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생물학

Évaluation de la toxicité chimique chez la drosophile melanogaster adulte

Published: March 24, 2023
doi:
10.3791/65029
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1Department of Biology,Indiana University, 2Bloomington Drosophila Stock Center, Department of Biology,Indiana University, 3School of Biosciences,University of Birmingham, 4O’Neill School of Public and Environmental Affairs,Indiana University, 5Section of Developmental Genomics, Laboratory of Biochemistry and Genetics, National Institute of Diabetes and Kidney and Digestive Diseases,National Institutes of Health

Summary

Ce protocole décrit une méthode efficace et peu coûteuse qui utilise des milieux liquides pour évaluer les effets des toxiques chimiques sur la viabilité de Drosophila melanogaster adulte.

Abstract

Les industries humaines génèrent des centaines de milliers de produits chimiques, dont beaucoup n’ont pas été suffisamment étudiés pour la sécurité environnementale ou les effets sur la santé humaine. Ce déficit d’informations sur la sécurité chimique est exacerbé par les méthodes d’essai actuelles chez les mammifères qui sont coûteuses, exigeantes en main-d’œuvre et chronophages. Récemment, les scientifiques et les organismes de réglementation ont travaillé à l’élaboration de nouvelles méthodologies d’approche (MNA) pour les tests de sécurité chimique qui sont moins chers, plus rapides et réduisent la souffrance animale. L’un des principaux MNA à émerger est l’utilisation d’organismes invertébrés en remplacement de modèles de mammifères pour élucider les modes d’action chimiques conservés chez des espèces éloignées, y compris les humains. Pour faire avancer ces efforts, nous décrivons ici une méthode qui utilise la mouche des fruits, Drosophila melanogaster, pour évaluer la sécurité chimique. Le protocole décrit une procédure simple, rapide et peu coûteuse pour mesurer la viabilité et le comportement alimentaire des mouches adultes exposées. De plus, le protocole peut être facilement adapté pour générer des échantillons pour des approches génomiques et métabolomiques. Dans l’ensemble, le protocole représente une étape importante dans l’établissement de la drosophile comme modèle standard pour une utilisation en toxicologie de précision.

Introduction

Les humains sont constamment exposés à des produits chimiques provenant de diverses sources, notamment l’air1, les aliments 2, l’eau3,4, les médicaments5, les agents de nettoyage6, les produits de soins personnels 7, les produits chimiques industriels 7 et les matériaux de construction 7. En outre, des milliers de nouveaux produits chimiques sont introduits chaque année8, dont beaucoup ne sont pas correctement contrôlés pour la santé et la sécurité environnementale. Ce manque d’essais adéquats de sécurité chimique découle en partie d’une dépendance excessive à l’égard des modèles de mammifères, tels que les souris et les rats. Bien que ces modèles de rongeurs soient informatifs, les essais de sécurité chimique dans ces systèmes sont coûteux, prennent beaucoup de temps et causent souvent des niveaux inacceptables de souffrance à l’animal d’essai9.

Les fardeaux financiers et éthiques associés aux essais de sécurité chimique chez les mammifères, ainsi que la nature chronophage des études sur les mammifères, sont des facteurs importants qui contribuent à la rareté des données entourant les nouveaux produits chimiques. Pour résoudre ce problème, l’Environmental Protection Agency (EPA) des États-Unis, l’Agence européenne des produits chimiques (ECHA), Santé Canada et d’autres organismes mettent en œuvre des mesures qui intègrent les méthodologies de nouvelle approche (MNA) dans les cadres réglementaires10, alignant ainsi les politiques nord-américaines et européennes sur les objectifs internationaux de remplacement, de réduction et de raffinement de l’utilisation des animaux (principe des 3R)11. 12,13,14. Les MNA englobent une variété d’essais principalement basés sur des modèles in vitro et in silico qui fournissent une compréhension mécaniste de la toxicité chimique au lieu d’observer l’adversité infligée aux espèces d’essai de mammifères, augmentant ainsi le taux de production de données pour l’évaluation des risques chimiques tout en produisant des résultats haute fidélité15. Cependant, il n’est pas encore prouvé que ces méthodes protègent contre la toxicité systémique, y compris la perturbation des processus biologiques vitaux impliquant la communication inter-organes et la signalisation endocrinienne. En outre, ils ne peuvent pas tenir compte de la bioaccumulation de produits chimiques dans des tissus spécifiques, de la capacité des composés individuels à être absorbés et sécrétés, et de l’interaction entre le comportement et l’exposition chimique.

En raison des limites des modèles in vitro et informatiques, l’utilisation réussie des MNA pour réduire ou remplacer les modèles de mammifères devrait également inclure des modèles in vivo d’invertébrés, tels que la mouche des fruits, Drosophila melanogaster. Des études antérieures chez la mouche ont démontré que cet organisme est bien adapté à l’étude des voies génétiques conservées qui protègent les cellules animales contre les molécules toxiques 16,17,18,19,20,21,22. De plus, la mouche présente une similitude génétique remarquable avec l’homme, y compris des homologues fonctionnels à plus de 65% des maladies humaines 23,24,25 et une conservation encore plus grande des voies fonctionnelles importantes 26. Ces caractéristiques, combinées à leur cycle de vie relativement court, à leur faible coût d’entretien et à leurs réponses comportementales facilement observables, rendent la drosophile bien adaptée à une utilisation comme modèle toxicologique 27,28,29,30. De plus, les mouches ont un débit beaucoup plus élevé que les modèles de rongeurs et capturent des effets sur le métabolisme, la physiologie et la signalisation hormonale qui ne sont pas facilement détectables par d’autres MNAnon organismes 9.

Le protocole décrit ici représente un cadre pour tester les effets de l’exposition chimique sur la drosophile adulte. La méthode est conçue pour être efficace, peu coûteuse et reproductible, tout en minimisant le temps que les chercheurs doivent être en contact avec le produit chimique d’essai et en permettant la collecte d’échantillons pour la métabolomique et d’autres approches omiques. Le protocole est optimisé pour tester un seul produit chimique par expérience, mais peut facilement prendre en charge d’autres paramètres expérimentaux, tels que des solvants variés ou des combinaisons de produits chimiques.

