マイコバクテリアの天然および組換え細胞外小胞の濃縮

感染症に対する幅広いワクチンが開発・投与されているにもかかわらず、今日でも全死亡の~30%が伝染病によるものです^1。結核(TB)ワクチンであるカルメット・ゲラン菌(BCG)が登場する前は、結核が死因の第1位でした(人口10万人あたり10,000~15,000人)^2。BCGの投与と第一選択薬と第二選択薬の入手の容易さにより、2022年までに結核関連の死亡は劇的に減少し、2022年までに年間~100万人^{(すなわち、}人口10万人あたり~15-20人)になりました1。しかし、世界の結核流行集団では、結核関連の死亡者数は人口10万人あたり100~550人にとどまっています¹。専門家は、これらの数値の歪みにつながるいくつかの理由を認識していますが、BCGを介した保護が生後10年間も持続しないことが、^3,4,5,6,7の^{顕著な理由の}ようです。その結果、国連の「持続可能な開発目標」とWHOの「結核撲滅戦略」が新たに採択されたことから、BCGに代わる、結核を生涯にわたって防ぐことができる、はるかに優れたワクチンを開発するための世界的な取り組みが世界的に協力して行われています。

その目的に向けて、いくつかのグループが現在、修飾/組換えBCG株、BCG以外の非病原性および弱毒化マイコバクテリア種、およびサブユニット候補8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18を評価しています.典型的には、サブユニットワクチンは、病原体の精製された(~1-6)完全長または切断された免疫原性タンパク質を数個選択的にロードしたリポソームである。しかし、非天然のコンフォメーションへの偽の折り畳みや、ロードされたタンパク質間のランダムな非機能的相互作用のために、サブユニットはしばしば天然およびゲルマンエピトープを欠いており、したがって、免疫系を十分に呼び起こすことができません14,19,20。

その結果、細菌の細胞外小胞(EV)は、有望な代替手段としてペースを上げています21,22,23,24,25,26。典型的には、細菌のEV(bEV)には、核酸、脂質の一部、数百の代謝物やタンパク質など、細胞成分のサブセットが含まれています^27,28。少数の精製タンパク質が人工的にロードされるリポソームとは異なり、bEVには、特にアジュバントやToll様受容体(TLR)アゴニストのブースト/補助なしに、免疫系をプライミングする傾向が優れた、自然にロードされたネイティブフォールドタンパク質が何百個も含まれています27,28,29。この研究ラインにおいて、私たちや他の研究者は、BCG³⁰のサブユニットブースターとしてのマイコバクテリアEVの有用性を探ってきました。bEVは均一な抗原負荷を欠いているという懸念にもかかわらず、弱毒化髄膜炎菌由来のEVは、血清型B髄膜炎菌からヒトを保護することに成功しています^31,32。

少なくとも理論的には、BCGをうまく高めることができる最高のEVは、病原菌を豊富に含むEVです。しかし、病原性マイコバクテリウムによって生成されたEVを濃縮するには、費用と時間がかかり、リスクが伴います。さらに、病原体が生成するEVは、防御よりも毒性が強い可能性があります。潜在的なリスクを考慮して、ここでは、アキセンで増殖したマイコバクテリウムであるMsmによって生成されたEVを濃縮するための十分にテストされたプロトコルを報告します。

しかし、いくつかの病原体タンパク質オルソログをコードしているにもかかわらず、ウイルス性マイコバクテリアは、免疫系を防御に向けて十分にプライミングするために必要ないくつかのワクチン抗原/病原性タンパク質エピトープを欠いています³³。そこで、分子工学を通じて、Msmで発現・翻訳された病原性タンパク質のかなりの部分がEVに到達するように、Msmの組換えEVを構築し、濃縮することも検討しました。我々は、Msm EVの上位10個の豊富なタンパク質のうちの1つ以上が、目的のタンパク質に融合すると、そのような転座を助けるという仮説を立てました。

2011年、Prados-Rosalesらは、マイコバクテリアEV(mEV)の濃縮を研究室で標準化し始めていましたが、in vitro³⁰で初めてmEVの可視化と濃縮を報告しました。その後、2014年に同じグループが2011年のメソッド³⁴の修正版を発表しました。2015年、Leeらは、マイコバクテリアの軸培養物からmEVを濃縮するための独立して標準化された方法も報告しました³⁵。両方のプロトコル^34,35を組み合わせ、徹底的な標準化の後にいくつかの変更を組み込んで、マイコバクテリア³⁶の軸培養物からのmEVを日常的に濃縮するのに役立つプロトコルをここで説明します。

ここでは、マイコバクテリアEV全般の濃縮のために公開されているプロトコル³⁶の拡張である、Msm特異的EVの濃縮について特に詳しく説明します。また、mCherryタンパク質(赤色蛍光レポーターとして)と、結核菌の主要な免疫原であり、サブユニットワクチンの候補であるEsxA(Esat-6)^37,38,39を含む組換えmEV(R-mEV)の構築方法についても詳しく説明します。R-mEVを濃縮するためのプロトコルは、MsmのネイティブEVを濃縮するために説明したものと同じです。