إنشاء نموذج متلازمة الحبل المركزي في الماوس C57BL / 6J
Summary
أدى البروتوكول الحالي الذي يحاكي متلازمة الحبل المركزي (CCS) في الفئران إلى تحسين قابلية التكرار وتقليل أضرار التشغيل لحيوانات التجارب ، وتجنب تعطيل البنية التشريحية بشكل مفرط. الاستراتيجية في هذه الدراسة مفيدة لأنها تسمح بالبحث في آليات الإصابة من خلال تحقيق نتائج متسقة.
Abstract
يمكن أن تفيد النماذج الحيوانية لمتلازمة الحبل المركزي (CCS) بشكل كبير الأبحاث قبل السريرية. يمكن أن توفر المسارات التشريحية التي يمكن تحديدها مناهج تعرض طفيفة التوغل وتقليل الإصابات الإضافية لحيوانات التجارب أثناء التشغيل ، مما يتيح الحفاظ على مورفولوجيا تشريحية متسقة ومستقرة أثناء التجارب لتقليل الاختلافات السلوكية والنسيجية بين الأفراد لتحسين قابلية استنساخ التجارب. في هذه الدراسة ، تم الكشف عن الحبل الشوكي على مستوى C6 باستخدام منصة محورية لإصابة الحبل الشوكي (SCICP) ودمجها مع تقنية طفيفة التوغل. بمساعدة مثبت العمود الفقري ، قمنا بتثبيت الفقرات وضغط الحبال الشوكية للفئران C57BL / 6J بأوزان 5 جم / مم2 و 10 جم / مم2 باستخدام SCICP للحث على درجات مختلفة من إصابة الحبل الشوكي C6. تماشيا مع الوصف السابق ل CCS ، تكشف النتائج أن الآفة في هذا النموذج تتركز في المادة الرمادية حول الحبل المركزي ، مما يتيح إجراء مزيد من البحث في CCS. أخيرا ، يتم توفير النتائج النسيجية كمرجع للقراء.
Introduction
شهدت السنوات الأخيرة ارتفاعا مستمرا في حالات إصابة الحبل الشوكي (SCI) ، مع المزيد من الإصابات لدى كبار السن من tauma1 الأقل عنفا. هذه الإصابات في كثير من الأحيان تنطوي على العمود الفقري العنقي وغالبا ما تؤدي إلى خلل وظيفي عصبي غير مكتمل2.
وفي القرن الحادي والعشرين، يعد احتجاز الكربون وتخزينه أكثر أنواع اصابات النخاع الشوكي غير المكتملة انتشارا، حيث يمثل أكثر من نصف جميع اصابات النخاع الشوكي. بالمقارنة مع اصابات النخاع الشوكي التقليدية غير المكتملة ، يتميز CCS بضعف أكثر بشكل غير متناسب في الأطراف العلوية من الأطراف السفلية3. يتميز بضعف الأطراف العلوية في الغالب مع خلل وظيفي أقل أهمية في الحواس والمثانة. يعتقد أن CCS ناتج عن نزيف وذمة في المنطقة الوسطى بعد الصدمة أو ، كما اقترح مؤخرا ، بسبب تنكس Wallerian من ضغط الحبل الشوكي في تضيق القناة الشوكية. تفتقر إدارة CCS إلى أدلة عالية المستوى لتوجيهها ، الأمر الذي يتطلب فهما شاملا للفيزيولوجيا المرضية4. ومع ذلك ، لم يتم الإبلاغ عن نماذج CCS. النماذج الحيوانية المناسبة ضرورية لفهم الفيزيولوجيا المرضية ، والتي يمكن أن توفر قاعدة بحثية للدراسات السريرية وما قبل السريرية5،6،7،8،9،10.
في هذه الدراسة ، تم إنشاء نموذج CCS في الفئران مع منصة محورية لإصابة الحبل الشوكي (SCICP) وخطة تشغيل طفيفة التوغل ، مما يسمح بمزيد من البحث في CCS وفهمه. ثبت صحة النموذج في سياق عملية البحث عن طريق التصوير النسيجي والتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) وتحليل التألق المناعي.
