Una semplice tecnica per analizzare l'attività locomotoria nella Drosophila

Drosophila melanogaster fornisce un eccellente organismo modello per studiare le funzioni cellulari e molecolari in modelli di malattia neuronale creati da modificazione genica¹, trattamento farmacologico² e senescenza³. L’elevata conservazione dei percorsi biologici, delle proprietà fisiche e dei geni omologhi associati alla malattia tra gli esseri umani e la Drosophila rende il moscerino della frutta un imitatore ideale dal livello molecolare a quello comportamentale⁴. In molti modelli di malattia, la carenza comportamentale è un indice importante, fornendo un modello utile per varie neuropatie umane ^5,6. La Drosophila è ora utilizzata per studiare molteplici malattie umane, neurosviluppo e malattie neurodegenerative come il morbo di Parkinson e la sclerosi laterale amiotrofica ^7,8. Rilevare la capacità motoria dei modelli di malattia è fondamentale per comprendere il progresso patogenetico e può fornire una correlazione fenotipica ai meccanismi molecolari alla base del processo patologico.

Recentemente, sono stati sviluppati strumenti software disponibili in commercio e programmi convenienti per le strategie di rilevamento locomotorio della Drosophila, come il test ad alta produttività in mosche raggruppate^9,10 e la misurazione della locomozione in tempo reale^11,12. Uno di questi approcci convenzionali è la geotassi negativa interattiva rapida (RING), chiamata anche saggio di arrampicata, che include più canali che consentono di contenere una grande popolazione di mosche con lo stesso sesso ed età, riducendo la variazione durante la raccolta dei dati ^9,13. Un altro metodo di pre-test per analizzare il comportamento locomotore è TriKinetics Drosophila activity monitor (DAM), un dispositivo che utilizza più fasci per rilevare il movimento dell’attività della mosca all’interno di un sottile tubo di vetro¹⁴. Il dispositivo registra continuamente la posizione, che rappresenta la locomozione automatizzata calcolando gli attraversamenti del fascio per studiare l’attività e il ritmo circadiano delle mosche per un periodo di tempo più lungo¹⁵. Sebbene questi metodi siano stati ampiamente utilizzati nell’analisi dei difetti comportamentali nei moscerini della frutta per determinare i cambiamenti nella locomozione comportamentale, richiedono sempre attrezzature di prova speciali o processi di analisi complessi e limitano la loro applicazione in alcuni modelli con un dispositivo limitato e semplice. Le strategie basate sul gruppo di tracciamento degli animali per testare la Drosofila adulta, come FlyGrAM¹¹ e il test dell’isola di Drosophila ¹⁰, implementano il reclutamento sociale e il monitoraggio individuale in un’area predefinita. Tuttavia, la restrizione sociale individuale nelle aree sfidate potrebbe avere un effetto negativo sulle identificazioni nelle immagini, causate dalla collisione o dalla sovrapposizione delle mosche. Anche se alcuni metodi basati su materiali open source, come TRex¹⁶, MARGO 12 e FlyPi¹⁷, hanno un’emergenza, possono tracciare rapidamente le mosche con un utilizzo flessibile nei test comportamentali. Questi approcci di test sono associati a elaborate installazioni di apparecchiature sperimentali, requisiti software speciali o linguaggi informatici professionali. Per le larve, misurare la distanza totale percorsa attraverso il numero di linee di confine della griglia per unità di tempo¹⁸, o contare approssimativamente le contrazioni della parete corporea per gli individui^{manualmente 19}, sono i metodi predominanti per valutare la loro capacità locomotoria. A causa della mancanza di precisione nelle attrezzature o nei dispositivi e nei metodi di analisi, alcune locomozioni comportamentali delle larve potrebbero sfuggire al rilevamento, rendendo difficile valutare con precisione il movimento comportamentale, in particolare il movimento fine¹⁵.

Il presente metodo sviluppato utilizza l’interfaccia di programmazione dell’applicazione AnimalTracker (API), compatibile con il programma di elaborazione delle immagini Fiji (ImageJ), per valutare sistematicamente l’attività locomotoria di mosche adulte e larvali analizzando il loro comportamento di tracciamento da video ad alta definizione (HD). Fiji è una distribuzione software open source ImageJ in grado di combinare robuste librerie software con numerosi linguaggi di scripting, con conseguente prototipazione rapida di algoritmi di elaborazione delle immagini, rendendolo popolare tra i biologi per le sue capacità di analisi delle immagini²⁰. Nell’approccio attuale, l’integrazione delle Fiji nell’API AnimalTracker viene sfruttata per sviluppare un test comportamentale unico di Drosophila con inserimento personalizzato dell’algoritmo e fornisce un passaggio utile per una documentazione dettagliata e tutorial per supportare solide capacità analitiche del comportamento locomotore (Figura 1). Per aggirare la complicazione delle identificazioni oggettive nelle immagini causate dalla collisione o dalla sovrapposizione di mosche, ogni arena è limitata ad ospitare una sola mosca. Dopo aver valutato la precisione di tracciamento dell’approccio, è stato implementato per tracciare e quantificare i movimenti locomotori di Drosophila che sono stati somministrati con il farmaco tossico rotenone, che viene generalmente utilizzato per modelli animali della malattia di Parkinson, scoprendo infine la compromissione della locomozione nel trattamento farmacologico²¹. Questa metodologia, che impiega software open source e libero, non richiede strumentazione ad alto costo e può analizzare in modo preciso e riproducibile la locomozione comportamentale della Drosophila .