Protocol

REMARQUE: Portez des gants en nitrile pour toutes les étapes de ce protocole. Porter une blouse de laboratoire, une protection oculaire et/ou un respirateur, conformément aux fiches de données de sécurité pour chaque produit chimique évalué. 1. Préparation du flacon et de la chambre d’humidité NOTE: Les étapes 1.1-1.5 peuvent être complétées à tout moment avant de commencer les autres sections expérimentales. Des gants en nitrile doivent être portés en tout temps pendant la préparation du flacon pour éviter toute contamination. Empiler quatre feuilles de papier de chromatographie cellulosique de grade 1 (voir le tableau des matières) et les couper en 2 en larges bandes. Poinçonner les inserts de papier filtre en forme de fleur à l’aide d’un poinçon en papier de 1,5 po contenant une matrice en forme de fleur. Utilisez un goujon en bois non verni de 22 mm x 220 mm pour pousser le papier filtre au fond d’un flacon en polypropylène de 28,5 mm de diamètre. Vérifiez que la pile de papier filtre est bien située au fond du flacon. Conservez les flacons préparés dans des plateaux en plastique ou en carton et placez-les dans de grands sacs en plastique (~280 mm x 240 mm) jusqu’à utilisation. Construisez une chambre d’humidité en perçant un trou de 120 mm x 280 mm dans le couvercle en plastique d’un bac en plastique de 606,24 mm x 225,42 mm x 403,22 mm (voir le tableau des matériaux). Collez le treillis sur le trou pour permettre la circulation de l’air. Découpez une section de la grille en plastique à partir de panneaux de plafonnier à persiennes (à l’origine 610 mm x 1220 mm) pour l’insérer dans le fond du bac en plastique utilisé à l’étape 1.4.REMARQUE: Une variété de différents bacs en plastique et matériaux de grille en plastique / métal peuvent être utilisés pour construire une chambre d’humidité. 2. Élevage de mouches Commencer les cultures de mouches adultes (minimum de 30 adultes) dans des bouteilles de lait en verre contenant le milieu standard du Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)31. Fermez les bouteilles avec un bouchon de rayonne enveloppé dans une lingette délicate. N’encombrez pas les bouteilles.REMARQUE : Le nombre de bouteilles requises dépend du nombre d’expositions chimiques effectuées et du génotype de la souche d’essai. Normalement, plusieurs centaines de mouches peuvent être obtenues à partir d’une seule bouteille lors de l’utilisation de bouillons robustes et féconds. Le test standard utilise des mouches de type sauvage Oregon-R (stock BDSC #2057), mais tout génotype d’intérêt peut être utilisé avec ce protocole. Rappelez-vous que les génotypes compromis avec une faible fécondité et/ou viabilité nécessitent une augmentation des cultures en bouteille. Incuber les plateaux des bouteilles de culture à 25 °C avec environ 60% d’humidité et un cycle lumière:obscurité de 12:12 h jusqu’à ce que le troisième stade larvaire ou les premiers stades nymphaux soient observés. Ce stade est identifiable par la présence de larves errant sur les côtés de la bouteille et l’apparition de pupes sur les parois de la bouteille.REMARQUE: Ne manipulez les mouches que pendant la période d’allumage du cycle lumière:obscurité de 12h12. Pour des stocks robustes, les bouteilles atteignent ce stade après 3-4 jours dans les conditions décrites.Enlevez les mouches adultes et déterminez la liquidité du média. Si le média coule le long du côté de la bouteille lorsqu’il est retourné, le milieu est trop liquide. Insérez une lingette délicate ou une boule de rayonne dans le fond de la bouteille pour solidifier la nourriture contre les mouches. Lorsque les mouches commencent à se fermer, débarrassez-vous de tous les adultes des bouteilles et laissez les pupes continuer à se fermer pendant 48 heures. À ce stade, tous les adultes débarrassés des bouteilles de culture peuvent être transférés dans de nouvelles bouteilles pour propager les souches (voir étape 2.1) ou jetés. Transférer les mouches qui se ferment au cours de la période de 48 heures vers de nouvelles bouteilles contenant des supports BDSC standard. Âge de 3 jours.REMARQUE: Les adultes dans ces biberons sont âgés de 3 à 5 jours et peuvent être utilisés dans les expériences de létalité et d’alimentation. Les bouteilles utilisées pour vieillir les mouches adultes contiendront des œufs et des larves. En conséquence, ces bouteilles peuvent être utilisées pour propager la prochaine génération de mouches. 3. Préparation des mouches pour l’exposition aux produits chimiques Anesthésier les mouches de 5 à 7 jours avec du CO2. Trier les mouches anesthésiées par sexe en utilisant leurs organes génitaux. Pour obtenir de l’aide sur l’anesthésie et le sexage des mouches, voir la référence28. Placer des groupes de 20 mouches mâles ou de 20 femelles dans des flacons contenant des supports BDSC standard. Fermez le flacon avec un bouchon de rayonne et conservez les flacons mâles et femelles séparément. Marquez les flacons contenant des mouches femelles avec une rayure. Laissez les flacons avec les mouches mâles non marqués pour éviter de mélanger accidentellement les sexes.REMARQUE : Le nombre de flacons qui doivent être préparés à l’étape 3.2 est déterminé par la taille des expériences d’exposition. Comme décrit aux étapes 5.3 et 5.6, une expérience typique de détermination de l’intervalle pour un seul produit chimique d’essai nécessite un minimum de 40 flacons de mâles et 40 flacons de femelles. Une expérience de courbe dose-réponse standard, décrite aux étapes 7.4 et 7.8, nécessite un minimum de 63 flacons de mâles et 63 flacons de femelles. Conservez les flacons pendant 48 h dans un incubateur à 25 °C à environ 60 % d’humidité et avec un cycle lumière:obscurité de 12:12 h. Pendant ce temps, placez le plateau des flacons triés à un angle de 60 ° pour empêcher les mouches de rester coincées dans la nourriture pendant la récupération de l’anesthésie.REMARQUE: Cette étape permet aux mouches de récupérer de l’anesthésie au CO2 . Ne pas anesthésier les mouches à nouveau pendant le reste du protocole d’exposition. Après la période de récupération de 48 heures, ajouter 0,75 mL d’eau purifiée stérile aux flacons préparés à l’étape 1.3. Le nombre de flacons préparés à cette étape doit être identique au nombre de flacons mis en place à l’étape 3.2. Transférer les mouches triées et appariées au flacon de famine en ouvrant le flacon en verre contenant