Protocol
Representative Results
Discussion
من بين الأنواع العديدة لإصابات الحبل الشوكي ، يعد CCS أحد أكثر أنواع الإصابات التي يمكن علاجها 3,4. نظرا لعدم وجود نماذج البحوث المختبرية ، ركزت الأبحاث على CCS من خمسينيات القرن العشرين على الدراسات السريرية وتحقيقات تشريح الجثة3،16،17. تظهر الدراسة الحالية استخدام أدوات متوافقة وإجراءات طفيفة التوغل لإنشاء نموذج CCS للفئران. من منظور تقني ، تتمتع هذه المنصة بقابلية تشغيل قوية وقابلية استنساخ جيدة. بالنظر إلى أن نتائج التجربة تثبت صحتها ، فإن تقنيتنا لإنشاء النموذج الأقرب إلى المعيار الذي حددته الدراسات السابقة ل CCS4.
استخدمت الدراسات السابقة لإصابة الضغط بشكل أساسي مقاطع تمدد الأوعية الدموية والبالونات والملقط المعاير9،10،18. علاوة على ذلك ، حدثت معظم الإصابات على مستوى الحبل الشوكي الصدري18. تم اختيار الحبل الشوكي على مستوى C6 كجزء مصاب في هذه الدراسة للتحقيق في خصائص CCS. تجدر الإشارة إلى أن معدل البقاء على قيد الحياة لنموذج CCS هو أيضا عامل أساسي في ضمان الاتساق التجريبي. تشير الدراسة الحالية إلى حدوث إصابة انضغاطية ثنائية للحبل الشوكي العنقي للفأر ، في حين أن إصابة الحبل الشوكي عالية المستوى ، وخاصة الإصابة الثنائية ، يمكن أن تكون قاتلة لحيوانات التجربة إذا كانت خطيرة للغاية. وفقا للبوهي ، من المرجح أن يؤثر الحبل الشوكي C4 / 5 على الجهاز النخاعي البصلي الهابط والخلايا العصبية الحركية المرتبطة بالجهاز التنفسي ، مما يؤدي إلى إصابة التجربة بالاكتئاب التنفسي والموت18،19،20،21،22،23. في هذه الدراسة ، الفئران ذات درجات مختلفة من الضغط على الحبل الشوكي العنقي C6 لديها خصائص إصابة متباينة بشكل كبير اقترحها الاختبارات النسيجية. على الرغم من وجود اختلافات سلوكية ونسيجية كبيرة في نموذج تثبيت الحبل الشوكي العنقي للفأر الذي أبلغ عنه Forgione ، إلا أن تعطيل عنيق ، وعمليات مفصلية ، وصفيحة ، وحتى جذور الأعصاب كانت مطلوبة من أجل تثبيت الحبل الشوكي بالمشابك المعدلة ، والتي كان لها تأثير كبير على استقرار هياكل عنق الرحم24. أفادت دراسة أخرى لإصابات عنق الرحم باستخدام العملية المستعرضة كموقع تثبيت5. على الرغم من منع العمليات المفصلية من التلف ، إلا أن انهيار الأنسجة العضلية المفرطة يمكن أن يؤدي أيضا إلى تأثير على استقرار الحبل الشوكي. في الدراسة الحالية ، تم استئصال الصفيحةالعنقية 6 فقط للحفاظ على استقرار الحبل الشوكي العنقي ، مع الحفاظ على المفاصل المفصلية المجاورة وتجنب الضرر العضلي المفرط. في الوقت نفسه ، يمنع الضغط من أعلى الحبل الشوكي تلف جذور الأعصاب.
