체외 모델로서의 전체 신생아 인공와우 이식
Summary
현재 프로토콜은 이전 프로토콜을 업데이트하고 고품질 인공와우 배양을 위한 비교적 간단한 접근 방식을 통합합니다. 이를 통해 살아있는 세포와 고정된 세포에서 신뢰할 수 있는 데이터 수집과 고해상도 이미징을 제공합니다. 이 프로토콜은 내이 세포를 연구하는 지속적인 추세를 지원합니다.
Abstract
치료되지 않은 난청은 전 세계 의료 시스템에 상당한 비용을 초래하고 개인의 삶의 질을 저하시킵니다. 감각신경성 난청은 달팽이관의 감각 유모세포와 청각 신경의 누적적이고 돌이킬 수 없는 손실을 특징으로 합니다. 전체 및 필수 인공와우 이식은 유모 세포 손실을 감지하고 내이 세포의 분자 메커니즘을 특성화하기 위한 청력 연구의 기본 도구 중 하나입니다. 수년 전에 신생아 달팽이관 격리를 위한 프로토콜이 개발되었으며 시간이 지남에 따라 수정되었지만 여전히 개선 가능성이 있습니다.
이 논문은 달팽이관의 전체 길이를 따라 유모 세포와 나선형 신경절 뉴런 세포를 연구할 수 있는 다중 웰 배양 챔버에서 전체 신생아 달팽이관 외식을 분리하고 배양하기 위한 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 생쥐와 쥐의 인공와우 이식을 사용하여 테스트되었습니다. 건강한 달팽이관 외식을 얻어 유모 세포, 나선형 신경절 뉴런 세포 및 주변 지원 세포 간의 상호 작용을 연구했습니다.
이 방법의 주요 장점 중 하나는 외식의 품질을 손상시키지 않으면서 장기 배양 단계를 단순화한다는 것입니다. Corti 기관의 세 회전은 모두 챔버 바닥에 부착되어 시험관 내 실험과 외식의 포괄적 인 분석을 용이하게합니다. 생체 및 고정 외식을 사용한 다양한 실험에서 얻은 인공와우 이미지의 몇 가지 예를 제공하여 외식물이 이독성 약물에 노출되었음에도 불구하고 구조를 유지한다는 것을 보여줍니다. 이 최적화된 프로토콜은 포유류 달팽이관의 통합 분석에 널리 사용될 수 있습니다.
Introduction
대부분의 감각신경성 난청은 감각유모세포, 청각신경세포, 청각 시냅스의 퇴화로 인해 발생한다1. 감각 세포의 이러한 퇴행성 과정은 진행성이며 일반적으로 비가역적이어서 청력 손실을 초래한다2. 따라서 감각 세포의 생존력과 스트레스 조건 하에서 신호 전달 경로의 변화에 대한 정보는 세포를 손상과 손실로부터 보호하는 데 중추적인 역할을 합니다. 배양에서 달팽이관 이식물을 조사하면 조직 복합체의 재현과 정상적인 세포-세포 네트워크의 유지가 가능하여 신호 전달 과정을 더 잘 설명할 수 있습니다. 이독성의 실험모델을 확립하기 위해 항생제 겐타마이신과 화학요법제 시스플라틴이 종종 사용되었는데, 이는 이독성 부작용이 있는 것으로 알려져 있기 때문이다3.
인공와우 이식의 체외 배양 시스템은 시간이 지남에 따라 개발되고 수정되었습니다. 그러나 전체 인공와우 배양을 위한 단계적 프로토콜에 대한 설명은 여러 간행물에서 종종 누락되어 있습니다. Corti의 쥐 기관의 1차 배양에 대한 최초의 비디오 프로토콜 중 하나는 Parker et al.에 의해 발표되었으며, 여기서 저자는 감각 상피의 분리, 유리 커버슬립에서의 배양 및 형질주입 실험을 위한 외식의 전기천공법 단계를 설명했습니다4. 유리 커버슬립을 사용하는 또 다른 프로토콜도 이전에 발표되었는데, 내이의 세포 구조 조직이5로 간주되었습니다. 코르티 기관 및 전정 기관의 마우스 외엽 배양을 위해 Millicell 막을 사용하는 대체 프로토콜이 보고되었습니다6. 이러한 비디오 보고서는 분석법의 개선에 기여했지만 여전히 해결해야 할 과제가 있습니다. 유리 커버슬립 및 인서트 사용으로 인해 발생하는 여러 문제를 해결하기 위해 본 프로토콜은 장기 배양 단계를 간소화하고 신뢰할 수 있는 데이터를 위해 고품질 장기를 배양하는 것을 목표로 합니다. 이는 실험 절차 중에 장기의 직접 취급을 최소화하고 살아있는 세포와 고정된 세포의 고해상도 이미지를 얻기 전에 장기 이식을 방지함으로써 달성됩니다.
