Micro-CT-beeldvorming en morfometrische analyse van neonatale hersenen van muizen
Summary
Deze studie beschrijft de stappen voor het verkrijgen van beelden met een hoge resolutie van neonatale muizenhersenen door micro-computertomografie (micro-CT) en een contrastmiddel te combineren in ex vivo monsters. We beschrijven basis morfometrische analyses om de grootte en vorm van de hersenen in deze beelden te kwantificeren.
Abstract
Neurobeelden zijn een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van hersenmorfologie in experimenten met diermodellen. Magnetische resonantiebeeldvorming (MRI) is de standaardmethode geworden voor zachte weefsels, hoewel de lage ruimtelijke resolutie enkele beperkingen met zich meebrengt voor kleine dieren. Hier beschrijven we een protocol voor het verkrijgen van driedimensionale (3D) informatie met hoge resolutie over de hersenen en schedels van pasgeborenen van muizen met behulp van micro-computertomografie (micro-CT). Het protocol omvat de stappen die nodig zijn om de monsters te ontleden, de hersenen te kleuren en te scannen, en morfometrische metingen van het hele orgaan en de interessegebieden (ROI’s) te verkrijgen. Beeldanalyse omvat de segmentatie van structuren en de digitalisering van puntcoördinaten. Kortom, dit werk laat zien dat de combinatie van micro-CT en Lugol’s oplossing als contrastmiddel een geschikt alternatief is voor het in beeld brengen van de perinatale hersenen van kleine dieren. Deze beeldvormingsworkflow heeft toepassingen in de ontwikkelingsbiologie, biogeneeskunde en andere wetenschappen die geïnteresseerd zijn in het beoordelen van het effect van verschillende genetische en omgevingsfactoren op de ontwikkeling van de hersenen.
Introduction
Micro-computertomografie (micro-CT) beeldvorming is een waardevol hulpmiddel voor verschillende onderzoeksgebieden. In de biologie is het vooral geschikt voor botonderzoek vanwege de absorptie van röntgenstraling in gemineraliseerde weefsels. Vanwege deze functie zijn diverse vragen over onder andere botontwikkeling1, metabolisme2 en evolutie 3,4 benaderd met behulp van micro-CT. In 2008 toonden de Crespigny et al.5 aan dat micro-CT-beelden van volwassen muizen- en konijnenhersenen konden worden verkregen met jodium als contrastmiddel. Dit werk opende een nieuwe toepassing voor deze beeldvormingstechniek, aangezien jodium het mogelijk maakte beelden te verkrijgen van zachte weefsels die anders ongevoelig zouden zijn voor röntgenstralen. Het algemene doel van het combineren van micro-CT en een contrastmiddel op basis van jodium is dus het verkrijgen van beelden met een hoge resolutie, waarin zachte weefsels kunnen worden onderscheiden en geïdentificeerd op meso- of macro-anatomisch niveau.
Deze techniek heeft een opmerkelijk potentieel voor studies die gedetailleerde ex vivo fenotypische karakterisering vereisen van kleine exemplaren, zoals muizenembryo’s, die veel worden gebruikt in experimentele ontwerpen6. Jodiumcontrast in combinatie met micro-CT-beeldvorming is gebruikt om volumetrische kwantificeringen van organen7 en historische driedimensionale (3D) structuren te verkrijgen 8,9. In de afgelopen jaren is micro-CT-scanning van gekleurde monsters toegepast om fenotypische kenmerken van knaagdieren in de hersenen te beschrijven10, en er zijn verschillende verbeteringen aan de techniek voorgesteld. Voor volwassen hersenen bleek een protocol van 48 uur onderdompeling in jodium, met een voorafgaande stap van perfusie met een hydrogel, beelden van hoge kwaliteit te produceren11. Gignac et al.12 verlegden de grenzen van deze techniek door aan te tonen dat rattenhersenen die met jodium waren gekleurd, konden worden verwerkt om routinematige histologische technieken uit te voeren. Evenzo laten deze procedures veelbelovende resultaten zien voor embryonale en pre-spenende knaagdierhersenen 8,13,14,15.
