יצירת פלסמודיום מהונדס גנטית ברגהיי ספורוזואיטים
Summary
מלריה מועברת באמצעות חיסון של שלב sporozoite של פלסמודיום על ידי יתושים נגועים. פלסמודיום מהונדס איפשר לנו להבין טוב יותר את הביולוגיה של המלריה ותרם ישירות למאמצי פיתוח החיסון למלריה. כאן, אנו מתארים מתודולוגיה יעילה ליצירת פלסמודיום ברגהיי sporozoites מהונדס.
Abstract
מלריה היא מחלה קטלנית הנגרמת על ידי הטפיל פלסמודיום ומועברת באמצעות עקיצה של יתושי אנופלס נקביים. שלב הספורוזואיטים של פלסמודיום המושקע על ידי יתושים בעורם של פונדקאים בעלי חוליות עובר שלב של התפתחות חובה בכבד לפני תחילת המלריה הקלינית. אנו יודעים מעט מאוד על הביולוגיה של התפתחות פלסמודיום בכבד; הגישה לשלב הספורוזואיטים והיכולת לשנות גנטית ספורוזואיטים כאלה הם כלים קריטיים לחקר טבעו של זיהום פלסמודיום והתגובה החיסונית הנובעת מכך בכבד. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מקיף ליצירת פלסמודיום ברגהיי sporozoites מהונדס. אנו משנים גנטית את שלב הדם P. berghei ומשתמשים בצורה זו כדי להדביק יתושי אנופלס כאשר הם לוקחים ארוחת דם. לאחר שהטפילים הטרנסגניים עוברים התפתחות אצל היתושים, אנו מבודדים את שלב הספורוזואיטים של הטפיל מבלוטות הרוק של היתושים לצורך ניסויים in vivo ו-in vitro . אנו מדגימים את תקפות הפרוטוקול על ידי יצירת ספורוזואיטים של זן חדש של P. berghei המבטא את תת-היחידה 11 של החלבון הפלואורסצנטי הירוק (GFP) (GFP11), ומראים כיצד ניתן להשתמש בו כדי לחקור את הביולוגיה של מלריה בשלב הכבד.
Introduction
למרות ההתקדמות בפיתוח תרופות ובמחקר למניעה וטיפול במלריה, נטל התחלואה העולמי של המלריה נותר גבוה. יותר מחצי מיליון בני אדם מתים ממלריה מדי שנה, כאשר רמות התמותה הגבוהות ביותר נצפו בקרב ילדים החיים באזורים אנדמיים למלריה, כגון אפריקה שמדרום לסהרה1. מלריה נגרמת על ידי הטפיל פלסמודיום, המועבר לבני אדם באמצעות עקיצה של יתושי אנופלס נקביים הנושאים את הטפיל בבלוטות הרוק שלהם. השלב הזיהומי של פלסמודיום – הספורוזואיטים – מופקדים בעורם של המארחים בעלי החוליות במהלך ארוחת דם ונוסעים דרך זרם הדם כדי להדביק תאי כבד, שם הם עוברים התפתחות חובה (המהווה מלריה טרום אריתרוציטים) לפני הדבקת אריתרוציטים. זיהום של אריתרוציטים מתחיל את שלב הדם של מלריה והוא אחראי על כל התחלואה והתמותה הקשורים למחלה 2,3.
אופיו המחייב של הפיתוח הפרה-אריתרוציטי של פלסמודיום הפך אותו למטרה אטרקטיבית למאמצי חיסון מניעתי ופיתוח תרופות4. תנאי מוקדם לחקר הביולוגיה של מלריה טרום אריתרוציטית, כמו גם לפיתוח חיסונים או תרופות המכוונות לשלב הכבד, הוא גישה לספורוזואיטים פלסמודיום. יתר על כן, היכולת שלנו לייצר פלסמודיום sporozoites מהונדס גנטית כבר חיוני להצלחה של מאמצי מחקר כאלה 5,6,7,8,9. קווי פלסמודיום טרנסגניים המבטאים חלבוני כתב פלואורסצנטיים או זוהרים אפשרו לנו לעקוב אחר התפתחותם in vivo ו– in vitro10,11. טפילים מוחלשים גנטית (GAPs), הנוצרים באמצעות מחיקה של גנים מרובים בפלסמודיום, הם גם חלק מהמועמדים המבטיחים ביותר לחיסון12,13.
