التألق المناعي المتعدد جنبا إلى جنب مع تحليل الصور المكانية للتقييم السريري والبيولوجي للبيئة المكروية للورم
Summary
في هذه المقالة ، تم وصف بروتوكول لتضخيم إشارة التيراميد اليدوي (TSA) متعدد الإرسال المناعي (mIF) جنبا إلى جنب مع تحليل الصور والتحليل المكاني. يمكن استخدام هذا البروتوكول مع أقسام البارافين المضمنة في الفورمالين (FFPE) لتلطيخ اثنين إلى ستة مستضدات لكل شريحة اعتمادا على ماسح الشرائح المتاح في المختبر.
Abstract
تتكون البيئة المكروية للورم (TME) من عدد كبير من أنواع الخلايا المختلفة ، مثل الخلايا المناعية السامة للخلايا والخلايا المناعية. اعتمادا على تكوينه والتفاعلات بين الخلايا السرطانية والخلايا المحيطة بالورم ، قد يؤثر TME على تطور السرطان. يمكن أن يؤدي توصيف الأورام وبيئتها المكروية المعقدة إلى تحسين فهم أمراض السرطان وقد يساعد العلماء والأطباء على اكتشاف مؤشرات حيوية جديدة.
لقد طورنا مؤخرا العديد من لوحات التألق المناعي المتعدد (mIF) بناء على تضخيم إشارة التيراميد (TSA) لتوصيف TME في سرطان القولون والمستقيم وسرطان الخلايا الحرشفية في الرأس والرقبة وسرطان الجلد وسرطان الرئة. بمجرد الانتهاء من تلطيخ ومسح اللوحات المقابلة ، يتم تحليل العينات على برنامج تحليل الصور. ثم يتم تصدير الموقع المكاني وتلطيخ كل خلية من برنامج القياس الكمي هذا إلى R. لقد طورنا نصوص R التي تسمح لنا ليس فقط بتحليل كثافة كل نوع من الخلايا في العديد من مقصورات الورم (مثل مركز الورم وهامش الورم والسدى) ولكن أيضا لإجراء تحليلات قائمة على المسافة بين أنواع الخلايا المختلفة.
يضيف سير العمل هذا بعدا مكانيا إلى تحليل الكثافة الكلاسيكي الذي يتم إجراؤه بشكل روتيني بالفعل للعديد من العلامات. يمكن أن يسمح تحليل mIF للعلماء بالحصول على فهم أفضل للتفاعل المعقد بين الخلايا السرطانية و TME واكتشاف مؤشرات حيوية تنبؤية جديدة للاستجابة للعلاجات ، مثل مثبطات نقاط التفتيش المناعية والعلاجات المستهدفة.
Introduction
مع تطور العلاجات المستهدفة ومثبطات نقاط التفتيش المناعية ، أصبح من الأهمية بمكان توصيف التفاعلات بين الخلايا السرطانية والبيئة المكروية للورم بشكل أفضل ، وهذا مجال مهم حاليا للبحث الانتقالي. يتكون TME من عدد كبير من أنواع الخلايا المختلفة ، مع توازن الخلايا السامة للخلايا المناعية التي تستهدف الخلايا السرطانية والخلايا المناعية التي يمكن أن تفضل نمو الورم وغزوه1،2،3،4. يمكن أن يؤدي توصيف هذه البيئة المعقدة إلى تحسين فهم أمراض السرطان وقد يساعد العلماء والأطباء على اكتشاف مؤشرات حيوية تنبؤية ونذير جديدة من أجل اختيار المرضى بشكل أفضل للعلاج في المستقبل 5,6. على سبيل المثال ، طور جالون وفريقه Immunoscore ، وهي طريقة تسجيل قابلة للتكرار يمكن استخدامها كعلامة حيوية تنبؤية. يتم حساب Immunoscore باستخدام كثافة خلايا CD3 + و CD8 + T في الهامش الغازي وفي مركز الورم 7,8.