les mouches de l’étape 3.2, en le mettant dans la bouche du flacon en plastique préparé, puis en tapotant le fond du flacon en plastique contre une paillasse. Fermez le flacon en plastique avec un bouchon en acétate de cellulose (communément appelé flug).Notez toutes les mouches perdues lors de ce transfert (transfert dans les registres du nombre de mouches de départ pour chaque flacon plus tard). Marquez les flacons de famine contenant des mouches femelles avec une rayure. Laissez les flacons avec les mouches mâles non marqués pour éviter de mélanger accidentellement les sexes. Préparez la chambre d’humidité pour une exposition de nuit. Voir les étapes 1.4-1.5 pour une description de la façon de construire cette chambre.Placez six serviettes en papier standard dans le fond de la chambre d’humidité. Trempez les serviettes en papier avec 100 ml d’eau. Placez la grille en plastique (étape 1.5) sur les serviettes humides pour vous assurer que les flacons n’entrent pas en contact avec les serviettes en papier saturées. Placez les plateaux des flacons de famine en position horizontale à l’intérieur des chambres d’humidité. Placez les chambres d’humidité dans un incubateur à 25 °C (à environ 60 % d’humidité) pendant la nuit.NOTE: Idéalement, la période de famine de nuit dure environ 16 heures; Cependant, le calendrier peut être ajusté en fonction des horaires de laboratoire individuels. 4. Préparation des solutions mères NOTE: Les mouches sont nourries avec des produits chimiques d’essai dans un milieu liquide levure-saccharose. Cette section décrit la préparation des solutions mères de milieux d’alimentation concentrés et de produits chimiques d’essai. Préparer une solution de levure-saccharose 4x contenant 16 % de saccharose et 6 % d’extrait de levure (m/v) (voir le tableau des matières) dissous dans de l’eau purifiée stérile. Autoclaver la solution sur un cycle liquide pendant le temps de stérilisation approprié (par exemple, 40 min pour 1 L).NOTE: La solution peut être fabriquée en vrac et conservée dans des aliquotes à -20 °C. Décongeler les aliquotes individuelles 1 jour avant utilisation en les plaçant dans un réfrigérateur à 4 °C. Préparer un stock de la substance d’essai. Pour l’expérience initiale, la solution mère doit être fabriquée à la concentration la plus élevée afin que le produit chimique puisse être complètement dissous dans l’eau.NOTA: Des solvants autres que l’eau peuvent être utilisés pour dissoudre la substance d’essai. Voir la discussion concernant les mises en garde concernant l’utilisation de solvants alternatifs. Préparer une solution mère de colorant bleu 100x en dissolvant 1 g de FD&C Blue No. 1 (voir le tableau des matières) dans 10 ml d’eau purifiée stérile.NOTE: La solution mère de colorant bleu peut être fabriquée en vrac et stockée dans des aliquotes à 4 °C. 5. Préparation des flacons d’exposition : expérience de télémétrie REMARQUE : Les étapes 5 et 6 du protocole sont conçues pour identifier la dose la plus faible de produit chimique d’essai qui induit une létalité de 100 % et la dose la plus élevée qui ne parvient pas à induire un phénotype mortel. Si ces concentrations sont déjà déterminées par des expériences antérieures, voir les étapes 7 et 8 pour calculer une courbe dose-réponse. Les milieux d’exposition doivent être préparés immédiatement avant d’ajouter des mouches aux flacons d’exposition. Étiqueter huit tubes à centrifuger de 15 mL comme suit : (i) aucun produit chimique, (ii) concentration la plus élevée, (iii) 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 et 1:1 000. Préparer le milieu d’exposition dans les tubes à centrifuger marqués à partir de l’étape 5.1 en ajoutant d’abord 2,5 mL de 4x solution mère de levure/saccharose aux huit tubes étiquetés.Ajouter 7,5 mL d’eau purifiée stérile dans le tube étiqueté « sans produit chimique ». Cette dilution est le témoin négatif. Ajouter 7,4 mL de la solution mère de la substance d’essai dans le tube étiqueté « concentration la plus élevée ». Ajoutez 100 μL d’eau purifiée stérile à ce tube, de sorte que le volume final est de 10 mL. Calculer et enregistrer la molarité de la substance d’essai dans cette solution.NOTE: L’ajout de 100 μL d’eau purifiée stérile dans le tube garantit que la concentration chimique à cette étape est identique à celle utilisée à l’étape 5.5, où une solution mère de colorant bleu est ajoutée au milieu d’exposition comme méthode d’évaluation du comportement alimentaire. Ajouter la quantité appropriée de solution mère de produit chimique d’essai et d’eau purifiée stérile dans les tubes restants. Le volume final de chaque tube doit être de 10 mL. La concentration finale des produits chimiques d’essai dans ces tubes par rapport au tube à « concentration la plus élevée » doit être de 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 et 1:1 000. Préparer et étiqueter huit flacons d’exposition pour chaque concentration individuelle de milieu d’exposition générée à l’étape 5.1. Il devrait y avoir huit ensembles de flacons (64 flacons au total) contenant les étiquettes suivantes : aucun produit chimique, concentration la plus élevée, 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 et 1:1 000.Introduire à la pipette 0,75 mL de milieu d’exposition préparé à l’étape 5.2.3 dans le jeu correspondant de flacons d’exposition. Étiqueter huit tubes individuels de 5 mL comme suit : (i) aucun produit chimique, (ii) concentration la plus élevée, (iii) 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 et 1:1 000. Préparer le milieu d’exposition au colorant bleu en mélangeant d’abord 500 μL de 4x solution mère de levure/saccharose et 20 μL de solution mère de colorant bleu dans huit tubes de 5 mL étiquetés.Ajouter 1,48 mL d’eau purifiée stérile dans le tube étiqueté « sans produit chimique ». Cette dilution est le témoin négatif. Ajouter 1,48 mL de la solution mère de la substance d’essai dans le tube étiqueté « concentration la plus élevée ». Aucune eau n’est ajoutée à ce tube. Calculer et enregistrer la molarité de la substance d’essai dans cette solution. Ajouter la quantité appropriée de solution mère de produit chimique d’essai et d’eau purifiée stérile dans les tubes restants. Le volume final de chaque tube doit être de 2 ml. La concentration finale de la substance d’essai dans ces tubes par rapport au tube à « concentration la plus élevée » doit être de 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 et 1:1 000. Préparer et étiqueter deux flacons d’exposition avec chaque concentration individuelle de milieu d’exposition bleu. Il devrait y avoir huit ensembles de flacons (16 flacons au total) contenant les étiquettes suivantes : aucun produit chimique, concentration la plus élevée, 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 et 1:1 000. Le mot « bleu » doit également être écrit sur ces flacons.Introduire à la pipette 0,75 mL de milieu d’exposition bleu dans le jeu correspondant de flacons d’exposition bleus. 