ポータブル卓上焦点式超音波システムを使用したマウスモデルにおける多形性神経膠芽腫の治療のためのソノダイナミック療法

すべての動物実験は、ジョンズ・ホプキンス大学動物実験委員会(IACUC)に従って承認され、実施されました。無胸症の裸の雌マウス(生後10週齢)は、市販の情報源から入手した( 資料表参照)。マスク、手袋、ガウンの使用を含む、すべてのバイオセーフティレベル2(BSL-2)規制が遵守されました。 1. 腫瘍移植と生物発光イメージング 研究の初期段階では、以前に発表されたレポートに従って、頭蓋内腫瘍移植を実施します6。注:この研究では、4 μLの細胞懸濁液中の100,000個のM59ヒトGBM異種移植細胞を使用して、頭蓋骨への深さ3.0 mmで移植しました。 治療前に、以前に発表されたレポート7に従って、in vivo発光イメージングシステム(資料表を参照)を使用して、各マウスの腫瘍サイズを非侵襲的に定量化します。注:これは、最初の腫瘍移植の7日後、治療日に行われました。 画像定量を使用して、マウスを同等のサブグループに分けて治療します。注:この研究では、(1)未治療の担がんマウス(n = 4)と(2)SDTを受けている担がんマウス(n = 4)の2つのサブグループが含まれていました。治療前の腫瘍の大きさに統計学的に有意な差は2群間で認められなかった(p > 0.05)。 2. 施術日の設定 5-ALA塩酸塩( 材料表を参照)を冷凍庫から取り出し、200 mg/kgのマウス重量の5-ALAを秤量します(例:25 gのマウスの場合、5 mgの秤量)。周囲光の下でのみ行ってください。注意: 使用前にすべての機器を滅菌してください。 5-ALAの総量をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に溶解し、各動物に60 mg/mLの5-ALA溶液を正しい重量の投与量で投与します(例えば、25 gのマウスの場合、5 mgの5-ALAを83.33 μLのPBSに溶解します)。 SDT試験群の各動物について、適切な量の5-ALA溶液を動物腹腔内に注射します(ステップ2.1および2.2で計算)。 動物をケージに3時間放置して、5-ALAを代謝します。 3. 実験に必要なものの準備 リザーバーに脱イオン(DI)水を入れます。注:必要な水の量は、研究で使用したマウスの数に基づいています。 フロー イン チューブと フローアウト チューブを超音波脱気器に取り付け( 材料表を参照)、脱気器を電源に接続します(1 = ON、0 = OFF)。 フロー イン チューブと フローアウト チューブのもう一方の端をDI貯水槽に配置します。 デガッサーをオンにし、45分間実行します。 新しく脱気した水を、研究中に使用する気密密閉容器の上部に満たします。 超音波ジェル( 材料表を参照)を円錐形のチューブに注ぎ、遠心分離機に入れ、160 x g で5分間回転させてゲルから空気を取り除きます。注:各動物の頭にゲルの塊を形成するのに十分なゲルが必要です。 4. MRgFUSシステムのセットアップ MRgFUSシステム( 材料表を参照)を、図1(底面パネル)に示す配線 図 で接続します。必要なすべてのコンポーネント(デスクトップコンピュータ、モニタ、MRgFUSプラットフォーム、オシロスコープ、アンプ)を電源に接続します。 すべてのケーブルを正しい場所に接続します。 BNCケーブルと同軸ケーブル を介して 目的のトランスデューサをMRgFUSプラットフォームに接続し、対応するインピーダンスマッチングボックスを正しいワイヤに接続します。注:本研究では、515 kHzのトランスデューサーを使用しました。 すべてのデバイスの電源を入れます。 デスクトップコンピュータのオペレーティングシステムで、FUSシステムソフトウェアにすでに統合されているAUREUSアプリケーションを開きます。 [すべてのハードウェアを接続]を選択して、 ハードウェアを システムに接続し、コンポーネントがソフトウェアと通信していることを確認します。 