Explantes Cocleares Neonatais Totais como Modelo In vitro
Summary
O protocolo atual atualiza protocolos anteriores e incorpora abordagens relativamente simples para a cultura de explantes cocleares de alta qualidade. Isso fornece aquisição de dados confiável e imagens de alta resolução em células vivas e fixas. Este protocolo apoia a tendência contínua de estudar as células da orelha interna.
Abstract
A perda auditiva não tratada impõe custos significativos ao sistema de saúde global e prejudica a qualidade de vida dos indivíduos. A perda auditiva neurossensorial é caracterizada pela perda cumulativa e irreversível das células ciliadas sensoriais e dos nervos auditivos na cóclea. Explantes cocleares inteiros e vitais são uma das ferramentas fundamentais na pesquisa auditiva para detectar a perda de células ciliadas e caracterizar os mecanismos moleculares das células da orelha interna. Há muitos anos, foi desenvolvido um protocolo de isolamento coclear neonatal que, embora tenha sido modificado ao longo do tempo, ainda apresenta potencial de melhoria.
Este trabalho apresenta um protocolo otimizado para isolamento e cultura de explantes cocleares neonatais inteiros em câmaras de cultura multipoços que possibilita o estudo das células ciliadas e das células neurais do gânglio espiral ao longo de toda a extensão da cóclea. O protocolo foi testado utilizando explantes cocleares de camundongos e ratos. Explantes cocleares saudáveis foram obtidos para estudar a interação entre as células ciliadas, as células do gânglio espiral do neurônio e as células de suporte adjacentes.
Uma das principais vantagens desse método é que ele simplifica as etapas de cultura de órgãos sem comprometer a qualidade dos explantes. Todas as três voltas do órgão de Corti estão presas ao fundo da câmara, o que facilita os experimentos in vitro e a análise abrangente dos explantes. Apresentamos alguns exemplos de imagens cocleares de diferentes experimentos com explantes vivos e fixos, demonstrando que os explantes mantêm sua estrutura apesar da exposição a drogas ototóxicas. Este protocolo otimizado pode ser amplamente utilizado para a análise integrativa da cóclea de mamíferos.
Introduction
A maioria dos casos de perda auditiva neurossensorial é decorrente da degeneração das células ciliadas sensoriais, das células do nervo auditivo e/ou das sinapsesauditivas1. Este processo degenerativo nas células sensoriais é progressivo e geralmente irreversível, resultando em perdaauditiva2. Portanto, informações sobre a viabilidade das células sensoriais e alterações nas vias de sinalização sob condições de estresse são fundamentais para proteger as células de danos e, consequentemente, perdas. A pesquisa de explantes cocleares em cultura permite a recapitulação do complexo tecidual e a manutenção de uma rede célula-célula normal, o que possibilita uma melhor descrição dos processos de sinalização. Para estabelecer modelos experimentais de ototoxicidade, o antibiótico gentamicina e o quimioterápico cisplatina têm sido frequentemente utilizados, pois são conhecidos por apresentarem efeitos colateraisototóxicos3.
Sistemas de cultivo in vitro de explantes cocleares têm sido desenvolvidos e modificados ao longo do tempo; No entanto, uma descrição do protocolo stepwise para a cultura de explantes cocleares inteiros é frequentemente ausente em várias publicações. Um dos primeiros protocolos de vídeo para cultura primária do órgão murino de Corti foi publicado por Parker et al., no qual os autores descreveram os passos para o isolamento do epitélio sensorial, cultivo em lamínulas de vidro e eletroporação de explantes para experimentos de transfecção4. Outro protocolo utilizando lamínulas de vidro também foi publicado anteriormente, no qual foi considerada a organização da estrutura celular na orelhainterna5. Um protocolo alternativo utilizando membrana de Millicell para cultura de explantes murinos do órgão de Corti e órgão vestibular tem sidorelatado6. Essas reportagens em vídeo contribuíram para o aprimoramento do método, mas ainda há desafios que precisam ser resolvidos. Para resolver uma série de questões decorrentes do uso de lamínulas e insertos de vidro, o presente protocolo visa agilizar as etapas de cultura de órgãos e cultura de órgãos de alta qualidade para obter dados confiáveis. Isso é conseguido minimizando o manuseio direto do órgão durante os procedimentos experimentais e evitando a transferência de órgãos antes de obter imagens de alta resolução das células vivas e fixas.