6. Exposition aux produits chimiques des mouches : expérience de télémétrie Préparer les flacons d’exposition aux produits chimiques en utilisant les flacons de mouches affamées pendant la nuit de l’étape 3.7 comme suit :Transférer quatre flacons de mouches femelles affamées (20 mouches par flacon) dans quatre flacons d’exposition de chaque concentration chimique. Étiquetez ces flacons « femelle ». Utilisez la même méthode de transfert que celle décrite à l’étape 3.5. Transférer quatre flacons de mouches mâles affamées (20 mouches par flacon) dans quatre flacons d’exposition de chaque concentration chimique. Étiquetez ces flacons « mâles ». Utilisez la même méthode de transfert que celle décrite à l’étape 3.5. Préparer les flacons d’exposition aux produits chimiques contenant du colorant bleu en utilisant les flacons de mouches affamées pendant la nuit à l’étape 3.7 comme suit :Transférer un flacon de mouches femelles affamées (20 mouches par flacon) dans un flacon d’exposition bleu pour chaque concentration chimique. Étiquetez ce flacon « femelle ». Utilisez la même méthode de transfert que celle décrite à l’étape 3.5. Transférer un flacon de mouches mâles affamées (20 mouches par flacon) dans un flacon d’exposition bleu pour chaque concentration chimique. Étiquetez ce flacon « mâle ». Utilisez la même méthode de transfert que celle décrite à l’étape 3.5. Notez le nombre de mouches présentes dans chaque flacon après le transfert et notez le nombre de mouches mortes ou échappées. Normalement, les 20 mouches devraient survivre à la famine et au transfert nocturnes. Placer les flacons d’exposition horizontalement dans des chambres d’humidité fraîchement préparées (voir étape 3.6 pour la préparation de la chambre d’humidité). Placez les chambres dans un incubateur à 25 °C avec environ 60% d’humidité et un cycle lumière:obscurité de 12h12. Examiner les flacons d’exposition 24 et 48 heures après le début de l’exposition chimique. Compter et noter le nombre de mouches mortes dans chaque flacon à chaque point temporel.NOTE: La mort est utilisée comme lecture pour ce test, mais le protocole peut être adapté pour examiner d’autres phénotypes. Les mouches exposées sont couramment collectées à ces moments pour des études transcriptomiques et métabolomiques. Examiner les flacons d’exposition bleue 24 h après le début de l’exposition chimique. Utilisez les techniques suivantes pour déterminer si les mouches exposées ont consommé le milieu d’exposition bleu :Examinez les parois du flacon à la recherche de signes de matières fécales bleues, qui apparaissent sous forme de petits points sur le côté du flacon d’exposition ainsi que sur le flacon. Anesthésiez les mouches avec du CO2 et examinez l’abdomen pour détecter la présence de colorant bleu.REMARQUE: Normalement, les flacons d’exposition bleue sont analysés après 24 heures. Cependant, cette étape pourrait être effectuée à 48 h, à la place. Les mouches qui ont mangé ont normalement une bande bleue à travers l’abdomen, indiquant que le milieu d’exposition est entré dans l’intestin. Examiner les mouches pour détecter des comportements alimentaires anormaux, tels que la régurgitation, la distension des cultures et la dégradation de la fonction de barrière intestinale (indiquée par l’apparition de colorant bleu dans tout l’organisme plutôt que simplement limité au tractus gastro-intestinal, communément appelé schtroumpfing32,33). Jetez tous les flacons, papiers filtres, peluches et mouches contaminés dans des contenants de déchets chimiques appropriés. S’il reste des mouches vivantes dans les flacons, congelez-les pour tuer les mouches avant de les jeter dans le conteneur à déchets approprié.REMARQUE : L’élimination des flacons d’exposition et des mouches est dictée par le ou les produits chimiques analysés dans l’expérience. Suivez toujours les procédures de sécurité chimique décrites sur la fiche de données de sécurité chimique. Si les concentrations utilisées dans l’expérience de détermination de l’étendue tuent les mouches à la dose la plus faible, répéter la section 6 en utilisant une série de dilutions, en commençant par la concentration la plus faible qui a tué 100 % des animaux. 7. Préparation des flacons d’exposition : génération d’une courbe dose-réponse REMARQUE : Le protocole décrit aux étapes 5 et 6 est conçu pour déterminer globalement la concentration chimique requise pour obtenir un phénotype. Les étapes 7 et 8 du protocole sont utilisées pour calculer une courbe dose-réponse précise. Calculer les concentrations de la substance d’essai qui doivent être analysées pour obtenir une courbe dose-réponse à l’aide de la méthode suivante :Déterminer la concentration la plus faible de la substance d’essai qui tue 100 % des mouches exposées à 48 h. Déterminer la concentration la plus élevée de la substance d’essai qui n’a aucun effet sur la viabilité à 48 heures. Calculer quatre concentrations supplémentaires réparties également entre les concentrations déterminées aux étapes 7.1.1 et 7.1.2. Étiqueter neuf tubes à centrifuger individuels de 15 mL avec la molarité des concentrations suivantes : (i) aucun produit chimique, (ii) concentration déterminée à l’étape 7.1.1, (iii) concentration déterminée à l’étape 7.1.2, (iv) concentrations déterminées à l’étape 7.1.3, (v) deux fois la concentration déterminée à l’étape 7.1.1, (vi) une dilution de la concentration de 1:2 déterminée à l’étape 7.1.2.NOTA: L’inclusion des concentrations qui sont deux fois la concentration déterminée au point 7.1.1 et une dilution de 1:2 de celle déterminée à l’étape 7.1.2 est importante pour calculer avec précision la courbe dose-réponse. Préparer le milieu d’exposition en ajoutant d’abord 2,5 mL de 4x solution mère de levure/saccharose à neuf tubes de centrifugation individuels de 15 mL étiquetés préparés à l’étape 