تشير نتائج HE إلى أن منطقة تلف الحبل الشوكي العنقي للفئران في كل مجموعة كانت بشكل رئيسي في المادة الرمادية بالقرب من الحبل المركزي ، والتي تميز CCS ، مع وجود اختلافات كبيرة في نطاق الإصابة بين المجموعات المختلفة. والجدير بالذكر أن الأقسام المرضية التي عرضناها قد خففت من مظاهر الإصابة لأن العينات تم جمعها في أيام قليلة بعد الإصابة. أظهر التألق المناعي (NF-200) ضررا أقل للمسالك العصبية في منطقة المادة البيضاء من الحبل الشوكي ، مما أكد أيضا أن الضرر في CCS كان يتركز بشكل أساسي حول الحبل المركزي. تضاعفت نتيجة التألق المناعي من خلال النتائج النسيجية السابقة لعلم الأمراض. أظهرت الدراسات السابقة أن CCS يؤدي إلى وذمة بالقرب من الحبل المركزي ، مما يؤدي إلى ورم دموي ، وفي النهاية ، خلل وظيفي في الجزء الإنسي من القناة القشرية الشوكيةالجانبية 3. تم الإبلاغ عن النزف كمكون نموذجي ل CCS ولكن نادرا ما يظهر في دراسات التصوير والتشريح اللاحقة17. في هذه الدراسة ، أشارت نتائج HE في 7 أيام بعد الإصابة إلى علامات وذمة الأنسجة في جميع المجموعات. ومع ذلك ، لم يتم العثور على خلايا الدم الحمراء المتبقية في منطقة الإصابة. لذلك ، تم استخدام اللون الأزرق البروسي لفحص منطقة الإصابة بحثا عن النزف ، وتوافقت النتائج مع داء هيموسيديريوس الذي لوحظ في منطقة الإصابة لمجموعة الإصابات الشديدة بعد 7 أيام من الإصابة ، في حين أن المجموعة الخفيفة لم تفعل ذلك. أظهرت صور التصوير بالرنين المغناطيسي T2 أن كلا من الإصابات الخفيفة والشديدة لها مناطق إشارة منخفضة في المنطقة المتضررة من الإصابة في 7 أيام بعد الإصابة ، تشير إلى ترسب الخلايا الشبكية المحللة هنا. توفر هذه النتائج دليلا ظرفيا على أن التناقض بين النتائج المبلغ عنها سابقا ربما يرجع إلى أن اختبار التصوير بالرنين المغناطيسي يحتمل أن يكون أكثر حساسية من الاختبار النسيجي14 ، بالإضافة إلى شدة الإصابة ، والتي قد تؤثر أيضا على مقدار النزيف في منطقة الإصابة. كما تم التعبير عن GFAP على نطاق واسع في المنطقة المتضررة. في الوقت نفسه ، شوهد تعبير Iba-1 أيضا في المناطق السليمة ، مما يشير إلى استمرار الاستجابة الالتهابية ، بما يتفق مع نتائج التصوير بالرنين المغناطيسي ، حيث تشير حلقة من إشارة فرط الشدة حول منطقة إشارة انخفاض الكثافة في الآفة إلى وجود استجابة التهابية. في النهاية ، بناء على نتائج الدراسة الحالية ، ركزت منطقة الإصابة في النموذج على المادة الرمادية حول الحبل المركزي ، والتي تتوافق بشكل عام مع الأوصاف التي تم الإبلاغ عنها سابقا13. لسوء الحظ ، لم نقم بإجراء التصوير بالرنين المغناطيسي بشكل متكرر في كل تجربة لإظهار كيف يتغير موقع الإصابة ديناميكيا مع مرور الوقت. يمكن للباحثين في المستقبل تضمين هذا في عملهم من أجل تحقيق أفضل في CCS. أيضا ، يمكن تضمين العلامات المناعية مع علامات الخلايا العصبية مثل NeuN ، والتي تحدد المادة الرمادية في الدراسة.