ドロップダウンメニューを選択し、目的のトランスデューサを選択して、使用するトランスデューサを選択します。 5. 初期化 ファントムから下部のネジを緩め、キャビティに脱イオン水と脱気水があふれるまで満たしてから、ネジを再度交換します。 ファントムを対応するMRIベッドの位置に挿入し( 図2を参照)、MRIベッドをMRIクレードルの対応するスロットに配置します。 MRIクレードルをMRIスキャナーの対応する場所に置きます( 材料表を参照)。ファントムMRIベッドが障害物なくMRIボアにスライドしてファントムの高品質の画像を取得できるようにクレードルを調整します。この場所をマークして、後で簡単に複製できるようにします。注:この場所が見つかると、治療の残りの間、場所は変更されません。したがって、動物のMRIを留置するのに適した場所であることを確認しないと、登録全体を繰り返す必要があります。 表1の設定を使用して、ファントムのMRIスキャンを行います。 クレードルをマグネットボアから取り外しますが、スキャナーには取り付けたままにしておきます。ファントムを含むMRIベッドをクレードルから取り外し、ファントム付きのベッドを底面のペグを正しいスロットにスライドさせてMRgFUSシステムに配置します。 探触子アームの磁気スロットに転写チップを差し込み、ファントムに向かって下を向くようにします( 図2を参照)。 ソフトウェアで、[ 新しいホームポジションの選択]を選択し、[ ジョグモードオン ]を選択して、ガイド付きフォーカス検索を開始します。ジョグモードを切り替えた後、左、右、上、下、ページアップ、およびページダウンキーを使用して、トランスデューサーアームをそれぞれ左、右、前、後、上、および下の方向に手動で動かします。 ポインタの先端がファントムの上部にある十字パターンの中央に触れるまで、ポインタを3次元すべてで手動で調整します( 図2を参照)。 ファントム MRI 画像をコンピューターにダウンロードし、選択したディレクトリ内のフォルダーに配置し、[ ファントム イメージのロード] を選択して MRI イメージをソフトウェアにロードします。アキシャルファントムスライスは、右側の画面に表示されます。これらのスライスをマウスのスクロールバー で スクロールします。画像をクリックしたまま、マウスを上下に動かして明るさを調整します。注:フォルダ内のファイルのいずれかが非圧縮DICOMファイルでない場合、ソフトウェアはそれらを読み取ってインポートできないため、そのフォルダから他のファイルをすべて削除します。 ファントムの画像までスクロールすると、それぞれに3つの暗い穴がある透明な円があります。ファントムの中央をクリックすると、赤い円がポップアップします。円が同じ直径になり、ファントムの円周と揃うまで、円をクリックしてドラッグします( 図2を参照)。 この位置の座標は「ホーム位置」と呼ばれます。これを保存するには 、L/R、A/P、およびS/Iの設定をクリックします。 Jog Mode Off(ジョグモードオフ)をクリックし、探触子アームから転写チップを取り外して、Exit Focus Finding(フォーカス検出を終了)を選択します。ホームポジションを確認して、初期化シーケンスを完了します。 6. SDTの動物用調製 誘導チャンバー内でイソフルラン-O2ガス混合物を使用してマウスを麻酔します。麻酔導入のためにガス流量を1.0 mL / minに、気化器を2.0%に設定し、通常、チャンバー内で3〜5分かかります(材料表を参照)。 つま先をつまんで、動物が適切な鎮静状態にあるかどうかを評価します。角膜の乾燥を避けるために眼科用軟膏を目に塗ります。注意: 処置全体を通して麻酔の深さを監視します。 尾静脈から40μLのガドリニウム造影剤をマウスに注入します( 材料表を参照)。 頭蓋骨の上の頭皮を塞いでいる髪の毛を、脱毛クリームと電子シェーバーで取り除きます。 次の手順を使用して、動物をMRIベッドに固定します( 図3を参照)。