7.2.Ajouter 7,5 mL d’eau purifiée stérile dans le tube étiqueté « sans produit chimique ». Cette dilution est le témoin négatif. Ajouter la quantité appropriée de solution mère de produit chimique d’essai et d’eau purifiée stérile dans les tubes restants. Le volume final de chaque tube doit être de 10 mL. La concentration finale de produit chimique dans un tube individuel doit être égale à celle inscrite à l’extérieur du tube. Préparer et étiqueter 12 flacons d’exposition pour chaque concentration de milieu d’exposition générée à l’étape 7.2. Il devrait y avoir neuf ensembles de flacons (108 flacons au total). Introduire à la pipette 0,75 mL de milieu d’exposition dans le jeu correspondant de flacons d’exposition.Remarque : Les étapes 7.6 à 7.8 sont facultatives. Si l’on sait que les concentrations de la substance d’essai préparée à l’étape 7.2 n’affectent pas le comportement alimentaire, ces étapes peuvent être ignorées. Préparer et étiqueter neuf tubes différents de 5 mL pour les milieux d’exposition au bleu avec la même série de concentrations que celle utilisée à l’étape 7.2. Préparer le milieu d’exposition au colorant bleu en mélangeant d’abord 500 μL de 4x solution mère de levure/saccharose et 20 μL de solution mère de colorant bleu.Ajouter 1,48 mL d’eau stérile purifiée dans le tube étiqueté « sans produit chimique ». Cette dilution est le témoin négatif. Ajouter la quantité appropriée de solution mère de produit chimique d’essai et d’eau stérile purifiée dans les tubes restants. Le volume final de chaque tube doit être de 2 mL. La concentration finale de produit chimique dans un tube individuel doit être égale à celle inscrite à l’extérieur du tube. Préparer et étiqueter deux flacons d’exposition pour chaque concentration individuelle de milieu d’exposition bleu. Il devrait y avoir neuf ensembles de flacons (18 flacons au total), chaque ensemble de flacons étant étiqueté avec les concentrations indiquées à l’étape 7.2. Le mot « bleu » doit également être écrit sur ces flacons.Introduire à la pipette 0,75 mL de milieu d’exposition bleu dans le jeu correspondant de flacons d’exposition bleus. 8. Exposition aux produits chimiques des mouches : générer une courbe dose-réponse Préparer les flacons d’exposition aux produits chimiques en utilisant les flacons de mouches affamées pendant la nuit de l’étape 3.7 comme suit :Transférer six flacons de mouches femelles affamées (20 mouches par flacon) dans six flacons d’exposition de chaque concentration chimique. Étiquetez ces flacons « femelle ». Utilisez la même méthode de transfert que celle décrite à l’étape 3.5. Transférer six flacons de mouches mâles affamées (20 mouches par flacon) dans six flacons d’exposition de chaque concentration chimique. Étiquetez ces flacons « mâles ». Utilisez la même méthode de transfert que celle décrite à l’étape 3.5. Préparer les flacons d’exposition aux produits chimiques contenant du colorant bleu en utilisant les flacons de mouches affamées pendant la nuit à l’étape 3.7 comme suit :Transférer un flacon de mouches femelles affamées (20 mouches par flacon) dans un flacon d’exposition bleu pour chaque concentration chimique. Étiquetez ce flacon « femelle ». Utilisez la même méthode de transfert que celle décrite à l’étape 3.5. Transférer un flacon de mouches mâles affamées (vingt mouches par flacon) dans un flacon d’exposition bleu pour chaque concentration chimique. Étiquetez ce flacon « mâle ». Utilisez la même méthode de transfert que celle décrite à l’étape 3.5. Notez le nombre de mouches présentes dans chaque flacon après le transfert. Normalement, les 20 mouches devraient survivre à la famine et au transfert nocturnes, mais assurez-vous que celles qui sont mortes ou qui se sont échappées pendant le transfert sont soustraites du total. Placer les flacons d’exposition horizontalement dans des chambres d’humidité fraîchement préparées (voir étape 3.6 pour la préparation de la chambre d’humidité). Placez les chambres dans un incubateur à 25 °C avec environ 60% d’humidité et un cycle lumière:obscurité de 12h12. Examiner les flacons d’exposition 24 et 48 heures après le début de l’exposition chimique. Compter et noter le nombre de mouches mortes dans chaque flacon à chaque point temporel. Examiner les flacons d’exposition bleue 24 h après le début de l’exposition chimique. Utilisez la méthode décrite à l’étape 6.6 pour évaluer les changements dans le comportement alimentaire. Jetez tous les flacons, papiers filtres, peluches et mouches contaminés dans des contenants de déchets chimiques appropriés. S’il reste des mouches vivantes dans les flacons, congelez les flacons pour tuer les mouches avant de les jeter dans le conteneur à déchets approprié.REMARQUE : L’élimination des flacons d’exposition et des mouches est dictée par le ou les produits chimiques analysés dans l’expérience. Suivez toujours les procédures de sécurité chimique décrites sur la fiche de données de sécurité chimique. 9. Calcul d’une courbe dose-réponse Utiliser le logiciel de dose de référence (BMDS, version 3.2; voir le tableau des matières) ou un autre logiciel similaire pour analyser les données34. Ce qui suit décrit le flux de travail à l’aide du logiciel BMDS. Cliquez sur l’onglet Données de BMDS et cliquez sur insérer un nouvel ensemble de données. Entrez le nombre d’échantillons dans le jeu de données, cliquez sur dichotomique, puis cliquez sur créer un jeu de données. Entrez chaque réplique en tant que ligne individuelle dans le jeu de données. Entrez la dose dans la première colonne du tableau généré, le nombre initial de mouches à l’exclusion de celles qui sont mortes ou ont été perdues avant l’étape 8.3) dans la deuxième colonne et le nombre de mouches mortes à la suite d’une exposition chimique dans la troisième colonne. Cliquez sur l’onglet Principal de BMDS. Cliquez sur la flèche déroulante du menu Sélectionner le type de modèle et cliquez sur Dichotomous. Cliquez sur activer pour le jeu de données de l’étape 9.2 dans le tableau Ensembles de données. Cliquez sur les cases correspondant aux modèles souhaités pour l’analyse dans le tableau MLE et alternatives.REMARQUE : Le modèle de la colline dichotomique restreinte fréquentiste a été principalement utilisé. Cliquez sur Exécuter l’analyse. Le programme générera un fichier de sortie avec la ou les courbes de létalité et des détails supplémentaires sur le(s) modèle(s).