في الختام ، فإن خصائص النتائج المتعلقة بعلم الأمراض والتصوير بالرنين المغناطيسي لها أوجه تشابه وثيقة مع تلك الموصوفة ل CCS في الدراسات السابقة4. ويتيح البروتوكول الحالي الذي يصمم بشكل عملي احتجاز ثاني أكسيد الكربون وتخزينه إجراء مزيد من البحوث في مجال احتجاز ثاني أكسيد الكربون وتخزينه وفهمه.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة من قبل المشروع الوطني الرئيسي للبحث والتطوير للخلايا الجذعية وأبحاث التحول (2019YFA0112100) وبرنامج الدولة الرئيسي للعلوم الطبيعية الوطنية في الصين (81930070).
Materials
| 4% fixative solution | Solarbio | P1110 | 4% |
| Anti-Neurofilament heavy polypeptide antibody | Abcam | ab8135 | Dilution ratio (1:2000) |
| Eosin Staining Solution (water soluble) | Biosharp | BL727B | |
| Ethanol | Fuyu Reagent | ||
| Fluorescent microscope | KEYENCE | BZ-X800 | |
| Frozen Slicer | Leica | ||
| GFAP (GA5) Mouse mAb | Cell Signaling TECHNOLOGY | #3670 | Dilution ratio (1:600) |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFisher SCIENTIFIC | A32723TR | Dilution ratio (1:1000) |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 594 | ThermoFisher SCIENTIFIC | A32740 | Dilution ratio (1:1000) |
| Hematoxylin Staining Solution | Biosharp | BL702A | |
| Mice | Jinan Pengyue Experimental AnimalCompany | C57BL/6J | |
| Microsurgery apparatus | Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd | All the surgey instruments are custom-made | Ophthalmic scissors, micro mosquito forceps, microsurgery forceps, micro scissors |
| Normal sheep serum for blocking (working solution) | Zhong Shan Jin Qiao | ZLI-9022 | working solution |
| O.C.T. Compound | SAKURA | 4583 | |
| Phosphate buffered solution (PBS) | Solarbio | P1020 | pH 7.2–7.4 |
| Prussian Blue Iron Stain Kit (With Eosin) | Solarbio | G1424 | |
| RWD Laboratory inhalation anesthetic station | RWD Life Science Co., Ltd | R550 | |
| Small animal in vivo microCT imaging system | PerkinElmer | Quantum GX2 | |
| Spinal cord injury coaxial platform | Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd | Custom-made(Feng's standard) | https://shop43957633.m.youzan.com/wscgoods/detail/367x5ovgn69q18g?banner_id=f.81386274~goods.7~ 1~b0yRFKOq&alg_id= 0&slg=tagGoodList-default%2COpBottom%2Cuuid% 2CabTraceId&components_ style_layout =1&reft=1659409105184&spm= g.930111970_f.81386274&alias= 367x5ovgn69q18g&from_uuid= 1362cc46-ffe0-6886-2c65-01903 dbacbba&sf=qq_sm&is_share= 1&shopAutoEnter=1&share_cmpt =native_wechat&is_silence_auth=1 |
| Surgery microscope | Zumax Medical Co., Ltd. | zumax, OMS2355 | |
| Tris Buffered Saline+Tween (TBST) | Solarbio | T1082 | Dilution ratio (1:19) |
| Xylene | Fuyu Reagent |
References
- Liu, C., et al. Survival in 222 Patients With Severe CSCI: An 8-Year Epidemiologic Survey in Western China. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 100 (10), 1872-1880 (2019).
- Qi, C., Xia, H., Miao, D., Wang, X., Li, Z. The influence of timing of surgery in the outcome of spinal cord injury without radiographic abnormality (SCIWORA). Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 15 (1), 223 (2020).
- Brooks, N. P. Central cord syndrome. Neurosurgery Clinics of North America. 28 (1), 41-47 (2017).
- Avila, M. J., Hurlbert, R. J. Central cord syndrome redefined. Neurosurgery Clinics of North America. 32 (3), 353-363 (2021).
