonis, G., dos Santos, J. L. Viability Assay of Trichoderma stromaticum Conidia Inside Human Peripheral Blood Mononuclear-Derived Macrophages. J. Vis. Exp. (200), e65231, doi:10.3791/65231 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image