MRIベッド(図3A)のインレットチューブを麻酔用イソフルランの供給源に接続し、麻酔導入用のガス流量を1.0 mL / minに、気化器を2.0%に設定します。出口チューブをチャコールフィルターキャニスターに接続して麻酔吸収します。 ノーズコーンピースをスロットに入れます( 図3Bを参照)。図のように、ノーズコーンとベッドの端の両方にあるバイトバーの穴にバイトバーを通し、バイトガードの端をMRIベッドの開いたウェルの上にホバリングさせます。 動物をMRIベッドに置き、耳を定位耳棒の穴に合わせ、噛み合わせガードに歯を通して所定の位置に保ちます。ノーズコーンを前方にスライドさせて、動物の鼻の上に乗せて、安定した麻酔の流れを提供します。 MRIベッドの両側にある穴にイヤーバーを通し、両方のイヤーバーがマウスの外耳道に収まるまで動物の頭を上げます。注意: 動物の鼓膜を傷つける可能性があるため、押しすぎないでください。 動物が快適な姿勢にあることを確認してください。次に、マイナスドライバーを使用して、MRI互換のネジをねじ込み、両方のイヤーバー、ノーズコーン、およびバイトバーをロックします。これにより、動物が所定の位置にロックされ、動物がベッドから取り出されるまで頭の動きが防止されます。注意: この手順に従って、MRIベッドでの動物の位置に乱れがないことを確認してください。動物が動いた場合、プロトコルがどれだけ進んでいるかに関係なく、セットアップ全体(ステップ6.5)を繰り返す必要があります。 動物が待っている間、体温を維持するためにMRIベッドを温かい温熱パッドの上に置きます。注意: 手順全体を通して体温を監視および維持します。 イソフルランは、プラットフォームに設けられた固定具を使用して、動物用ベッドがFUSシステムに固定されている場合、治療中、ノーズコーンに取り付けられたチューブ を介して 動物に継続的に供給されます。 7.MRI手順 図3に示すように、動物を定位的に固定した状態でMRIベッドを取り、MRIベッドの穴の端にあるMRIベッドの穴をMRIクレードルのペグに挿入して、MRIスキャナーに事前に接続したMRIクレードル(材料表を参照)に配置します。入口と出口の麻酔チューブをMRI装置の対応するチューブに取り付けます。 動物が入ったMRIクレードルをMRIボアにスライドさせ、ファントムが置かれた場所と同じ位置を保ってください。 ローカライザーを実行して動物の脳の位置を確認し、次に表2のMRI設定を使用して脳全体をカバーする造影後T1強調MRIスキャンを実行します。 MRIスキャンを、スライスごとに1つずつ、非圧縮DICOMファイルのセットとしてエクスポートします。 8.焦点を絞った超音波治療(図4) スキャン完了後、動物をMRIクレードルから取り出し、ベッドの前面をプラットフォームの背面にある対応するペグに挿入し、ベッドの背面を対応するペグに挿入して、プラットフォームに配置します。 MRIベッドのインレットチューブを麻酔用のイソフルラン源に接続し、麻酔を維持するためにガス流量を1.0mL / minに、気化器を2.0%に設定します。出口チューブをチャコールフィルターキャニスターに接続して麻酔吸収します。 DICOMファイルのセットをコンピュータに転送し、現在のスタディのメイン作業ディレクトリのフォルダに配置します。注: ファイルの要件については、手順 5.9 を参照してください。 ソフトウェアで、メインの初期化ページに移動し、[ガイド付きフォーカス検索]をクリックしてジョグモードをオンにし、[ジョグモードオン]をクリックします。 遠心分離した超音波ジェルを動物の頭に軽くたたき、頭蓋骨の上の頭皮全体を覆うのに十分なジェルを置きます。 DIと脱気した水をウォーターバスに最大80%注ぎ、ウォーターバスをプラットフォーム上の対応するカラムに挿入します。 底の膜が動物の頭の超音波ゲルに触れ、水とゲルの間に結合面を形成するまで、脱イオン水で満たされたウォーターバスを下げます。