O presente protocolo atualiza os sistemas de cultivo in vitro publicados anteriormente e introduz diversas otimizações no isolamento do órgão de Corti e transferência para as câmaras de cultura, bem como a integração de uma nova câmara de lâminas para melhorar as condições de cultura e posterior análise. Esse protocolo otimizado reduz o risco de lesão do órgão, o que pode ocorrer com o uso de lamínulas de vidro durante a troca do meio ou durante a transferência do órgão de lamínulas ou membranas para análiseposterior4,5,6. As tampas de vidro têm um índice reflexivo melhor do que as de plástico; eles são, no entanto, frágeis e podem quebrar mais facilmente. As câmaras de poços múltiplos usadas aqui são anexadas a uma lâmina de microscópio, que são adequadas para cultura de órgãos e para imagens de alta resolução. A transferência dos órgãos isolados é realizada com uma espátula, que permite que o órgão seja trazido na orientação correta e deslizado para dentro da câmara, em vez de aplicar força com uma pipeta, como previamente recomendado 4,5,6.
As câmaras multipoços revestidas com poli-D-lisina, que devem conter meio suficiente, facilitam a transferência de órgãos e o posicionamento adequado dos explantes, sem aplicar pressão adesiva e evitando a sobreposição de órgãos, como mencionado anteriormente6. Além disso, sobreposições acidentais de órgãos e estruturas irregulares são resolvidas usando uma pilha Z confocal. Este protocolo tem sido otimizado para diversas aplicações, tais como explantes de camundongos e ratos, explantes do órgão de Corti e cóclea, cultivo em meio contendo e sem soro, avaliações ototóxicas e experimentos gerais de resposta a drogas. Os explantes cocleares são montados e incubados em câmaras com fundo de lamínula, o que facilita a adesão dos explantes cocleares às câmaras para o manuseio ideal durante os experimentos in vitro , o pós-processamento dos explantes e a obtenção de imagens de explantes cocleares vivos e fixos. A visualização de toda a extensão do órgão de Corti e a quantificação das células ciliadas são simplificadas. Além disso, as avaliações das células de suporte, células neurais do gânglio espiral e neuritos são precisas. Portanto, este protocolo pode ser utilizado para uma análise abrangente das células cocleares de mamíferos.
Protocol
Representative Results
Discussion
O objetivo da atualização deste protocolo foi agilizar as etapas desde o isolamento dos explantes até a obtenção de imagens das células cocleares vivas e fixas. Aprimoramos algumas etapas durante o isolamento e introduzimos algumas ferramentas inovadoras com o objetivo de estabelecer um protocolo eficiente e de bom funcionamento para a obtenção de explantes de alta qualidade. O método descrito é um protocolo otimizado a partir de relatos anteriores 4,5. Além disso, alguns estudos atuais carecem de um protocolo atualizado passo a passo. Com etapas simplificadas de cultivo de explantes, este protocolo proporciona o fácil manuseio de explantes bem preservados, o que é essencial para dados reprodutíveis. A introdução de câmaras multipoços com lamínula polimérica para explantes da orelha interna melhora a fixação do órgão e a preservação dos explantes intactos. Aqui, apresentamos vários exemplos de experimentos sob condições de estresse para demonstrar que os órgãos em cultura mantêm sua organização celular apesar da perda de células ciliadas e danos aos neuritos.
Um dos desafios na cultura dos órgãos da orelha interna é evitar o descolamento e a flutuação dos órgãos, pois isso afeta a integridade dos explantes, a resposta ao tratamento e os exames subsequentes. Previamente, os explantes foram cultivados em lamínulas de vidro 4,5. Embora a cultura em superfícies de vidro pareça ser uma boa alternativa, o revestimento do vidro é demorado, e as próprias lamínulas são frágeis e delicadas. Um protocolo alternativo usando cultura de células milicelulares insere tentativas de resolver esse problema6. No entanto, cortar e transferir a membrana com os explantes parece ser uma etapa delicada nesse protocolo. Além disso, os explantes podem ser danificados durante a montagem e vedação da lamínula. Em nossa abordagem proposta, uma vez que os explantes são transferidos para as câmaras revestidas de poli-D-lisina e colocados na posição correta, nenhuma transferência adicional ou cobertura com lamínulas é necessária. Outra vantagem deste protocolo é o uso de câmaras com uma fina lamínula polimérica permeável a gás que proporciona condições ideais de cultura para os explantes do órgão. Este polímero tem uma qualidade óptica semelhante ao vidro, tornando-o adequado para imagens celulares em microscopia de alta resolução.
