Imágenes de micro-TC y análisis morfométrico de cerebros neonatales de ratones

La microtomografía computarizada (micro-TC) es una herramienta valiosa para diferentes campos de investigación. En biología, es especialmente adecuado para la investigación ósea debido a la absorción de rayos X en los tejidos mineralizados. Debido a esta característica, se han abordado diversas cuestiones relacionadas con el desarrollo óseo¹, el metabolismo² y la evolución ^3,4, entre otros temas, con la ayuda de micro-CT. En 2008, de Crespigny et ^al.5 demostraron que se podían obtener imágenes de micro-TC de cerebros adultos de ratón y conejo utilizando yodo como agente de contraste. Este trabajo abrió una nueva aplicación para esta técnica de imagen, ya que el yodo permitió la adquisición de imágenes de tejidos blandos que de otro modo serían insensibles a los rayos X. Por lo tanto, el objetivo general de combinar la micro-TC y un agente de contraste a base de yodo es obtener imágenes de alta resolución, en las que los tejidos blandos puedan distinguirse e identificarse a nivel anatómico meso o macro.

Esta técnica tiene un potencial notable para estudios que requieren una caracterización fenotípica detallada ex vivo de especímenes pequeños, como embriones de ratón, que son ampliamente utilizados en diseños experimentales⁶. El contraste de yodo en combinación con imágenes de micro-TC se ha utilizado para obtener cuantificaciones volumétricas de órganos⁷ y estructuras tridimensionales (3D) de puntos de referencia ^8,9. En los últimos años, se ha aplicado la microtomografía computarizada de muestras teñidas para describir las características fenotípicas cerebrales de roedores¹⁰, y se han propuesto diferentes mejoras a la técnica. Para cerebros adultos, se encontró que un protocolo de 48 h de inmersión en yodo, con un paso previo de perfusión con un hidrogel, produjo imágenes de alta calidad¹¹. Gignac et ^al.12 ampliaron los límites de esta técnica al demostrar que cerebros de rata teñidos con yodo podían ser procesados para realizar técnicas histológicas rutinarias. Del mismo modo, estos procedimientos demuestran resultados prometedores para cerebros de roedores embrionarios y pre-destete 8,13,14,15.

Aunque la neurociencia ha aplicado en gran medida técnicas basadas en microscopios para evaluar diferentes aspectos estructurales y funcionales del desarrollo cerebral, estos estudios son más adecuados para caracterizar poblaciones celulares específicas o estructuras espacialmente limitadas. Por el contrario, la imagen de micro-TC permite la descripción de estructuras completas y la adquisición de modelos 3D que conservan información espacial relevante, que es complementaria a las técnicas microscópicas. La resonancia magnética (RM) también es una técnica estándar aplicada para explorar las características estructurales de los pequeños animales 16,17,18. Sin embargo, la micro-TC, con el uso de un agente de contraste, tiene dos ventajas principales para las muestras fijas ex vivo: los escáneres de micro-TC son en gran medida menos costosos y fáciles de operar, y permiten una resolución espacial más alta que la RM¹².

El objetivo de este trabajo es describir el procedimiento para obtener imágenes de alta resolución de cerebros de ratones neonatos mediante microtomografía computarizada después de la tinción con la solución de Lugol, un agente de contraste a base de yodo. Se presenta un protocolo integral, que comienza con etapas preliminares, como la recolección de muestras y la fijación de tejidos, y pasa por la tinción, la adquisición de imágenes por micro-TC y el procesamiento estándar. El procesamiento de imágenes incluye la segmentación de un volumen 3D de la cabeza completa, así como del cerebro, y la selección de planos anatómicos específicos para digitalizar coordenadas puntuales que luego podrían utilizarse en análisis morfométricos. Aunque el enfoque aquí es el cerebro de ratón neonatal, se pueden aplicar estrategias similares a otros tejidos blandos. Por lo tanto, el protocolo presentado aquí es lo suficientemente flexible como para ser aplicado, con modificaciones sutiles, a otros tipos de muestras.