نباتات القوقعة الكاملة لحديثي الولادة كنموذج في المختبر
Summary
يقوم البروتوكول الحالي بتحديث البروتوكولات السابقة ويتضمن مناهج مباشرة نسبيا لزراعة نباتات القوقعة عالية الجودة. يوفر هذا الحصول على بيانات موثوقة وتصويرا عالي الدقة في الخلايا الحية والثابتة. يدعم هذا البروتوكول الاتجاه المستمر لدراسة خلايا الأذن الداخلية.
Abstract
يفرض فقدان السمع غير المعالج تكاليف كبيرة على نظام الرعاية الصحية العالمي ويضعف نوعية حياة الأفراد. يتميز فقدان السمع الحسي العصبي بفقدان تراكمي لا رجعة فيه لخلايا الشعر الحسية والأعصاب السمعية في قوقعة الأذن. تعد نباتات القوقعة الكاملة والحيوية إحدى الأدوات الأساسية في أبحاث السمع للكشف عن فقدان خلايا الشعر وتوصيف الآليات الجزيئية لخلايا الأذن الداخلية. منذ سنوات عديدة، تم تطوير بروتوكول لعزل قوقعة الأذن لحديثي الولادة، وعلى الرغم من أنه تم تعديله بمرور الوقت، إلا أنه لا يزال يحمل إمكانية التحسن.
يقدم هذا البحث بروتوكولا محسنا لعزل وزراعة نباتات القوقعة الصناعية الكاملة لحديثي الولادة في غرف زراعة متعددة الآبار تمكن من دراسة خلايا الشعر والخلايا العصبية العقدية الحلزونية على طول القوقعة بالكامل. تم اختبار البروتوكول باستخدام نباتات القوقعة من الفئران والجرذان. تم الحصول على نباتات قوقعة صحية لدراسة التفاعل بين خلايا الشعر والخلايا العصبية العقدية الحلزونية والخلايا الداعمة المحيطة.
واحدة من المزايا الرئيسية لهذه الطريقة هي أنها تبسط خطوات زراعة الأعضاء دون المساس بجودة النباتات. يتم إرفاق جميع المنعطفات الثلاثة لعضو كورتي بأسفل الغرفة ، مما يسهل التجارب في المختبر والتحليل الشامل للنباتات. نقدم بعض الأمثلة على صور القوقعة من تجارب مختلفة مع النباتات الحية والثابتة، مما يدل على أن النباتات تحتفظ ببنيتها على الرغم من التعرض للعقاقير السامة للأذن. يمكن استخدام هذا البروتوكول الأمثل على نطاق واسع للتحليل التكاملي لقوقعة الثدييات.
Introduction
ترجع معظم حالات فقدان السمع الحسي العصبي إلى تنكس خلايا الشعر الحسية والخلايا العصبية السمعية و / أو نقاط الاشتباك العصبي السمعي1. هذه العملية التنكسية في الخلايا الحسية تقدمية وعادة لا رجعة فيها ، مما يؤدي إلى فقدان السمع2. لذلك ، فإن المعلومات حول صلاحية الخلايا الحسية والتغيرات في مسارات الإشارات في ظل ظروف الإجهاد أمر محوري لحماية الخلايا من التلف ، وبالتالي الخسارة. يسمح التحقيق في زراعة قوقعة الأذن في المستنبتة بإعادة تلخيص مجمع الأنسجة والحفاظ على شبكة خلايا خلوية طبيعية ، مما يتيح وصفا أفضل لعمليات الإشارة. لإنشاء نماذج تجريبية للسمية الأذنية ، غالبا ما يتم استخدام الجنتاميسين المضاد الحيوي وعامل العلاج الكيميائي سيسبلاتين ، لأنه من المعروف أن لهما آثارا جانبية سامة للأذن3.