على مدى العقود الماضية ، تم تطوير حلول تجارية ل mIF ، ولكنها غالبا ما تكون باهظة الثمن ومصممة لألواح محددة من المستضدات. للتغلب على الحاجة إلى لوحات محددة من المستضدات في البحث الأكاديمي والانتقالي ، قمنا بتطوير طريقة فعالة من حيث التكلفة لإجراء mIF على أقسام ورم FFPE ، مما يسمح بتلطيخ اثنين إلى ستة مستضدات مضافة إلى تلطيخ نوى الخلية على عينات الإنسان والفئران.
بمجرد تلطيخ أقسام الأنسجة بأكملها ومسحها ضوئيا باستخدام ماسح ضوئي للشرائح الفلورية ، يمكن تحليل العينات بواسطة العديد من برامج تحليل الصور التي تدعم مجموعات البيانات الهرمية الكبيرة. أخيرا ، يمكن استخدام البيانات الأولية في بيئة للحوسبة الإحصائية والرسومات مثل برنامج R (v.4.0.2) من أجل إجراء تحليلات الكثافة والتحليل المكاني.
يتم تقديم بروتوكول محسن للتلطيخ بخمس علامات ، بالإضافة إلى الحيل والنصائح لتحسين اللوحات الجديدة ، في هذه المخطوطة. علاوة على ذلك ، يتم شرح الخطوات التفصيلية لتحليل الصور ووظائف R المستخدمة للتحليل الإحصائي والمكاني.
Protocol
Representative Results
Discussion
أهم المعلمات التي يجب مراعاتها لتحسين تلطيخ تعدد الإرسال هي التخفيف والنوعية واسترجاع المستضد المستخدم لكل جسم مضاد أولي. قبل البدء في بروتوكول تعدد الإرسال ، يجب اختبار التخفيف الأمثل لكل جسم مضاد أولي واسترجاع الحواشي الأمثل (الرقم الهيدروجيني 6 أو الرقم الهيدروجيني 9) باستخدام التلوين الكروموجيني (DAB). ننصح باختبار ثلاثة تخفيفات لكل مخزن مؤقت لاسترجاع المستضد: التخفيف الذي يتم تحديده عادة من قبل العلامة التجارية التي تسوق الجسم المضاد ، ونفس التخفيف مقسم إلى شقين ، ونفس التخفيف مضاعف مرتين (الشكل 8). يعد اختيار التخفيف المناسب خطوة مهمة للغاية للتحقق من خصوصية الجسم المضاد وتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء (SNR) للتلطيخ. بعد اختيار التخفيف المناسب في DAB ، يجب اختبار نفس التخفيف لكل جسم مضاد أساسي باستخدام uniplex TSA. بمجرد اختيار المخزن المؤقت للتخفيف واسترجاع الخاتمة لكل تلطيخ للمستضد ، من المهم أيضا إعداد تسلسل المضاعف بشكل صحيح ؛ على وجه التحديد ، يتم تلطيخ بعض المستضدات بشكل أفضل في الموضع الأول والبعض الآخر في الموضع الأخير. ننصح باختبار وضع العلامات المتعددة باستخدام جميع التباديل الممكنة لاختيار تلطيخ المستضد الذي يجب أن يأتي أولا وثانيا وما إلى ذلك. هذه أيضا خطوة مهمة جدا لأن بعض المستضدات الهشة يمكن أن تتحلل بعد عدة جولات من استرجاع الحاتم ، وبعض المستضدات تكون ملطخة بشكل أفضل بعد عدة جولات من استرجاع الحاتمة. على سبيل المثال ، يكون SNR دائما أعلى في الموضع الأخير ل CD3 وفي الموضع الأول لتلطيخ PD-1. علاوة على ذلك ، يمكن إعاقة تلطيخ العديد من المستضدات الموضعية المشتركة من خلال تأثير مظلة (تشبع المواقع التفاعلية للتيراميد). يمكن تخفيف ذلك عن طريق تقليل تركيز التيراميد. عندما يكون تعبير أحد المستضدات مشروطا بتعبير مستضد آخر (CD8 موجود فقط على الخلايا التائية المعبرة عن CD3) ، فإننا ننصح بتلطيخ المستضد بأوسع تعبير (CD3 في هذه الحالة) بعد الآخر. أخيرا ، يعد اختيار الفلوروكروم المناسب لكل تلطيخ للمستضد وفقا لخصائص الماسح الضوئي خطوة مهمة أيضا لتجنب الكشف المتبادل.
المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي التضخيم ونسبة الإشارة إلى الضوضاء التي تم الحصول عليها. ومع ذلك ، تأتي هذه التقنية مع قيود ، وهي أن التلوين متسلسل ، وأن الفلوروكرومات مرتبطة تساهميا بالأنسجة. ومع ذلك ، بعد إجراء جميع جولات تضخيم إشارة التيراميد ، من الممكن أيضا إضافة تلطيخ أخير بجسم مضاد ثانوي مقترن مباشرة بالفلوروكروم (بدون TSA). في بعض اللوحات ، استخدمنا هذه الطريقة لإضافة تلطيخ في قناة 750. كان هذا ضروريا لأنه لم يكن هناك تيراميد-AF750 متاحا تجاريا في ذلك الوقت. من الجدير بالذكر أن وقت التعرض (أثناء الفحص) للمستضد الملطخ ب AF750 سيكون أطول بكثير من المستضدات الأخرى الملطخة ب TSA. في هذه الحالة ، ننصح بتلطيخ بروتين عالي التعبير مثل السيتوكيراتين أو زيادة تركيز الجسم المضاد الأساسي. من خلال القيام بذلك ، من الممكن تلطيخ ما يصل إلى خمسة إلى ستة مستضدات كحد أقصى لكل شريحة في دفعة واحدة اعتمادا على الماسح الضوئي الفلوري.
في المقابل ، تستخدم العديد من التقنيات المتاحة تجاريا تلطيخا تسلسليا بعدة جولات من التلوين والمسح والتجريد أو التبييض الضوئي لتحسين عدد المستضدات التي يمكن تلطيخها في قسم واحد من الأنسجة. ومع ذلك ، غالبا ما تستغرق هذه التقنيات وقتا طويلا ، ومكلفة ، ولا تحتوي على تضخيم للإشارة ، وتتطلب خطوات حسابية متقدمة لدمج عمليات المسح التسلسلي بشكل صحيح ، وفي تجربتنا ، يمكن أن تؤدي إلى تلف الأنسجة الذي لا رجعة فيه بسبب خطوات الإجراء العديدة. ومع ذلك ، فقد تم الإبلاغ عن أنه يمكن تلطيخ ما يصل إلى 30 مستضدا على نسيج واحد باستخدام هذه الطريقة14.
في الختام ، طريقتنا هي تقنية قوية وقابلة للتكرار وسهلة الاستخدام وفعالة من حيث التكلفة يمكن استخدامها في أي مختبر يمتلك ماسح ضوئي للشرائح الفلورية. يمكن استخدام أي جسم مضاد أولي تجاري مناسب للمدينة العالمية للخدمات الإنسانية ، والألواح ليست خاصة بأي مجموعات تجارية. يمكن إجراء تحليل الصور على عدة برامج مختلفة ، بما في ذلك البرامج مفتوحة المصدر مثل QuPath و R. ومع ذلك ، نعتقد أنه يمكن تحسين هذه الطريقة في المستقبل لألواح المستضد الكبيرة ، مما يسمح بإجراء تلطيخ / مسح تسلسلي لنفس الشريحة بألواح مختلفة من المستضدات ومع ميزة تضخيم الإشارة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يشكروا الدكتورة دروان ف. على مساعدتها ودعمها. نيكولاس هويغي هو زميل باحث مدعوم بمنحة من الصندوق الوطني البلجيكي للبحث العلمي (Télévie / FNRS 7460918F).