Representative Results

La mouche a longtemps servi de modèle dans les études pour déterminer la toxicité de l’arsénite de sodium (NaAsO2)35,36,37,38. Pour démontrer l’efficacité du protocole, des mouches mâles et femelles ont été exposées à NaAsO2, dans le but de comparer ces résultats avec des études antérieures. À l’aide de la méthodologie décrite ci-dessus, les mâles et les femelles adultes de l’Oregon-R (BDSC stock #2057) ont été exposés à une gamme de concentrations de NaAsO 2 (0, 0,01, 0,02, 0,1, 0,2, 1 et2 mM) et ont obtenu un score de létalité 48 heures après le début de l’exposition (figure 1A, B). Le but de cette première analyse était d’identifier la plage approximative de concentrations qui permettrait une caractérisation plus précise de la toxicité duNaAsO2. Dans des expériences ultérieures, des concentrations ont été sélectionnées (0, 0,2, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5 et 5 mM) qui ont défini plus précisément la courbe dose-réponse NaAsO2 (Figure 1C,D). Il est à noter que l’analyse qui en a résulté a examiné plusieurs concentrations qui ont induit une létalité de 100 %. Les données ont été analysées à l’aide de la version 3.2.0.125 du logiciel Benchmark Dose Software de l’Environmental Protection Agency. Les données ont été modélisées comme étant « dichotomiques » et le modèle de la colline dichotomique a été utilisé pour les analyses subséquentes. Sur la base de ce modèle, les DL10, DL25 et DL 50 finales des mouches mâles nourries au NaAsO2 étaient respectivement de 0,30 mM, 0,50 mM et 0,65 mM. Pour les mouches femelles, ces valeurs étaient légèrement plus élevées, avec une DL10 de 0,30 mM, une DL25 de 0,65 mM et une DL50 de 0,90 mM. Dans l’ensemble, les valeurs obtenues à l’aide de cette méthode sont similaires à celles précédemment rapportées pour la toxicité de l’arsenic chez Drosophila melanogaster35,36,37,38, validant ainsi la méthodologie. En plus des six répétitions utilisées pour calculer la courbe dose-réponse, les mouches mâles et femelles ont également été nourries avec des solutions d’exposition au NaAsO2 contenant 1% de bleu FD&C, qui est facilement visible dans le tube digestif par microscopie optique. D’après la présence de colorant bleu dans l’intestin de mouches nourries au NaAsO 2, les mouches mâles et femelles ont continué à se nourrir 24 heures après le début de l’exposition chimique, quelle que soit la concentration de NaAsO2 présente dans le milieu liquide (Figure 2). Cependant, on a observé que les aliments ingérés étaient occasionnellement régurgités à des doses supérieures à 0,2 mM pour les femelles et à 0,5 mM pour les mâles (figure 2). Ces résultats suggèrent que la régurgitation pourrait jouer un rôle clé dans la réponse de la drosophile à l’empoisonnement à l’arsenic. Figure 1 : Courbes dose-réponse pour la drosophile mâle et femelle traitée par NaAsO2 pendant 48 h. Tous les graphiques montrent les proportions estimées de mouches mortes à chaque concentration de NaAsO2 testée sur la base du modèle de Dichotomous Hill. (A,B) Une large gamme de concentrations de NaAsO2 a été testée pour estimer la dose à laquelle chaque sexe de mouche commence à mourir. (A) montre les données masculines et (B) montre les données féminines. N = 4 flacons, avec 20 mouches par flacon. (C, D) Une plage plus étroite de concentrations de NaAsO2 a été testée pour déterminer des doses précises auxquelles 10%, 25% et 50% de chaque sexe de mouches sont morts. Ces doses sont indiquées à droite de chaque graphique. (C) montre les données masculines et (D) montre les données féminines. N = 6 flacons, avec 20 mouches par flacon. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 2 : Résultats représentatifs du dosage au colorant bleu de drosophiles mâles et femelles traités par NaAsO2 pendant 24 h. Les micrographies montrent des mouches nourries à des concentrations croissantes de NaAsO2. La rangée (A) montre les mouches mâles et la rangée (B) montre les mouches femelles, la concentration de NaAsO2 augmentant de gauche à droite. L’abdomen montre une petite quantité de bleu près du thorax à de faibles concentrations, indiquant que le milieu d’exposition est entré dans l’intestin. À des concentrations plus élevées, le colorant bleu commence à s’accumuler autour de la bouche, ce qui suggère que le milieu d’exposition est régurgité. La barre d’échelle est de 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

La mouche des fruits Drosophila melanogaster est en train de devenir un système puissant pour les NAM16,18,19,21. En tirant parti des ressources génétiques inégalées dont dispose la communauté des mouches, combinées aux progrès récents de la génomique et de la métabolomique, les études sur l’innocuité chimique utilisant la drosophile sont capables d’identifier rapidement les mécanismes moléculaires par lesquels les composés individuels interfèrent avec le métabolisme, la physiologie et la signalisation cellulaire (par exemple, voir39). Ce protocole peu coûteux est conçu pour définir rapidement les courbes dose-réponse et générer par la suite des échantillons pour le séquençage de l’ARN et l’analyse métabolomique. De plus, ce protocole flexible peut être adapté pour être utilisé avec n’importe quel génotype et peut accueillir de nombreuses classes de produits chimiques.