본 프로토콜은 이전에 발표된 체외 배양 시스템을 업데이트하고 Corti 장기의 분리 및 배양 챔버로의 이동에 대한 몇 가지 최적화를 도입할 뿐만 아니라 배양 조건 및 추가 분석을 개선하기 위한 새로운 슬라이드 챔버의 통합을 도입합니다. 이 최적화된 프로토콜은 배지 변경 중 또는 추가 분석을 위해 커버슬립 또는 멤브레인에서 장기를 이송하는 동안 유리 커버슬립을 사용할 때 발생할 수 있는 장기 손상 위험을 줄입니다 4,5,6. 유리 커버슬립은 플라스틱 커버슬립보다 반사율이 더 좋습니다. 그러나 깨지기 쉽고 더 쉽게 부러질 수 있습니다. 여기에 사용된 멀티웰 챔버는 현미경 슬라이드에 부착되어 장기 배양 및 고해상도 이미징에 매우 적합합니다. 분리된 장기의 이송은 주걱으로 수행되며, 이를 통해 이전에 권장된대로 피펫으로 힘을 가하는 대신 장기를 올바른 방향으로 가져와 챔버로 밀어 넣을 수 있습니다 4,5,6.
충분한 매체를 포함해야 하는 폴리-D-라이신 코팅된 멀티웰 챔버는 앞서 언급한 바와 같이 접착 압력을 가하지 않고 장기 겹침을 피하면서 장기 이식 및 외식의 적절한 위치 지정을 용이하게 합니다6. 또한 우발적인 장기 겹침 및 고르지 않은 구조는 공초점 Z-스택을 사용하여 해결됩니다. 이 프로토콜은 마우스 및 쥐 이식, 코르티 및 달팽이관 장기의 이식, 혈청 함유 및 무혈청 배지 배양, 이독성 평가 및 일반 약물 반응 실험과 같은 다양한 응용 분야에 최적화되었습니다. 인공와우는 커버슬립 바닥이 있는 챔버에 장착되고 배양되며, 이는 인공와우를 챔버에 접착하여 체외 실험, 외피의 후처리, 살아있는 인 공와우 및 고정된 인공와우의 이미징 중에 최적의 취급을 가능하게 합니다. Corti 기관의 전체 길이의 시각화와 유모 세포의 정량화가 간소화됩니다. 또한 지지 세포, 나선형 신경절 뉴런 세포 및 신경돌기에 대한 평가가 정확합니다. 따라서 이 프로토콜은 포유류 달팽이관 세포의 포괄적인 분석에 사용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜을 업데이트한 목적은 외식의 분리에서 살아있는 달팽이관 세포와 고정된 달팽이관 세포의 이미징에 이르는 단계를 간소화하는 것이었습니다. 격리 기간 동안 몇 가지 단계를 개선하고 고품질 이식을 얻기 위해 효율적이고 원활하게 실행되는 프로토콜을 수립하기 위해 몇 가지 혁신적인 도구를 도입했습니다. 설명된 방법은 이전 보고서 4,5에서 최적화된 프로토콜입니다. 또한 일부 현재 연구에는 단계적으로 업데이트된 프로토콜이 부족합니다. 단순화된 외식물 배양 단계를 통해 이 프로토콜은 재현 가능한 데이터에 필수적인 잘 보존된 외식을 쉽게 처리할 수 있도록 합니다. 내이 외식을 위한 폴리머 커버슬립이 있는 다중 웰 챔버의 도입은 장기 부착과 온전한 외이의 보존을 향상시킵니다. 여기에서 우리는 배양 기관이 유모 세포의 손실과 신경돌기의 손상에도 불구하고 세포 조직을 유지한다는 것을 입증하기 위해 스트레스 조건 하에서 실험의 몇 가지 예를 제시합니다.
내이 장기를 배양할 때 어려운 점 중 하나는 장기가 분리되거나 떠다니는 것을 피하는 것인데, 이는 외이의 무결성, 치료에 대한 반응 및 후속 검사에 영향을 미치기 때문입니다. 이전에는 외식이 유리 커버슬립 4,5에서 배양되었습니다. 유리 표면의 배양이 좋은 대안인 것처럼 보이지만 유리 코팅은 시간이 많이 걸리고 커버슬립 자체는 깨지기 쉽고 섬세합니다. 밀리셀 세포 배양을 사용하는 대체 프로토콜은 이 문제를 해결하기 위한 시도를 삽입한다6. 그러나 외식과 함께 멤브레인을 절단하고 옮기는 것은 그 프로토콜에서 섬세한 단계인 것 같습니다. 또한 커버슬립을 장착하고 밀봉하는 동안 외식물이 손상될 수 있습니다. 우리가 제안한 접근 방식에서, 외식물이 폴리-D-라이신 코팅 챔버로 옮겨지고 올바른 위치에 놓이면 더 이상 옮기거나 커버슬립으로 덮을 필요가 없습니다. 이 프로토콜의 또 다른 장점은 장기 이식을 위한 최적의 배양 조건을 제공하는 얇은 가스 투과성 폴리머 커버슬립이 있는 챔버를 사용한다는 것입니다. 이 폴리머는 유리와 유사한 광학 품질을 가지고 있어 고해상도 현미경의 세포 이미징에 적합합니다.