מודלים של מכרסמים ומלריה של פרימטים שאינם אנושיים סייעו לנו להבין את המנגנונים של אינטראקציות פונדקאי-טפיל במלריה אנושית בשל הדמיון בביולוגיה ובמחזור החיים בין מיני פלסמודיום 14. השימוש בזני פלסמודיום המדביקים מכרסמים, אך לא בני אדם (למשל, P. berghei) מאפשר שמירה על מחזור החיים המלא של הטפיל ויצירת ספורוזואיטים זיהומיים לחקר מלריה בשלב הכבד בסביבה מבוקרת של בטיחות ביולוגית ברמה 1. מגוון פרוטוקולים נפרדים כבר קיימים ליצירת טפילי פלסמודיום בשלב הדם המהונדס 15, זיהום יתושים16 ובידוד ספורוזואיטים17. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מקיף המשלב מתודולוגיות אלה על מנת ליצור ולבודד sporozoites P. berghei טרנסגני, תוך שימוש בזן המהונדס החדש PbGFP11 כדוגמה. PbGFP 11 מעביר את הגדיל β ה-11 של חלבון פלואורסצנטי ירוק סופר-תיקייה (GFP), GFP11, לתוך הוואקול הטראיטופורי (PV) שנוצר בהפטוציטים המארחים. PbGFP 11 משמש בשילוב עם הפטוציטים טרנסגניים (רקע Hepa1-6) המבטאים שאריות המהוות את מקטע GFP 1-10 (GFP 1-10) בציטופלסמה (תאי Hepa GFP 1-10). PbGFP11 מדווח על ליזה PV בהפטוציטים המארחים באמצעות השלמה עצמית ורפורמה של GFP פונקציונלי ואות פלואורסצנטי ירוק18. יש לציין כי GFP 11 מקודד כסדרה של שבעה רצפי טנדם ב-PbGFP11 כדי לשפר את האות הפלואורסצנטי המתקבל. לאחר צביעת PbGFP11 sporozoites עם צבע cytoplasmic CellTrace Violet (CTV), אנו יכולים לעקוב אחר הטפילים. הליזה של טפילים תוך-תאיים כאלה המוכתמים ב-CTV גורמת בעצמה לדליפה של CTV לתוך הציטופלסמה של התא המארח ולהכתמה של התא המארח. בנוסף להדמיה ולהבחנה של הליזה של פלסמודיום PV ו / או הטפיל בהפטוציטים המארחים, מערכת זו יכולה לשמש באופן אמין לחקר המסלולים החיסוניים האחראים לכל אחד מהתהליכים הללו, באמצעות הפרעה גנטית או טיפולית של המרכיבים המולקולריים של מסלולים כאלה.
Protocol
Representative Results
Discussion
השתמשנו בפרוטוקול הנ”ל במעבדה שלנו כדי ליצור מספר שורות של טפילי P. berghei טרנסגניים. למרות אופטימיזציה עבור P. berghei, השתמשנו בהצלחה פרוטוקול זה כדי ליצור P. yoelii sporozoites טרנסגני. לאחר הזרקת סכיזונטים נגועים לעכברים, טפילים ניתנים לגילוי בדרך כלל לא יאוחר מ 3 d.p.i. בכל הקבוצות, כולל בקר…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי AI168307 המענק של המכונים הלאומיים לבריאות ל- SPK. אנו מודים לליבת הציטומטריה של זרימה UGA CTEGD ולליבת המיקרוסקופ UGA CTEGD. אנו מכירים גם בתרומתם של אש פאטאק, אן אליוט והצוות של UGA Sporocore באופטימיזציה של הפרוטוקול. אנו רוצים להודות לד”ר דאיצ’י קאמיאמה על תובנות חשובות, דיון, ופלסמידים האב המכילים GFP11 ו- GFP 1-10. ברצוננו להודות גם לחברי מעבדת קורופ על התמיכה, הסבלנות והעידוד הבלתי פוסקים.
Materials
| 30 G x 1/2" Syringe needle | Exel international | 26437 | |
| Alsever's solution | Sigma-Aldritch | A3551-500ML | |
| Amaxa Basic Parasite Nucleofector Kit 2 | Lonza | VMI-1021 | |
| Avertin (2,2,2-Tribromoethanol) | TCI America | T1420 | |
| Blood collection tubes | BD bioscience | 365967 | for serum collection |
| C-Chip disposable hematocytometer | INCYTO | DHC-N01-5 | |
| CellVeiw Cell Culture Dish | Greiner Bio-One | 627860 | |
| Centrifuge 5425 | Eppendorf | 5405000107 | |
| Centrifuge 5910R | Eppendorf | 5910R | For gradient centrifugation |
| Delta Vision II – Inverted microscope system | Olympus | IX-71 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D5879-500ml | |
| Fetal bovine serum | GenClone | 25-525 | |
| GFP11 plasmid | Kurup Lab | pSKspGFP11 | Generated from PL0017 plasmid |
| Giemsa Stain | Sigma-Aldritch | 48900-1L-F | |
| Hepa GFP1-10 cells | Kurup Lab | Hepa GFP1-10 | Generated from Hepa 1-6 cells (ATCC Cat# CRL-1830) |
| Mouse Serum | Used for mosquito dissection media | ||
| NaCl | Millipore-Sigma | SX0420-5 | 1.5 M and 0.15 M for percoll solution |
| Nucleofector II | Amaxa Biosystems (Lonza) | Program U-033 used for RBC electroporation | |
| Pasteur pipette | VWR | 14673-043 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldritch | P0781-100ML | |
| Percoll (Density gradient stock medium) | Cytivia | 17-0891-02 | Details in protocol |
| PL0017 Plasmid | BEI Resources | MRA-786 | |
| Pyrimethamine (for oral administration) | Sigma | 46706 | Preparation details: Add 17.5 mg Pyrimethamine to 2.5 mL of DMSO. Vortex, if needed to dissolve completely; Adjust pH of 225 mL of dH2O to 4 using HCL. Add Pyrimethamine in DMSO to water and bring to 250 mL. Add 10 g of sugar to encourage regular consumption of drugged water. Pyrimethamine is light sensitive. Use dark bottle or aluminum foil covered bottle when treating mice. |
| RPMI 1640 | Corning | 15-040-CV | |
| SoftWoRx microscopy software | Applied Precision | v6.1.3 |
References
- WHO. Geneva. World Health Organization. , 1 (2020).