A adição de soro ao meio é utilizada na maioria dos protocolos de cultura de células e tecidos, incluindo o cultivo de explantes da orelha interna com SFB a 1%-10%4,5,6,16. A presença de soro afeta as condições de cultura dos experimentos; Assim, em determinadas situações, a cultura sem soro é preferida. A ausência de soro na cultura dos explantes cocleares foi substituída pela adição de N2 ao DMEM ou pela adição de N2 ao meio Neurobasal-A 5,6. Nesse sentido, foram testadas as condições de cultivo dos explantes com e sem soro. Em ambas as condições, as células da orelha interna foram vitais e responderam às condições ototóxicas. Testamos essas condições por 72 h, mas os explantes podem ser mantidos em cultura por ainda mais tempo, principalmente quando incubados com meio livre de soro juntamente com N2, B27 e fatores de crescimento, como sugerido em outros estudos 5,16.
Além das etapas críticas gerais no isolamento dos explantes da orelha interna, como a duração do isolamento do órgão e o antibiótico utilizado, existem também algumas etapas críticas nesse protocolo, que são, no entanto, manejáveis. Uma das etapas críticas desse método está relacionada ao volume de meio que permanece na câmara após a inserção do órgão. Isso foi otimizado para manter os explantes vivos e presos à superfície inferior. Outra etapa crítica está relacionada ao tempo de incubação necessário para permitir que os explantes se fixem ao fundo da câmara. Tempos de incubação superiores a 2 h com alguns microlitros de meio podem afetar a saúde dos explantes. Tempos de incubação mais curtos, como 1 h, também podem ser utilizados, desde que se tome cuidado para não desprender os explantes. Outro aspecto importante são os resíduos de poli-D-lisina. As etapas de lavagem da poli-D-lisina devem ser rigorosamente seguidas, porque os resíduos do sal de brometo de poli-D-lisina podem ser tóxicos para as células. Após as etapas de lavagem terem sido seguidas com precisão, o revestimento com poli-D-lisina facilita a adesão suave dos explantes às câmaras para que a posição possa ser corrigida antes que eles fiquem firmemente presos ao fundo da câmara.
Uma das limitações deste método é a obtenção de imagens de células usando microscopia vertical. Esta poderia ser uma questão importante para os laboratórios com microscópios invertidos. Lâminas de vidro com câmaras de silicone removíveis podem ser usadas para microscopia vertical e invertida; no entanto, nossas condições de revestimento com poli-D-lisina precisam ser testadas primeiro. Outra limitação é o armazenamento das câmaras, pois as pastilhas não são removíveis, e a altura total de uma câmara com a tampa é de quase 11 mm em comparação com a altura de 1 mm de uma lâmina de microscópio padrão. No entanto, a câmara de 8 poços usa menos espaço do que as placas de 4 poços sugeridas antes de16.
Apresentamos aqui imagens adquiridas com dois microscópios. Enquanto o microscópio confocal de varredura pontual fornece imagens de alta resolução dos tecidos devido à sua fina seção óptica, o microscópio confocal de disco giratório fornece um tempo de imagem mais rápido com boa resolução. Os estereocílios das células ciliadas internas (CCI) e das células ciliadas externas (CCEs) são visualizados por microscopia confocal. Como os estereocílios das CCH são maiores que os das CCEs, elas foram repetidamente e bem visualizadas neste trabalho. Para os estereocílios de CCE, outros microscópios alternativos podem melhorar a visualização, como a microscopia de super-resolução (SRM). As imagens de explante adquiridas com o microscópio de disco giratório são suficientes para a fácil integração da contagem automatizada de células ciliadas usando uma abordagem de aprendizado profundo12. Além disso, o curto tempo de aquisição é importante para experimentos com células e tecidos vivos. Além disso, este protocolo não se limita aos explantes cocleares neonatais. Com algumas otimizações, outros explantes, como órgãos vestibulares ou tecidos embrionários, também podem ser cultivados.