تم تطوير وتعديل أنظمة الاستزراع في المختبر لنباتات القوقعة بمرور الوقت. ومع ذلك، غالبا ما يكون وصف البروتوكول التدريجي لاستزراع نباتات القوقعة بأكملها مفقودا في العديد من المنشورات. تم نشر أحد بروتوكولات الفيديو الأولى للثقافة الأولية لعضو الفئران في كورتي بواسطة Parker et al. ، حيث وصف المؤلفون خطوات عزل الظهارة الحسية ، والزراعة على أغطية زجاجية ، والتثقيب الكهربائي للنباتات لتجارب النقل4. كما تم نشر بروتوكول آخر باستخدام قسائم الغطاء الزجاجي سابقا ، حيث تم اعتبار تنظيم البنية الخلوية في الأذن الداخلية5. تم الإبلاغ عن بروتوكول بديل باستخدام غشاء Millicell لثقافة نباتات الفئران في عضو Corti والعضو الدهليزي6. ساهمت تقارير الفيديو هذه في تحسين الطريقة ، ولكن لا تزال هناك تحديات تحتاج إلى حل. لمعالجة عدد من القضايا الناشئة عن استخدام أغطية زجاجية وإدخالات ، يهدف هذا البروتوكول إلى تبسيط خطوات زراعة الأعضاء وزراعة الأعضاء عالية الجودة للحصول على بيانات موثوقة. يتم تحقيق ذلك عن طريق تقليل التعامل المباشر مع العضو أثناء الإجراءات التجريبية وتجنب نقل الأعضاء قبل الحصول على صور عالية الدقة للخلايا الحية والثابتة.
يقوم البروتوكول الحالي بتحديث أنظمة الاستزراع المختبري المنشورة سابقا ويقدم العديد من التحسينات في عزل جهاز Corti ونقله إلى غرف الثقافة ، بالإضافة إلى دمج غرفة منزلقة جديدة لتحسين ظروف الثقافة والمزيد من التحليل. يقلل هذا البروتوكول الأمثل من خطر إتلاف العضو ، والذي يمكن أن يحدث عند استخدام أغطية زجاجية أثناء التغيير المتوسط أو أثناء نقل العضو من أغطية أو أغشية لمزيد من التحليل4،5،6. تحتوي أغطية الغطاء الزجاجي على مؤشر عاكس أفضل من تلك البلاستيكية ؛ ومع ذلك ، فهي هشة ويمكن أن تنكسر بسهولة أكبر. الغرف متعددة الآبار المستخدمة هنا متصلة بشريحة مجهرية ، وهي مناسبة تماما لزراعة الأعضاء والتصوير عالي الدقة. يتم نقل الأعضاء المعزولة باستخدام ملعقة ، مما يسمح بإحضار العضو في الاتجاه الصحيح والانزلاق إلى الغرفة ، بدلا من استخدام القوة باستخدام ماصة كما هو موصى به سابقا4،5،6.
تسهل الغرف متعددة الآبار المطلية ب poly-D-lysine ، والتي يجب أن تحتوي على وسيط كاف ، نقل الأعضاء وتحديد المواقع المناسبة للنباتات الخارجية دون ممارسة ضغط لاصق مع تجنب تداخل الأعضاء ، كما ذكرنا سابقا6. بالإضافة إلى ذلك ، يتم حل الهياكل المتداخلة وغير المستوية للأعضاء العرضية باستخدام مكدس Z متحد البؤر. تم تحسين هذا البروتوكول لتطبيقات مختلفة ، مثل نباتات الفئران والفئران ، وزراعة أعضاء كورتي والقوقعة ، والزراعة في وسط يحتوي على المصل وخالي من المصل ، والتقييمات السامة للأذن ، وتجارب الاستجابة العامة للأدوية. يتم تركيب نباتات القوقعة الصناعية وحضنها في غرف ذات قاع غطاء، مما يسهل التصاق نباتات القوقعة بالغرف من أجل المعالجة المثلى أثناء التجارب في المختبر ، والمعالجة اللاحقة للنباتات، وتصوير نباتات القوقعة الحية والثابتة. يتم تبسيط تصور كامل طول عضو كورتي وقياس خلايا الشعر. بالإضافة إلى ذلك ، فإن تقييمات الخلايا الداعمة والخلايا العصبية العقدية الحلزونية والخلايا العصبية دقيقة. لذلك ، يمكن استخدام هذا البروتوكول لإجراء تحليل شامل لخلايا قوقعة الثدييات.
Protocol
Representative Results
Discussion
كان الغرض من تحديث هذا البروتوكول هو تبسيط الخطوات من عزل النباتات إلى تصوير خلايا القوقعة الحية والثابتة. قمنا بتحسين بعض الخطوات أثناء العزل وقدمنا بعض الأدوات المبتكرة بهدف إنشاء بروتوكول فعال وسلس التشغيل للحصول على نباتات عالية الجودة. الطريقة الموصوفة هي بروتوكول محسن من التقارير السابقة 4,5. بالإضافة إلى ذلك ، تفتقر بعض الدراسات الحالية إلى بروتوكول محدث تدريجيا. من خلال خطوات زراعة الزرع المبسطة ، يوفر هذا البروتوكول سهولة التعامل مع النباتات المحفوظة جيدا ، وهو أمر ضروري للبيانات القابلة للتكرار. إن إدخال غرف متعددة الآبار مع غطاء بوليمر لنباتات الأذن الداخلية يحسن ارتباط العضو والحفاظ على النباتات السليمة. هنا ، نقدم العديد من الأمثلة على التجارب في ظل ظروف الإجهاد لإثبات أن الأعضاء في الثقافة تحافظ على تنظيمها الخلوي على الرغم من فقدان خلايا الشعر وتلف الخلايا العصبية.