Un aspect notable de ce protocole est le choix de l’aliment liquide utilisé dans l’exposition chimique, qui est basé sur une étude antérieure, mais diffère des milieux solides utilisés par la plupart des études toxicologiques sur la drosophile18,22. Ce milieu liquide spécifique a été choisi pour refléter le contenu nutritionnel du milieu BDSC solide standard que les mouches sont également nourries dans ce protocole, afin de s’assurer que les mouches reçoivent une nutrition constante. La simplicité des fluides d’alimentation liquides présente de nombreux avantages. Les milieux liquides sont plus faciles à manipuler que les aliments solides, qui doivent être fondus et resolidifiés ou reconstitués à partir de poudre. Les fluides liquides augmentent également le débit du système, assurent une distribution uniforme des produits chimiques dans tout le milieu d’alimentation et réduisent le temps passé à travailler avec des composés dangereux. De plus, le média ne nécessite pas de solutions à chauffer, ce qui facilite le test des composés d’essai volatils. Enfin, en raison du nombre relativement faible de composants inclus dans la solution alimentaire, les réactions secondaires indésirables sont minimisées entre la substance d’essai et les autres composants alimentaires. La levure utilisée dans l’aliment est également inactive, ce qui limite davantage la réactivité du milieu d’alimentation. Cependant, veuillez noter que la méthode ne convient pas pour tester la toxicité pour le développement ou la toxicité larvaire.

Certains des matériaux utilisés dans le protocole peuvent être remplacés, comme l’utilisation de flacons de mouches en verre plutôt que de polypropylène. Cependant, les matériaux utilisés ont été sélectionnés pour être à la fois inertes et jetables afin d’éviter les réactions chimiques indésirables entre les réactifs et les expositions chimiques qui pourraient résulter du nettoyage de la verrerie.

L’utilisation d’aliments liquides nécessite un véhicule pour la livraison de nourriture. Le papier filtre en acétate de cellulose a été choisi à cet effet en raison de sa flexibilité et de son caractère inerte28. D’autres chercheurs ont utilisé des protocoles similaires mais avec d’autres véhicules, tels que des lingettes de travail délicates ou un filtre en fibre de verre29,30. Le papier filtre en acétate de cellulose répondait à ces besoins car il s’agit d’un véhicule inerte qui peut être coupé à la forme idéale pour l’insérer dans le fond des flacons de mouches sans grand espace entre le papier et la paroi du flacon, empêchant ainsi la mort due au fait que les mouches se coincent dans le milieu ou le véhicule lui-même.

Une limitation importante de ce système est que la concentration maximale testable d’un produit chimique est liée à la solubilité du produit chimique. Les composés non solubles dans l’eau nécessitent un solvant supplémentaire, ce qui peut entraîner des effets supplémentaires ou synergiques avec le produit chimique d’intérêt. Cela peut également créer des situations dans lesquelles il n’est pas possible de préparer des solutions mères suffisamment concentrées pour atteindre le paramètre souhaité dans tous les organismes, ce qui limite l’analyse des données résultantes31. Pour résoudre ce problème, les produits chimiques à faible solubilité dans l’eau peuvent être testés en ajoutant jusqu’à 0,5% de diméthylsulfoxyde à la solution alimentaire. D’autres solvants pourraient également être utilisés, mais des recherches supplémentaires sont nécessaires pour chaque solvant d’intérêt afin de déterminer la concentration maximale acceptable de solvant dans la solution afin de maximiser la solubilité tout en minimisant les effets du solvant sur l’organisme.

Une caractérisation approfondie de la réponse olfactive chez la drosophile a décrit comment les mouches évitent de consommer des composés toxiques40,41, ce qui réduit l’alimentation sur les milieux traités. Le test de colorant bleu aborde ce phénomène en permettant aux chercheurs de cribler efficacement les comportements alimentaires des mouches nourries à chaque concentration de produit chimique expérimental42,43,44. La présence ou l’absence de bleu dans le tractus gastro-intestinal de la mouche indique si la mouche a mangé le milieu toxique. Bien qu’il existe des méthodes plus sophistiquées d’évaluation des comportements alimentaires des mouches, telles que le compteur d’interaction liquide-alimentde mouche 45, cette méthode qualitative est mieux adaptée au criblage à débit plus élevé.

Un aspect notable de ce protocole est qu’il a été optimisé pour une période d’exposition de 48 heures sans qu’il soit nécessaire de transférer des mouches ou d’ajouter du liquide supplémentaire au flacon d’exposition. L’utilisation d’une chambre d’humidité et le placement des chambres dans un incubateur maintenu à une humidité élevée ont empêché le papier filtre contenant le fluide d’alimentation de sécher pendant cette période. Le protocole peut être adapté pour des durées d’exposition plus longues, mais la méthode doit être ajustée pour s’assurer que le papier filtre ne devient pas sec et ne provoque pas de changements importants dans la concentration de la solution ou la létalité en raison de la dessiccation.

Enfin, une caractéristique importante de ce protocole est qu’il peut facilement accueillir des variantes génétiques, ce qui permet aux chercheurs d’utiliser la vaste gamme d’outils génétiques de la drosophile pour élargir ces études préliminaires sur les organismes de type sauvage afin de mieux comprendre les mécanismes d’action chimique in vivo. À cet égard, le protocole décrit ci-dessus pourrait être facilement modifié pour compléter un protocole JoVE décrit précédemment par Peterson et Long qui permet une analyse toxicologique des mouches capturées dans la nature18.

En raison de la grande variété d’études antérieures sur la toxicité de l’arsénite de sodium chez la drosophile 32,33,34,35,36, les mouches Oregon-R ont été traitées avec ce composé pour démontrer l’efficacité de notre système. Les mouches mâles présentaient une DL 50 de 0,65 mM, et les femelles une DL50 de 0,90 mM. Cela correspond aux études antérieures sur la drosophile adulte traitée à l’arsénite de sodium. Par exemple, Goldstein et Babich37 ont constaté que 50% des mouches (sexes mixtes) mouraient après 7 jours d’exposition à 0,5 mM NaAsO2. Bien qu’il s’agisse d’une dose légèrement inférieure à celle observée actuellement, les différences entre leurs méthodes et cette méthode (y compris l’utilisation de milieux d’exposition solides, une échelle de temps plus longue et des sexes mixtes) expliquent probablement cette différence. Il est important de noter que les deux méthodes ont donné des valeurs de DL50 globalement similaires.