A quantificação in vitro de células cocleares, como células ciliadas e neurônios, é importante para avaliar a viabilidade celular e, consequentemente, o percentual de células danificadas ou perdidas. Investigações de vias de sinalização e funções celulares ajudam a revelar os mecanismos de morte e sobrevivência. Exames de tecidos cocleares embrionários e neonatais são úteis para investigar os estágios de desenvolvimento da cóclea. Portanto, este protocolo ajudará a otimizar estudos in vitro de explantes da orelha interna, por exemplo, para estabelecer modelos ototóxicos, investigar estágios de desenvolvimento, avaliar vias de sinalização e realizar estudos de triagem de drogas.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer ao Animal Facility do Departamento de Biomedicina da Universidade de Basileia por seu apoio no cuidado animal, às Microscopy Core Facilities, bem como ao Serviço de Tecnologia da Informação do Departamento de Biomedicina por sua assistência técnica, e à Swiss National Science Foundation (SNSF) pelo apoio financeiro (bolsa MD-PhD para M.C., Processo nº 323530_191222).
Materials
| 15 mL High-Clarity Polypropylene Conical Tube 17 x 120 mm style | FALCON | 352096 | |
| 45° Angled Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube 30 x 115 mm style | FALCON | 352070 | |
| Antifade Mounting Medium | VECTASHIELD | H-1000 | |
| Alexa Fluor 568 phalloidin | Thermofisher | 2151755 | |
| Anti-beta III Tubulin antibody [TUJ-1] | Abcam | ab14545 | |
| Antifade Mounting Medium With DAPI | VECTASHIELD | H-1200 | |
| Anti-myosin VII rabbit polyclonal | Abcam | ab3481 | |
| B-27 Supplement (50x), minus antioxidants | Thermofisher | 10889038 | |
| CARBON STEEL surgical blades 23 | Swann Moiton | 210 | |
| CellEvent™ Caspase-3/7 Green Detection Reagent | Thermofisher | C10723 | |
| DMEM/F-12/(1:1)(1x) + GlutaMAX | Thermofisher | 31331028 | |
| Double spatulas, one curved end | VWR | RSGA038.150 | |
| Ethyl alcohol 70% V/V 1,000 mL | bichsel | 160 0 106 00 | |
| Fetal Bovine Serum, certified | Thermofisher | 16000036 | |
| Fixative Solution 4% paraformaldehyde prepared in PBS | Thermofisher | 201255309/201255305 | |
| High Intensity Cold Halogen Light Source | Intralux® | 5100 | |
| Huygens Professional version 21.10 | Scientific Volume Imaging | ||
| ibidi µ-Slide 8 well | ibidi | 80826 | |
| microscope | LEICA | M80 | |
| microscope | LEICA | MS5 | |
| MitoSOX™ Red Mitochondrial Superoxide Indicator, for live-cell imaging | Thermofisher | M36008 | |
| N2 supplement (100x) | Thermofisher | 17502048 | |
| Nikon Eclipse Ti microscope with a Yokogawa CSU-W1 spinning disk confocal unit, and a Photometrics Prime 95B camera. | NIKON | ||
| Nikon Eclipse Ti microscope with an A1 point-scanning confocal unit | NIKON | ||
| Operating scissors | Fine Science Tools | 14005-16 | |
| Operating scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Operating tweezers | Fine Science Tools | 11008-15 | |
| PBS pH 7.2 (1x), 500mL | Thermofisher | 20012-019 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| POLY-D-LYSINE HYDROBROMIDE MOL WT GT 30 | Sigma-Aldrich | P7405 | |
| Scalpel Handle #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Steri 250 Second sterilizer | Simon Keller AG | 031100 | |
| Sterilizer, desiccant pellets | Simon Keller AG | 31120 | |
| Tissue Culture Dish 60 x 15 mm | FALCON | 353802 | |
| Tissue Culture Dish 60 x 15 mm | FALCON | 353004 | |
| Trito X-100 | Sigma | T9284 | |
| Unconventional myosin-VIIa | Developmental Studies Hybridoma Bank | 138-1s | |
| WFI for Cell Culture[-]Antimicrobial, 500 mL | Thermofisher | A12873-01 |
References
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