배지에 혈청을 첨가하는 것은 1%-10% FBS 4,5,6,16을 사용한 내이 외피 배양을 포함하여 세포 및 조직 배양을 위한 대부분의 프로토콜에 사용됩니다. 혈청의 존재는 실험의 배양 조건에 영향을 미칩니다. 따라서 특정 상황에서는 혈청이 없는 배양이 선호됩니다. 인공와우 이식물의 배양에서 혈청의 부재는 DMEM에 N2를 첨가하거나 Neurobasal-A 배지에 N2를 첨가함으로써 대체하였다 5,6. 이와 관련하여, 혈청이 있는 경우와 없는 경우의 외식의 배양 조건을 테스트했습니다. 두 조건 모두에서 내이 세포는 매우 중요했으며 이독성 조건에 반응했습니다. 우리는 이러한 조건을 72시간 동안 테스트했지만, 다른 연구 5,16에서 제안된 바와 같이 특히 N2, B27 및 성장 인자와 함께 무혈청 배지로 배양할 때 외식은 배양에서 더 오래 유지될 수 있습니다.
장기 격리 기간 및 사용된 항생제와 같은 내이 외이식물 격리의 일반적인 중요한 단계 외에도 이 프로토콜에는 관리할 수 있는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 이 방법의 중요한 단계 중 하나는 장기가 삽입된 후 챔버에 남아 있는 매체의 양과 관련이 있습니다. 이것은 외식을 살리고 바닥 표면에 부착하도록 최적화되었습니다. 또 다른 중요한 단계는 외식물이 챔버 바닥에 부착될 수 있도록 하는 데 필요한 배양 시간과 관련이 있습니다. 몇 마이크로리터의 배지로 2시간보다 긴 배양 시간은 외식의 건강에 영향을 미칠 수 있습니다. 1 시간과 같은 더 짧은 배양 시간도 사용할 수 있으며, 외식재가 분리되지 않도록주의하십시오. 또 다른 중요한 측면은 폴리-D-라이신의 잔류물입니다. 폴리-D-라이신의 브롬화물 염 잔류물이 세포에 유독할 수 있기 때문에 폴리-D-라이신의 세척 단계를 엄격히 따라야 합니다. 세척 단계를 정확하게 수행한 후 폴리-D-라이신으로 코팅하면 외식제가 챔버에 원활하게 접착되어 챔버 바닥에 단단히 부착되기 전에 위치를 수정할 수 있습니다.
이 방법의 한계 중 하나는 정립 현미경을 사용하여 세포를 이미징하는 것입니다. 이것은 도립 현미경을 사용하는 실험실에서 중요한 문제가 될 수 있습니다. 탈착식 실리콘 챔버가 있는 유리 슬라이드는 정립 및 도립 현미경 검사에 사용할 수 있습니다. 그러나 폴리-D-라이신을 사용한 코팅 조건을 먼저 테스트해야 합니다. 또 다른 한계는 인서트를 제거할 수 없기 때문에 챔버를 보관하는 것이며, 표준 현미경 슬라이드의 1mm 높이에 비해 뚜껑이 있는 챔버 하나의 총 높이는 거의 11mm입니다. 그러나 8-웰 챔버는16 이전에 제안된 4-웰 플레이트보다 더 적은 공간을 사용합니다.
두 개의 현미경으로 획득한 이미지를 여기에 제시합니다. 포인트 스캐닝 컨포칼 현미경은 얇은 광학 섹션으로 인해 조직의 고해상도 이미지를 제공하는 반면, 스피닝 디스크 컨포칼 현미경은 우수한 해상도로 더 빠른 이미징 시간을 제공합니다. 내부 유모 세포(IHC)와 외부 유모 세포(OHC)의 입체섬모는 컨포칼 현미경을 사용하여 시각화됩니다. IHC의 입체섬모는 OHC의 입체섬모보다 크기 때문에 이 작업에서 반복적으로 잘 시각화되었습니다. OHC 입체섬모의 경우 초고해상도 현미경(SRM)과 같은 다른 대체 현미경이 시각화를 개선할 수 있습니다. 회전 디스크 현미경으로 획득한 이식 이미지는 딥 러닝 접근법12을 사용하여 자동화된 유모 세포 계수를 쉽게 통합하기에 충분합니다. 또한, 짧은 획득 시간은 살아있는 세포와 조직을 사용한 실험에 중요합니다. 또한, 이 프로토콜은 신생아 인공와우 이식에만 국한되지 않습니다. 일부 최적화를 통해 전정 기관 또는 배아 조직과 같은 다른 이식물도 배양할 수 있습니다.