أحد التحديات في زراعة أعضاء الأذن الداخلية هو تجنب انفصال الأعضاء وتعويمها ، لأن هذا يؤثر على سلامة النباتات الخارجية ، والاستجابة للعلاج ، والفحوصات اللاحقة. في السابق ، كانت النباتات المزروعة على أغطية زجاجية 4,5. على الرغم من أن الثقافة على الأسطح الزجاجية تبدو بديلا جيدا ، إلا أن طلاء الزجاج يستغرق وقتا طويلا ، كما أن أغطية الغطاء نفسها هشة وحساسة. بروتوكول بديل باستخدام ثقافة خلية ميليسيل يدرج محاولات لحل هذه المشكلة6. ومع ذلك ، يبدو أن قطع الغشاء ونقله مع النباتات الخارجية خطوة حساسة في هذا البروتوكول. بالإضافة إلى ذلك ، قد تتلف النباتات الخارجية أثناء تركيب وختم غطاء الغطاء. في نهجنا المقترح ، بمجرد نقل النباتات إلى الغرف المطلية ب poly-D-lysine ووضعها في الموضع الصحيح ، لا يلزم إجراء مزيد من النقل أو التغطية بأغطية الغطاء. ميزة أخرى لهذا البروتوكول هي استخدام الغرف ذات غطاء بوليمر رقيق منفذ للغاز يوفر ظروف استزراع مثالية لنباتات الأعضاء. يتميز هذا البوليمر بجودة بصرية مماثلة للزجاج ، مما يجعله مناسبا للتصوير الخلوي في الفحص المجهري عالي الدقة.
تستخدم إضافة المصل إلى الوسط في معظم بروتوكولات زراعة الخلايا والأنسجة ، بما في ذلك زراعة نباتات الأذن الداخلية بنسبة 1٪ -10٪ FBS4،5،6،16. يؤثر وجود المصل على ظروف ثقافة التجارب ؛ وبالتالي ، في حالات معينة ، يفضل الثقافة بدون مصل. تم استبدال غياب المصل في مزرعة نباتات القوقعة إما بإضافة N2 إلى DMEM أو بإضافة N2 إلى الوسط العصبي القاعديA 5,6. في هذا الصدد ، اختبرنا ظروف زراعة النباتات مع وبدون مصل. في كلتا الحالتين ، كانت خلايا الأذن الداخلية حيوية واستجابت للظروف السامة للأذن. اختبرنا هذه الظروف لمدة 72 ساعة ، ولكن يمكن الحفاظ على النباتات في الثقافة لفترة أطول ، خاصة عند حضنها بوسط خال من المصل مع N2 و B27 وعوامل النمو ، كما هو مقترح في دراسات أخرى 5,16.
بالإضافة إلى الخطوات الحرجة العامة في عزل نباتات الأذن الداخلية ، مثل مدة عزل الأعضاء والمضاد الحيوي المستخدم ، هناك أيضا بعض الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول ، والتي يمكن التحكم فيها. ترتبط إحدى الخطوات الحاسمة في هذه الطريقة بحجم الوسط الذي يبقى في الغرفة بعد إدخال العضو. تم تحسين هذا للحفاظ على النباتات على قيد الحياة وتعلق على السطح السفلي. هناك خطوة مهمة أخرى تتعلق بوقت الحضانة اللازم للسماح للنباتات بالالتصاق بقاع الغرفة. أوقات الحضانة أطول من 2 ساعة مع بضعة ميكرولتر من الوسط يمكن أن تؤثر على صحة النباتات. يمكن أيضا استخدام أوقات حضانة أقصر ، مثل 1 ساعة ، طالما تم الحرص على عدم فصل النباتات. جانب آخر مهم هو بقايا بولي دي ليسين. يجب اتباع خطوات الغسيل من poly-D-lysine بدقة ، لأن بقايا ملح البروميد من poly-D-lysine يمكن أن تكون سامة للخلايا. بعد اتباع خطوات الغسيل بدقة ، يسهل الطلاء باستخدام poly-D-lysine الالتصاق السلس للنباتات الخارجية بالغرف بحيث يمكن تصحيح الموضع قبل أن تصبح متصلة بقوة بقاع الغرفة.