Materials
| anti-CD3 primary antibody | Abcam | ab16669 | rabbit monocolonal |
| anti-CD8 primary antibody | DAKO | M710301 | mouse monoclonal |
| anti-hPanCK primary antibody | DAKO | M3515 | mouse monoclonal |
| anti-PD-1 primary antibody | Cell Signalling | D4W2J | rabbit monocolonal |
| anti-PD-L1 primary antibody | Cell Signalling | 13684 | rabbit monocolonal |
| anti-RORC primary antibody | Sigma | MABF81 | mouse monoclonal |
| ATTO-425 | ATTOtec | ||
| Axioscan Z1 | Zeiss | Light source: Colibri 7 (385, 430, 475, 555, 590, 630, 735 nm) Filtersets: Excitation 379/34 – beam splitter 409 – emission 440/40; Excitation 438/24 – beam splitter 458 – emission 483/32; Excitation 490/20 – beam splitter 505 – emission 525/20; Excitation 546/10 – beam splitter 556 – emission 572/23; Excitation 592/21 – beam splitter 610 – emission 630/30; Excitation 635/18 – beam splitter 652 – emission 680/42; Excitation 735/40 – beam splitter QBS 405 + 493 + 611 + 762 – emission QBP 425/30 + 524/51 + 634/38 + 785/38; Objective: Plan-Apochromat 20x/0.8; Camera : Orca Flash 4.0 V3 | |
| Borosilicate Cover Glass | VWR | 631-0146 | |
| Envision+ anti-mouse | DAKO | K4001 | |
| Envision+ anti-rabbit | DAKO | K4003 | |
| Fluorescence mounting medium | DAKO | S3023 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 750 | ThermoFischer | A-21037 | |
| HALO software | Indicalabs | ||
| Hoescht | Sigma | 14533 | |
| Superfrost plus microscope slides | Fisherscientific/Epredia | 10149870 | |
| Tyramide-AF488 | ThermoFischer | B40953 | |
| Tyramide-AF555 | ThermoFischer | B04955 | |
| Tyramide-AF647 | ThermoFischer | B04958 |
References
- Ge, P., et al. Profiles of immune cell infiltration and immune-related genes in the tumor microenvironment of colorectal cancer. Biomedicine & Pharmacotherapy. 118, 109228 (2019).
- Fridman, W. H. The immune microenvironment as a guide for cancer therapies. Oncoimmunology. 1 (3), 261-262 (2012).
- Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. The immune contexture in human tumours: Impact on clinical outcome. in Nature Reviews. Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Calu, V., et al. Key biomarkers within the colorectal cancer related inflammatory microenvironment. Scientific Reports. 11 (1), 7940 (2021).
- Havel, J. J., Chowell, D., Chan, T. A. The evolving landscape of biomarkers for checkpoint inhibitor immunotherapy. Nature Reviews. Cancer. 19 (3), 133-150 (2019).
- Pages, F., et al. International validation of the consensus Immunoscore for the classification of colon cancer: a prognostic and accuracy study. Lancet. 391 (10135), 2128-2139 (2018).
- Mlecnik, B., et al. Integrative analyses of colorectal cancer show immunoscore is a stronger predictor of patient survival than microsatellite instability. Immunity. 44 (3), 698-711 (2016).
- Gu, Z., Eils, R., Schlesner, M. Complex heatmaps reveal patterns and correlations in multidimensional genomic data. Bioinformatics. 32 (18), 2847-2849 (2016).
- Baddeley, A., Rubak, E., Turner, R. . Spatial Point Patterns: Methodology and Applications with R. , (2022).
- Barua, S., et al. Spatial interaction of tumor cells and regulatory T cells correlates with survival in non-small cell lung cancer. Lung Cancer. 117, 73-79 (2018).
- Parra, E. R. Methods to determine and analyze the cellular spatial distribution extracted from multiplex immunofluorescence data to understand the tumor microenvironment. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 668340 (2021).
- El Sissy, C., et al. A diagnostic biopsy-adapted immunoscore predicts response to neoadjuvant treatment and selects patients with rectal cancer eligible for a watch-and-wait strategy. Clinical Cancer Research. 26 (19), 5198-5207 (2020).
- Bolognesi, M. M., et al. Multiplex staining by sequential immunostaining and antibody removal on routine tissue sections. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).