Les observations issues d’expériences utilisant ce protocole peuvent être utilisées pour trouver des cibles génétiques et moléculaires pour des études comportementales ou mécanistes ultérieures. La méthode d’exposition peut également être utilisée pour traiter la drosophile pour l’échantillonnage pour la métabolomique et la protéomique, ce qui rend ce protocole bien adapté au domaine croissant de la toxicologie de précision (modélisé à partir du domaine de la médecine de précision46). À cet égard, les mouches exposées peuvent être collectées après l’étape 8 pour une analyse génomique et métabolomique ultérieure. Les échantillons prélevés à l’étape 8 peuvent ensuite être traités, comme décrit par Li et Tennessen47, en commençant par l’étape 3.

En fin de compte, les données acquises à partir des expériences décrites ci-dessus, ainsi que toutes les données métabolomiques et protéomiques ultérieures, devraient idéalement être utilisées dans les comparaisons interspécifiques. Comme nous l’avons déjà mentionné26, de telles études interspécifiques sont puissantes et capables de déterminer comment les produits chimiques individuels interfèrent avec les voies biologiques conservées. Ainsi, le protocole décrit ci-dessus peut être utilisé pour trouver des points communs évolutifs en réponse à des toxiques individuels à travers les phylums et aider à éclairer la réglementation de la sécurité chimique.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions notre personnel pour son aide dans la mise à l’essai et l’optimisation de ce protocole : Ameya Belamkar, Marilyn Clark, Alexander Fitt, Emma Rose Gallant, Ethan Golditch, Matthew Lowe, Morgan Marsh, Kyle McClung, Andy Puga, Darcy Rose, Cameron Stockbridge et Noelle Zolman. Nous remercions également nos collègues du groupe de toxicologie de précision, en particulier nos homologues du groupe d’exposition, d’avoir aidé à identifier les objectifs du protocole.

Ce projet a reçu un financement du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne dans le cadre de la convention de subvention n ° 965406. Les travaux présentés dans cette publication ont été réalisés dans le cadre du Cluster ASPIS. Ce résultat ne reflète que le point de vue des auteurs, et l’Union européenne ne peut être tenue responsable de l’utilisation qui pourrait être faite des informations qui y sont contenues. Cette publication a également été rendue possible grâce au soutien de l’Indiana Clinical and Translational Sciences Institute, qui est financé en partie par le prix numéro UL1TR002529 des National Institutes of Health, du National Center for Advancing Translational Sciences, du Clinical and Translational Sciences Award. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles des National Institutes of Health. Certaines parties de ce projet ont été soutenues par des fonds de l’Université de l’Indiana attribués au JRS et au consortium PhyloTox. JMH et EMP ont été soutenus par les NIH P40OD018537 à Bloomington Drosophila Stock Center.

Materials

1.5 inch flower lever action craft punch Bira Craft HCP-115-024
15 mL Centrifuge Tubes  VWR 89039-666 High-Performance Centrifuge Tubes with Flat or Plug Caps, Polypropylene, 15 mL
2 ml Tubes  VWR 16466-044 Micro Centrifuge Tube with Flat Screw-Cap, conical bottom
5 ml Tubes  VWR  60818-576 Culture Tubes, Plastic, with Dual-Position Caps
50 mL Centrifuge Tubes  Corning  430290 50 mL polypropylene centrifuge tubes, conical bottom with plug seal cap
Benchmark Dose Software version 3.2 U.S. Environmental Protection Agency
Cardboard trays Genesee Scientific flystuff 32-122 trays and dividers for narrow vials 
CO2 gas pads Genesee Scientific flystuff 59-114 FlyStuff flypad, CO2 anesthetizing apparatus 
Combitips advanced, 50 mL Eppendorf  0030089693 Combitips advanced, Biopur, 50 mL, light gray, colorless tips
Cotton balls Genesee Scientific flystuff 51-101 Cotton balls, large, fits narrow vials 
Delicate task wipes Kimtech 34155 Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipes, 1 Ply / 8.2" x 4.39"
Drosophila Vial Plugs, Cellulose Acetate (aka, Flugs) VWR 89168-888 Wide
FD&C Blue No. 1 Spectrum Chemical FD110 CAS number 3844-45-9
Flies  BDSC Stock #2057  OregonR wildtype 
Gloves (nitrile) Kimtech 55082/55081/55083 Kimtech purple nitrile exam gloves, 5.9 mil, ambidextrous 9.5" 
Grade 1 CHR cellulose chromatography paper Cytvia 3001-917 Sheet, 46 x 57 cm
Mesh for humidity chamber
Multipette / Repeater (X) stream  Eppendorf  022460811 Repeater Xstream 
Plastic grate Plaskolite 18469 (from lowes) Plaskolite 24 in x 48 in 7.85 sq ft louvered ceiling light panels, cut down to fit in rubbermaid tubs
Plastic trays for glass vials Genesee Scientific flystuff 59-207 Narrow fly vial reload tray 
Polypropylene Drosophila Vial VWR 75813-156 Wide (28.5 mm)
Rubbermaid tubs Rubbermaid 3769017 (from Lowes) Rubbermaid Roughneck Tote 10 gallon 18" L x 12" W x 8 1/2" H
Sucrose ultra pure MP Biomedicals, Inc. 821721
Tube racks for wide-mouthed tubes Thermo scientific  5970-0230 Nalgene Unwire Test tube racks, for 30 mm tubes 
Water Purification System Millipore Milli-Q ZMQ560F01 Millipore Milli-Q Biocel Water Purifier 
Yeast extract Acros Organics 451120050 CAS number 84604-16-0
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Holsopple, J. M., Smoot, S. R., Popodi, E. M., Colbourne, J. K., Shaw, J. R., Oliver, B., Kaufman, T. C., Tennessen, J. M. Assessment of Chemical Toxicity in Adult Drosophila Melanogaster. J. Vis. Exp. (193), e65029, doi:10.3791/65029 (2023).
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