أحد قيود هذه الطريقة هو تصوير الخلايا باستخدام الفحص المجهري المستقيم. قد تكون هذه مشكلة مهمة لتلك المختبرات ذات المجاهر المقلوبة. يمكن استخدام الشرائح الزجاجية مع غرف السيليكون القابلة للإزالة للفحص المجهري المستقيم والمقلوب ؛ ومع ذلك ، يجب اختبار ظروف الطلاء الخاصة بنا مع poly-D-lysine أولا. هناك قيد آخر يتمثل في تخزين الغرف ، لأن الإدخالات غير قابلة للإزالة ، ويبلغ الارتفاع الإجمالي لغرفة واحدة مع الغطاء حوالي 11 مم مقارنة بارتفاع 1 مم لشريحة المجهر القياسية. ومع ذلك ، فإن الغرفة المكونة من 8 آبار تستخدم مساحة أقل من الألواح المكونة من 4 آبار المقترحة قبل16.
نقدم هنا الصور التي تم الحصول عليها باستخدام اثنين من المجاهر. بينما يوفر المجهر متحد البؤر لمسح النقاط صورا عالية الدقة للأنسجة بسبب قسمه البصري الرقيق ، يوفر المجهر البؤري للقرص الدوار وقت تصوير أسرع بدقة جيدة. يتم تصور الأهداب المجسمة لخلايا الشعر الداخلية (IHCs) وخلايا الشعر الخارجية (OHCs) باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر. نظرا لأن الأهداب المجسمة للمدن الإنسانية العالمية أكبر من تلك الموجودة في OHCs ، فقد تم تصورها بشكل متكرر وجيد في هذا العمل. بالنسبة للأهداب المجسمة OHC ، يمكن للمجاهر البديلة الأخرى تحسين التصور ، مثل الفحص المجهري فائق الدقة (SRM). الصور الزرعية التي تم الحصول عليها باستخدام مجهر القرص الدوار كافية لسهولة دمج عد خلايا الشعر الآلي باستخدام نهج التعلم العميق12. علاوة على ذلك ، فإن وقت الاستحواذ القصير مهم للتجارب على الخلايا والأنسجة الحية. بالإضافة إلى ذلك، لا يقتصر هذا البروتوكول على نباتات القوقعة الصناعية لحديثي الولادة. مع بعض التحسينات ، يمكن أيضا زراعة النباتات الأخرى مثل الأعضاء الدهليزية أو الأنسجة الجنينية.
يعد القياس الكمي لخلايا القوقعة ، مثل خلايا الشعر والخلايا العصبية ، في المختبر مهما لتقييم صلاحية الخلية ، وبالتالي النسبة المئوية للخلايا التالفة أو المفقودة. تساعد التحقيقات في مسارات الإشارات ووظائف الخلية على الكشف عن آليات الموت والبقاء على قيد الحياة. تعد فحوصات أنسجة القوقعة الجنينية وحديثي الولادة مفيدة للتحقيق في مراحل نمو قوقعة الأذن. لذلك ، سيساعد هذا البروتوكول على تحسين الدراسات في المختبر لنباتات الأذن الداخلية ، على سبيل المثال ، لإنشاء نماذج سامة للأذن ، والتحقيق في مراحل النمو ، وتقييم مسارات الإشارات ، وإجراء دراسات فحص الأدوية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نعرب عن تقديرنا لمرفق الحيوانات التابع لقسم الطب الحيوي بجامعة بازل لدعمهم في رعاية الحيوان ، والمرافق الأساسية للفحص المجهري وكذلك خدمة تكنولوجيا المعلومات التابعة لقسم الطب الحيوي لمساعدتهم الفنية ، والمؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم (SNSF) للدعم المالي (منحة MD-PhD إلى MC ، رقم المنحة 323530_191222).