- Forgione, N., Chamankhah, M., Fehlings, M. G. A mouse model of bilateral cervical contusion-compression spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 34 (6), 1227-1239 (2017).
- López-Dolado, E., Lucas-Osma, A. M., Collazos-Castro, J. E. Dynamic motor compensations with permanent, focal loss of forelimb force after cervical spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 30 (3), 191-210 (2013).
- Allen, L. L., et al. Phrenic motor neuron survival below cervical spinal cord hemisection. Experimental Neurology. 346, 113832 (2021).
- Reinhardt, D. R., Stehlik, K. E., Satkunendrarajah, K., Kroner, A. Bilateral cervical contusion spinal cord injury: A mouse model to evaluate sensorimotor function. Experimental Neurology. 331, 113381 (2020).
- Ropper, A. E., Ropper, A. H. Acute spinal cord compression. The New England Journal of Medicine. 376 (14), 1358-1369 (2017).
- Sun, G. D., et al. A progressive compression model of thoracic spinal cord injury in mice: function assessment and pathological changes in spinal cord. Neural Regeneration Research. 12 (8), 1365-1374 (2017).
- Elzat, E. Y., et al. Establishing a mouse contusion spinal cord injury model based on a minimally invasive technique. Journal of Visualized Experiments. (187), 64538 (2022).
- Lu, J., Xu, F., Lu, H. LncRNA PVT1 regulates ferroptosis through miR-214-mediated TFR1 and p53. Life Sciences. 260, 118305 (2020).
- Zeng, H., et al. Lentivirus-mediated downregulation of α-synuclein reduces neuroinflammation and promotes functional recovery in rats with spinal cord injury. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 283 (2019).
- Bilgen, M., Al-Hafez, B., Berman, N. E., Festoff, B. W. Magnetic resonance imaging of mouse spinal cord. Magnetic Resonance in Medicine. 54 (5), 1226-1231 (2005).
- Yilihamu, E. E., et al. A novel mouse model of central cord syndrome. Neural Regeneration Research. 18 (12), 2751-2756 (2023).
- Chikuda, H., et al. Effect of early vs delayed surgical treatment on motor recovery in incomplete cervical spinal cord injury with preexisting cervical stenosis: A randomized clinical trial. JAMA Network Open. 4 (11), e2133604 (2021).
- Jimenez, O., Marcillo, A., Levi, A. D. A histopathological analysis of the human cervical spinal cord in patients with acute traumatic central cord syndrome. Spinal Cord. 38 (9), 532-537 (2000).
- Menezes, K., et al. Human mesenchymal stromal/stem cells recruit resident pericytes and induce blood vessels maturation to repair experimental spinal cord injury in rats. Scientific Reports. 10 (1), 19604 (2020).
- Hutson, T. H., Di Giovanni, S. The translational landscape in spinal cord injury: focus on neuroplasticity and regeneration. Nature Reviews. Neurology. 15 (12), 732-745 (2019).
- El-Bohy, A. A., Schrimsher, G. W., Reier, P. J., Goshgarian, H. G. Quantitative assessment of respiratory function following contusion injury of the cervical spinal cord. Experimental Neurology. 150 (1), 143-152 (1998).
- El-Bohy, A. A., Goshgarian, H. G. The use of single phrenic axon recordings to assess diaphragm recovery after cervical spinal cord injury. Experimental Neurology. 156 (1), 172-179 (1999).
- Gonzalez-Rothi, E. J., Lee, K. Z. Intermittent hypoxia and respiratory recovery in preclinical rodent models of incomplete cervical spinal cord injury. Experimental Neurology. 342, 113751 (2021).
- Locke, K. C., Randelman, M. L., Hoh, D. J., Zholudeva, L. V., Lane, M. A. Respiratory plasticity following spinal cord injury: perspectives from mouse to man. Neural Regeneration Research. 17 (10), 2141-2148 (2022).
- Forgione, N., et al. Bilateral contusion-compression model of incomplete traumatic cervical spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 31 (21), 1776-1788 (2014).