Hoewel de neurowetenschap grotendeels op microscoop gebaseerde technieken heeft toegepast om verschillende structurele en functionele aspecten van de ontwikkeling van de hersenen te beoordelen, zijn dergelijke studies geschikter voor het karakteriseren van specifieke celpopulaties of ruimtelijk beperkte structuren. Omgekeerd maakt micro-CT-beeldvorming het mogelijk om hele structuren te beschrijven en 3D-modellen te verwerven die relevante ruimtelijke informatie bewaren, wat complementair is aan microscopische technieken. Magnetic Resonance Imaging (MRI) is ook een standaardtechniek die wordt toegepast om de structurele kenmerken van kleine dieren te onderzoeken 16,17,18. Micro-CT, met het gebruik van een contrastmiddel, heeft echter twee belangrijke voordelen voor ex vivo vaste monsters: micro-CT-scanners zijn veel goedkoper en eenvoudig te bedienen, en maken een hogere ruimtelijke resolutie mogelijk dan MRI12.
Dit werk heeft tot doel de procedure te beschrijven om beelden met een hoge resolutie te verkrijgen van neonatale muizenhersenen met behulp van micro-CT-scanning na kleuring met de oplossing van Lugol, een contrastmiddel op basis van jodium. Er wordt een uitgebreid protocol gepresenteerd, dat begint met voorbereidende fasen zoals monsterverzameling en fixatie van weefsels, en gaat door kleuring, micro-CT-beeldacquisitie en standaardverwerking. Beeldverwerking omvat de segmentatie van een 3D-volume van het volledige hoofd, evenals van de hersenen, en de selectie van specifieke anatomische vlakken om puntcoördinaten te digitaliseren die vervolgens kunnen worden gebruikt in morfometrische analyses. Hoewel de focus hier ligt op het neonatale muizenbrein, kunnen vergelijkbare strategieën worden toegepast op andere zachte weefsels. Het hier gepresenteerde protocol is dus flexibel genoeg om, met subtiele aanpassingen, te worden toegepast op andere soorten monsters.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit werk wordt een beknopt protocol geïntroduceerd om neonatale hersenweefsels van muizen te scannen met behulp van micro-CT met een contrastmiddel. Bovendien bevat het eenvoudige procedures om kwantitatieve en kwalitatieve output te verkrijgen. Voortbouwend op deze methoden kunnen verdere alternatieve of aanvullende analyses worden uitgevoerd.
Zoals in het protocol te zien is, kunnen micro-CT-beelden op verschillende manieren worden geanalyseerd. In eerdere studies schatte onze groep de g…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Wei Liu voor zijn technische assistentie. Dit werk wordt gefinancierd door ANPCyT PICT 2017-2497 en PICT 2018-4113.
Materials
| µCT 35 | Scanco Medical AG | Note that Scanco does not offer the µCT 35 anymore. Their smallest scanner is now the µCT 45 | |
| Avizo | Visualization Sciences Group, VSG | ||
| C57BL/6 Mice | Bioterio Facultad de Ciencias Veterinarias Universidad Nacional de La Plata | ||
| Conical tubes | Daigger | CH-CI4610-1856 | |
| Flux cabinet | Esco | AC2-458 | |
| Glass beaker | Glassco | GL-229.202.10 | |
| Glass bottle | Simax | CFB017 | |
| Glass funnel | HDA | VI1108 | |
| HCl | Carlo Erba | 403872 | Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| I2 | Cicarelli | 804211 | When preparing I2KI, manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| KI | Cicarelli | PA131542.1210 | When preparing I2KI, manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| Magnetic stirring | Arcano | 4925 | |
| NaOH | Cicarelli | 1580110 | Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| Orbital shaker | Biomint | BM021 | |
| Paraformaldehyde | Biopack | 2000959400 | Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| Paton spatula | Glassco | GL-377.303.01 | |
| PBS | Biopack | 2000988800 | |
| Plastic Pasteur pipette | Daigger | 9153 | |
| R | R Project | The package geomorph for R was used in the protocol (https://cran.r-project.org/web/packages/geomorph/index.html) | |
| Scissors | Belmed | ||
| Sodium azide | Biopack | 2000163500 | |
| Thermometer | Daigger | 7650 |
References
- Altman, A. R., et al. Quantification of skeletal growth, modeling, and remodeling by in vivo micro-computed tomography. Bone. 81, 370-379 (2015).