유모 세포 및 뉴런과 같은 달팽이관 세포의 체 외 정량화는 세포 생존율을 평가하여 손상되거나 손실된 세포의 비율을 평가하는 데 중요합니다. 신호 전달 경로와 세포 기능에 대한 연구는 죽음과 생존의 메커니즘을 밝히는 데 도움이 됩니다. 배아 및 신생아 달팽이관 조직 검사는 달팽이관의 발달 단계를 조사하는 데 유용합니다. 따라서 이 프로토콜은 예를 들어 이독성 모델을 구축하고, 발달 단계를 조사하고, 신호 전달 경로를 평가하고, 약물 스크리닝 연구를 수행하기 위해 내이 이식물의 시험관 내 연구를 최적화하는 데 도움이 될 것입니다.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
동물 관리를 지원해 주신 바젤 대학교 생물의학과 동물 시설, 기술 지원을 해주신 현미경 핵심 시설 및 생물의학과의 정보 기술 서비스, 재정 지원(MD-PhD 장학금, M.C., 부여 번호 323530_191222).
Materials
| 15 mL High-Clarity Polypropylene Conical Tube 17 x 120 mm style | FALCON | 352096 | |
| 45° Angled Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube 30 x 115 mm style | FALCON | 352070 | |
| Antifade Mounting Medium | VECTASHIELD | H-1000 | |
| Alexa Fluor 568 phalloidin | Thermofisher | 2151755 | |
| Anti-beta III Tubulin antibody [TUJ-1] | Abcam | ab14545 | |
| Antifade Mounting Medium With DAPI | VECTASHIELD | H-1200 | |
| Anti-myosin VII rabbit polyclonal | Abcam | ab3481 | |
| B-27 Supplement (50x), minus antioxidants | Thermofisher | 10889038 | |
| CARBON STEEL surgical blades 23 | Swann Moiton | 210 | |
| CellEvent™ Caspase-3/7 Green Detection Reagent | Thermofisher | C10723 | |
| DMEM/F-12/(1:1)(1x) + GlutaMAX | Thermofisher | 31331028 | |
| Double spatulas, one curved end | VWR | RSGA038.150 | |
| Ethyl alcohol 70% V/V 1,000 mL | bichsel | 160 0 106 00 | |
| Fetal Bovine Serum, certified | Thermofisher | 16000036 | |
| Fixative Solution 4% paraformaldehyde prepared in PBS | Thermofisher | 201255309/201255305 | |
| High Intensity Cold Halogen Light Source | Intralux® | 5100 | |
| Huygens Professional version 21.10 | Scientific Volume Imaging | ||
| ibidi µ-Slide 8 well | ibidi | 80826 | |
| microscope | LEICA | M80 | |
| microscope | LEICA | MS5 | |
| MitoSOX™ Red Mitochondrial Superoxide Indicator, for live-cell imaging | Thermofisher | M36008 | |
| N2 supplement (100x) | Thermofisher | 17502048 | |
| Nikon Eclipse Ti microscope with a Yokogawa CSU-W1 spinning disk confocal unit, and a Photometrics Prime 95B camera. | NIKON | ||
| Nikon Eclipse Ti microscope with an A1 point-scanning confocal unit | NIKON | ||
| Operating scissors | Fine Science Tools | 14005-16 | |
| Operating scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Operating tweezers | Fine Science Tools | 11008-15 | |
| PBS pH 7.2 (1x), 500mL | Thermofisher | 20012-019 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| POLY-D-LYSINE HYDROBROMIDE MOL WT GT 30 | Sigma-Aldrich | P7405 | |
| Scalpel Handle #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Steri 250 Second sterilizer | Simon Keller AG | 031100 | |
| Sterilizer, desiccant pellets | Simon Keller AG | 31120 | |
| Tissue Culture Dish 60 x 15 mm | FALCON | 353802 | |
| Tissue Culture Dish 60 x 15 mm | FALCON | 353004 | |
| Trito X-100 | Sigma | T9284 | |
| Unconventional myosin-VIIa | Developmental Studies Hybridoma Bank | 138-1s | |
| WFI for Cell Culture[-]Antimicrobial, 500 mL | Thermofisher | A12873-01 |
References
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