C57BL/6Jマウスにおける中枢性臍帯症候群モデルの確立

実験は、山東大学チールー医科大学の実験動物倫理福祉委員会によって承認されました(承認番号:22021)。これらは、米国国立衛生研究所(NIH Publications No. 85-23、1996年改訂)が発行した実験動物のケアと使用に関するガイドに従って実施されました。この研究で使用したすべてのマウスは、Jinan Pengyue Experimental Animal Company(中国済南)から購入した9〜10週齢の雌のC57BL / 6Jマウスでした。この研究に参加した合計9匹のマウスは、対照群、軽度群、重度群に均等に無作為に割り付けられました。受傷後7日、28日、70日後に、各群から1匹のマウスを屠殺した。 1.C6椎弓切除術と脊髄曝露 注:露光は顕微鏡下で行われました。出血は、次の2つの側面に注意を払うことで回避できます:(i)すべての血管を避ける必要があります。(ii)筋肉は、筋肉の起点と終端点で分離する必要があります。 手術器具とSCICPを準備します。注:SCICPの構造は、以前の研究11で報告されています。以前の研究との違いは、現在のプロトコルが圧迫によって脊髄損傷を達成することです。このプラットホームの2つの異なる重量(10.4 gと20.8 g)は、それぞれ5 g/mm2と10 g/mm2の圧縮を生成できます(図1)。脊髄の露出と圧迫のステップを図2に示します。 ノーズコーンを用いた吸入によりマウスにイソフルランを投与する(誘導:3%-5%、維持:1.5%-2%)。 麻酔が効いたら、マウスの首の後ろの正中線にある小さな膨らみ、つまり第2胸椎(T2)の棘突起を調べます。 この膨らみの周りの髪を剃ります。ヨードフォア溶液を3回交互に塗布し、続いて皮膚消毒剤75%エタノールを消毒します。 マウスを操作台にうつ伏せにします。目を保護するために眼軟膏を塗ります。 胸の下に厚さ3〜4mmのパッドを敷き、アーチ型の頸椎カーブを可能にし、手術中に層間スペースと遮るもののない気道の露出を容易にします。術前鎮痛剤としてブプレノルフィンを注射します(0.05-0.1 mg / kg、SQ)。 第2胸椎の棘突起を中心とする滅菌メスで1〜1.5cmの縦方向切開を行い、筋膜層を露出させます(図2A)。 T2より上の脂肪組織の一部を滅菌マイクロハサミで除去し、T2棘突起を見つけます。 両側の僧帽筋と菱形筋を正中線に沿ってC5-T2からマイクロハサミで分離します(図2B)。 マイクロハサミでC5-T2椎骨の椎弓の筋肉を分離し、滅菌マイクロリトラクターで筋肉層を横に引っ込めます(図2C)。 椎骨の表面にある多裂筋と頸椎の筋肉を切断します。 棘突起の最高点に応じてT2を見つけます。T2から吻側端に向かって棘突起を連続的にプローブし、C6を見つけます(図3)。 鉗子でC6椎弓を持ち上げ、椎弓を切り取ると、脊髄が露出します(図2D)。 2.頸髄圧迫損傷 C6-7椎間関節を椎体スタビライザーで固定し、ロックします(図2E)。 無菌ウェイトチップを露出した脊髄に向け、チップの平らな底が脊髄の背側表面と平行に配置されていることを確認します(図2F)。 袖を調整して、重りが脊髄を圧迫するようにします。体重が脊髄との相対位置を一定に保ったら、調整を停止します(図2G)。注意: 体重が脊髄に挫傷力を及ぼす場合に備えて、このプロセスを激しくしたり、速くしたりしないでください。 5分間の圧迫の後、重りと脊椎スタビライザーを取り外します。 圧迫後の脊髄の色の変化を顕微鏡で観察します(図2H)。 滅菌PBSですすぎ、吸引を使用して操作部位を洗浄します。 ポリプロピレン非吸収性縫合糸(サイズ:6-0)を使用して、筋肉と皮膚を層状に縫合します。 手術部位を消毒し、マウスが完全な意識を取り戻すまでマウスを温かいパッドの上に置き、マウスをマウスケージに戻します。 鎮痛のためにブプレノルフィン(0.05-0.1 mg / kg、SQ)を8〜12時間ごとに3日間注射します。. 3.組織学的分析 受傷後7日目、28日目、または70日目に1.25%トリブロモエタノール(0.02 mL / g体重)の腹腔内注射によりマウスを麻酔します。マウスに60 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)と20 mLの4%パラホルムアルデヒドを経心的に注入します11。 病変中心から0.5cmの脊髄をマイクロハサミで両側から切除し、長さ1cmの切片を温存する。 保存した脊髄切片を30%ショ糖に4°Cで48時間浸漬します。 OCTで組織を包埋し、クライオトームで組織を厚さ6μmにスライスし、スライドガラス上に切片を採取します。 ヘマトキシリンおよびエオシン染色6 μmの切片を1x PBSで5分間3回すすぎ、残留OCTを除去します。 切片をヘマトキシリンに90秒間浸します。切片を流水で3分間洗浄します。 切片をエオシンに4分間浸します。95%アルコールに30秒間浸して、余分なエオシンを取り除きます。 最後に、スライドをアルコール(アルコール度数95%とアルコール度数100%の2回連続)で30秒間脱水し、スライドをキシレン浴に入れて2分間清澄にします。次に、カバーガラスと樹脂ゲルで切片を密封します。 プルシアンブルーの染色フェロシアン化カリウム(10%)と塩酸(10%)の等量混合物にスライドを20分間浸します。 蒸留水で3回すすぎ、Nuclear Fast Redで5分間対比染色します。 蒸留水で3回すすぎ、続いて95%アルコールで1回、100%アルコールで2回5分間すすぎます。 キシレンで切片を3分間ずつ2回透明にした後、樹脂ゲル12で密封します。 免疫蛍光染色スライドを以下の一次抗体と37°Cで1時間インキュベートします:神経損傷後にミクログリアでアップレギュレーションされたウサギ抗イオン化カルシウム結合アダプター分子1(Iba-1)(1:500)。中枢神経系のアストロサイトに発現するマウス抗グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)(1:300)。ウサギ抗ニューロフィラメント-200(NF-200)(1:2000)は、ニューロフィラメントで発現しています。 二次抗体と室温(RT)で1時間インキュベートします:Alexa Fluor488ヤギ抗マウスおよびAlexa Fluor594ヤギ抗ウサギ(1:1,000)。 写真を撮り、さらに蛍光顕微鏡13で分析する。 4. 磁気共鳴画像法 ミニマスクを通して投与されたイソフルラン麻酔(1%-2%イソフルラン、20%-30%O2)で、損傷後7日目にマウスを麻酔します。 頸椎脊髄を矢状方向にスキャンします。MRIイメージングには、TR/TE = 2500/12 ms、視野(FOV)= 12 x 8 mm2、スライスの厚さ = 1 mm、励起回数(NEX) = 2 のマルチスライスおよびインターリーブ方式のスピンエコー(SE)シーケンスを設定します。注意: スキャン中はマウスの呼吸数を10〜15 / minに保ち、呼吸関連の画像アーティファクトを排除します14。