- Wehrle, E., et al. Spatio-temporal characterization of fracture healing patterns and assessment of biomaterials by time-lapsed in vivo micro-computed tomography. Scientific Reports. 11 (1), 8660 (2021).
- Arístide, L., et al. Brain shape convergence in the adaptive radiation of New World monkeys. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 2158-2163 (2016).
- Paluh, D. J., Stanley, E. L., Blackburn, D. C. Evolution of hyperossification expands skull diversity in frogs. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (15), 8554-8562 (2020).
- de Crespigny, A., et al. 3D micro-CT imaging of the postmortem brain. Journal of Neuroscience Methods. 171 (2), 207-213 (2008).
- Gignac, P. M., et al. Diffusible iodine-based contrast-enhanced computed tomography (diceCT): an emerging tool for rapid, high-resolution, 3-D imaging of metazoan soft tissues. Journal of Anatomy. 228 (6), 889-909 (2016).
- Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. A novel 3D mouse embryo atlas based on micro-CT. Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).
- Gonzalez, P. N., et al. Chronic protein restriction in mice impacts placental function and maternal body weight before fetal growth. PLoS One. 11 (3), 0152227 (2016).
- Watanabe, A., et al. Are endocasts good proxies for brain size and shape in archosaurs throughout ontogeny. Journal of Anatomy. 234 (3), 291-305 (2019).
- Gignac, P. M., Kley, N. J. The utility of diceCT imaging for high-throughput comparative neuroanatomical studies. Brain, Behavior and Evolution. 91 (3), 180-190 (2018).
- Anderson, R., Maga, A. M. A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with microCT using iodine-based contrast. PLoS One. 10 (11), e0142974 (2015).
- Gignac, P. M., O’Brien, H. D., Sanchez, J., Vazquez-Sanroman, D. Multiscale imaging of the rat brain using an integrated diceCT and histology workflow. Brain Structure & Function. 226 (7), 2153-2168 (2021).
- Wong, M. D., Spring, S., Henkelman, R. M. Structural stabilization of tissue for embryo phenotyping using micro-CT with iodine staining. PLoS One. 8 (12), e84321 (2013).
- Barbeito-Andrés, J., et al. Congenital Zika syndrome is associated with maternal protein malnutrition. Science Advances. 6 (2), (2020).
- Handschuh, S., Glösmann, M. Mouse embryo phenotyping using X-ray microCT. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 949184 (2022).
- Turnbull, D. H., Mori, S. MRI in mouse developmental biology. NMR in Biomedicine. 20 (3), 265-274 (2007).
- Qiu, L. R., et al. Mouse MRI shows brain areas relatively larger in males emerge before those larger in females. Nature Communications. 9, 2615 (2018).
- Lerch, J. P., Sled, J. G., Henkelman, R. M. MRI phenotyping of genetically altered mice. Methods in Molecular Biology. 711, 349-361 (2011).
- Gonzalez, P. N., Kristensen, E., Morck, D. W., Boyd, S., Hallgrímsson, B. Effects of growth hormone on the ontogenetic allometry of craniofacial bones. Evolution & Development. 15 (2), 133-145 (2016).
- Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
- Vickerton, P., Jarvis, J., Jeffery, N. Concentration-dependent specimen shrinkage in iodine-enhanced microCT. Journal of Anatomy. 223 (2), 185-193 (2013).
- Dawood, Y., et al. Reducing soft-tissue shrinkage artefacts caused by staining with Lugol’s solution. Scientific Reports. 11, 19781 (2021).