超音波ジェルが動物の頭全体を水浴まで覆っていること、および水浴とマウスの頭皮の間の超音波ジェルに気泡がないことを確認してください。 超音波トランスデューサをウォーターバスに沈め、トランスデューサの表面に気泡が発生していないことを確認します。 ジョグモードを使用して探触子アームを部分的に水没した探触子に向かって下げ、探触子の表面が水没したままの状態で磁気スロットを互いに位置合わせして探触子に結合します。 Jog Modeをオフにし、初期化手順で行ったようにExit Focused Finding(フォーカス検索を終了)にします。前と同じようにホームポジションを必ず確認してください。 [治療]タブに移動し、画面上部中央のフォルダーアイコンをクリックして、造影後T1強調MRIファイルをアップロードします。以前にコンピューターにアップロードされたDICOMファイルを含むフォルダーを選択して開きます。この手順により、右上のパネルにすべてのDICOMファイルが自動的に読み込まれます。 次に、[超音波処理モード]タブで、[バースト]または[連続波]を選択して、適切な処理モードを選択します。バーストモードの場合は、[超音波処理設定]タブで、バースト長、バースト期間、および周期数を入力します。これらのパラメータは、各超音波処理場所に対応します。連続波モードの場合は、超音波処理時間のみを入力します。注:この研究では、連続波モードを120秒間使用しました。 ページ上部中央のターゲットアイコンをクリックし、FUS焦点領域を狙う正しいMRIスライス上の適切な位置を選択します。クリックした場所には、赤い円が付いた明るい赤い正方形が表示されます。複数の選択を選択できます。 MRI画像の左側にはテーブルがあり、選択した焦点領域の3D座標が入力されます。表の最後の列に、各焦点で超音波処理する出力レベルを入力し、所望の圧力または強度レベルを得るために使用するトランスデューサごとに個別に計算できます。表の各焦点をクリックして確認すると、座標が強調表示され、画像上の対応する焦点領域が青色に変わります。注意: これらの値はトランスデューサ固有のものであるため、表に入力された出力レベルを圧力または強度に変換する方法については、トランスデューサのデータシートを参照してください。 すべての焦点領域に問題がなければ、 モーションテストを選択します。これにより、ソフトウェアはトランスデューサーをすべての焦点に移動して、移動が可能になるようにします。確認後、ソフトウェアは モーションテスト完了を示します。エラーが発生した場合は、探触子モーターの3D軸内に収まるように焦点領域を調整します。 準備ができたら、[超音波処理の開始]を選択して 超音波処理 プロトコルを開始し、トランスデューサーを動かし、選択した各焦点領域に正しいFUSパラメータを適用します。 超音波処理プロトコルが終了したら、トランスデューサーをトランスデューサーアームから切り離し、プラットフォームからウォーターバスを取り外し、動物の頭皮から超音波ジェルを拭き取ります。 咬傷と耳のバーを緩め、動物をMRIベッドから取り出し、動物が麻酔から目覚めるまで動物を温かいパッドの上に置きます。この時点で、動物をケージに戻します。 その後の動物については、セクション6から始めて、同じプロトコルを繰り返します。 目的の動物が処理されたら、動物が触れたすべての表面を70%エタノールで洗浄します( 材料表を参照)。 ソフトウェアを終了し、各機器をシャットダウンして電源を切ります。 9. 後処理の手順 セクション 1 の in vivo イメージング システム (IVIS) プロトコルを繰り返して、処理後 24 時間で生物発光を測定します。治療効果を分析するには、治療前後の生物発光記録を比較して、治療群と未治療群の両方の成長率を決定します。 手順6.4と同じ設定を使用してフォローアップMRIスキャンを実行します。造影スキャンを使用して、腫瘍領域の平均グレースケール強度を比較するか、造影剤がカバーする総体積を計算して、治療前と治療後の腫瘍体積の違いを決定します。