Materials
| 15 mL High-Clarity Polypropylene Conical Tube 17 x 120 mm style | FALCON | 352096 | |
| 45° Angled Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube 30 x 115 mm style | FALCON | 352070 | |
| Antifade Mounting Medium | VECTASHIELD | H-1000 | |
| Alexa Fluor 568 phalloidin | Thermofisher | 2151755 | |
| Anti-beta III Tubulin antibody [TUJ-1] | Abcam | ab14545 | |
| Antifade Mounting Medium With DAPI | VECTASHIELD | H-1200 | |
| Anti-myosin VII rabbit polyclonal | Abcam | ab3481 | |
| B-27 Supplement (50x), minus antioxidants | Thermofisher | 10889038 | |
| CARBON STEEL surgical blades 23 | Swann Moiton | 210 | |
| CellEvent™ Caspase-3/7 Green Detection Reagent | Thermofisher | C10723 | |
| DMEM/F-12/(1:1)(1x) + GlutaMAX | Thermofisher | 31331028 | |
| Double spatulas, one curved end | VWR | RSGA038.150 | |
| Ethyl alcohol 70% V/V 1,000 mL | bichsel | 160 0 106 00 | |
| Fetal Bovine Serum, certified | Thermofisher | 16000036 | |
| Fixative Solution 4% paraformaldehyde prepared in PBS | Thermofisher | 201255309/201255305 | |
| High Intensity Cold Halogen Light Source | Intralux® | 5100 | |
| Huygens Professional version 21.10 | Scientific Volume Imaging | ||
| ibidi µ-Slide 8 well | ibidi | 80826 | |
| microscope | LEICA | M80 | |
| microscope | LEICA | MS5 | |
| MitoSOX™ Red Mitochondrial Superoxide Indicator, for live-cell imaging | Thermofisher | M36008 | |
| N2 supplement (100x) | Thermofisher | 17502048 | |
| Nikon Eclipse Ti microscope with a Yokogawa CSU-W1 spinning disk confocal unit, and a Photometrics Prime 95B camera. | NIKON | ||
| Nikon Eclipse Ti microscope with an A1 point-scanning confocal unit | NIKON | ||
| Operating scissors | Fine Science Tools | 14005-16 | |
| Operating scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Operating tweezers | Fine Science Tools | 11008-15 | |
| PBS pH 7.2 (1x), 500mL | Thermofisher | 20012-019 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| POLY-D-LYSINE HYDROBROMIDE MOL WT GT 30 | Sigma-Aldrich | P7405 | |
| Scalpel Handle #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Steri 250 Second sterilizer | Simon Keller AG | 031100 | |
| Sterilizer, desiccant pellets | Simon Keller AG | 31120 | |
| Tissue Culture Dish 60 x 15 mm | FALCON | 353802 | |
| Tissue Culture Dish 60 x 15 mm | FALCON | 353004 | |
| Trito X-100 | Sigma | T9284 | |
| Unconventional myosin-VIIa | Developmental Studies Hybridoma Bank | 138-1s | |
| WFI for Cell Culture[-]Antimicrobial, 500 mL | Thermofisher | A12873-01 |
References
- Mukherjea, D., et al. The design and screening of drugs to prevent acquired sensorineural hearing loss. Expert Opinion on Drug Discovery. 6 (5), 491-505 (2011).
- Takeda, H., Dondzillo, A., Randall, J. A., Gubbels, S. P. Challenges in cell-based therapies for the treatment of hearing loss. Trends in Neurosciences. 41 (11), 823-837 (2018).
- Schacht, J., Talaska, A. E., Rybak, L. P. Cisplatin and aminoglycoside antibiotics: Hearing loss and its prevention. The Anatomical Record. 295 (11), 1837-1850 (2012).
- Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. Journal of Visualized Experiments. (36), e1685 (2010).
- Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research. Journal of Visualized Experiments. (124), e55704 (2017).
- Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).
- Durbin, J. E., Hackenmiller, R., Simon, M. C., Levy, D. E. Targeted disruption of the mouse Stat1 gene results in compromised innate immunity to viral disease. Cell. 84 (3), 443-450 (1996).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Etournay, R., et al. Cochlear outer hair cells undergo an apical circumference remodeling constrained by the hair bundle shape. Development. 137 (8), 1373-1383 (2010).
- MacDonald, G. H., Rubel, E. W. Three-dimensional imaging of the intact mouse cochlea by fluorescent laser scanning confocal microscopy. Hearing Research. 243 (1-2), 1-10 (2008).
- Sibarita, J. B. Deconvolution microscopy. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 95, 201-243 (2005).
- Cortada, M., Sauteur, L., Lanz, M., Levano, S., Bodmer, D. A deep learning approach to quantify auditory hair cells. Hearing Research. 409, 108317 (2021).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
- Ershov, D., et al. TrackMate 7: Integrating state-of-the-art segmentation algorithms into tracking pipelines. Nature Methods. 19 (7), 829-832 (2022).
- Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M., Pachitariu, M. Cellpose: A generalist algorithm for cellular segmentation. Nature Methods. 18 (1), 100-106 (2021).
- Zhang, L. W., Cang, X. H., Chen, Y., Guan, M. X. In vitro culture of mammalian inner ear hair cells. Journal of Zhejiang University of Science B. 20 (2), 170-179 (2019).