- Cowman, A. F., Healer, J., Marapana, D., Marsh, K. Malaria: biology and disease. Cell. 167 (3), 610-624 (2016).
- Crompton, P. D., et al. Malaria immunity in man and mosquito: insights into unsolved mysteries of a deadly infectious disease. Annual Review of Immunology. 32, 157-187 (2014).
- Marques-da-Silva, C., Peissig, K., Kurup, S. P. Pre-erythrocytic vaccines against malaria. Vaccines. 8 (3), 400 (2020).
- Balu, B., Adams, J. H. Advancements in transfection technologies for Plasmodium. International Journal for Parasitology. 37 (1), 1-10 (2007).
- Rodriguez, A., Tarleton, R. L. Transgenic parasites accelerate drug discovery. Trends in Parasitology. 28 (3), 90-92 (2012).
- Voorberg-vander Wel, A. M., et al. A dual fluorescent Plasmodium cynomolgi reporter line reveals in vitro malaria hypnozoite reactivation. Communications Biology. 3, 7 (2020).
- Christian, D. A., et al. Use of transgenic parasites and host reporters to dissect events that promote interleukin-12 production during toxoplasmosis. Infection and Immunity. 82 (10), 4056-4067 (2014).
- Montagna, G. N., et al. Antigen export during liver infection of the malaria parasite augments protective immunity. mBio. 5 (4), e01321 (2014).
- Amino, R., Menard, R., Frischknecht, F. In vivo imaging of malaria parasites-recent advances and future directions. Current Opinion in Microbiology. 8 (4), 407-414 (2005).
- Siciliano, G., Alano, P. Enlightening the malaria parasite life cycle: bioluminescent Plasmodium in fundamental and applied research. Frontiers in Microbiology. 6, 391 (2015).
- Othman, A. S., et al. The use of transgenic parasites in malaria vaccine research. Expert Review of Vaccines. 16 (7), 1-13 (2017).
- Kreutzfeld, O., Muller, K., Matuschewski, K. Engineering of genetically arrested parasites (GAPs) for a precision malaria vaccine. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 198 (2017).
- Otto, T. D., et al. A comprehensive evaluation of rodent malaria parasite genomes and gene expression. BMC Biology. 12, 86 (2014).
- Janse, C. J., Ramesar, J., Waters, A. P. High-efficiency transfection and drug selection of genetically transformed blood stages of the rodent malaria parasite Plasmodium berghei. Nature Protocols. 1 (1), 346-356 (2006).
- Tripathi, A. K., Mlambo, G., Kanatani, S., Sinnis, P., Dimopoulos, G. Plasmodium falciparum gametocyte culture and mosquito infection through artificial membrane feeding. Journal of Visualized Experiments. (161), e61426 (2020).
- Pacheco, N. D., Strome, C. P., Mitchell, F., Bawden, M. P., Beaudoin, R. L. Rapid, large-scale isolation of Plasmodium berghei sporozoites from infected mosquitoes. The Journal of Parasitology. 65 (3), 414-417 (1979).
- Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nature Communications. 7, 11046 (2016).
- Bailey, J. W., et al. Guideline: the laboratory diagnosis of malaria. General Haematology Task Force of the British Committee for Standards in Haematology. British Journal of Haematology. 163 (5), 573-580 (2013).
- Das, D., et al. A systematic literature review of microscopy methods reported in malaria clinical trials. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 104 (3), 836-841 (2020).
- de Oca, M. M., Engwerda, C., Haque, A. Plasmodium berghei ANKA (PbA) infection of C57BL/6J mice: a model of severe malaria. Methods in Molecular Biology. 1031, 203-213 (2013).
- Musiime, A. K., et al. Is that a real oocyst? Insectary establishment and identification of Plasmodium falciparum oocysts in midguts of Anopheles mosquitoes fed on infected human blood in Tororo, Uganda. Malaria Journal. 18 (1), 287 (2019).
- Marques-da-Silva, C., et al. Direct type I interferon signaling in hepatocytes controls malaria. Cell Reports. 40 (3), 111098 (2022).
- Bowers, C., et al. Cryopreservation of Plasmodium sporozoites. Pathogens. 11 (12), 1487 (2022).
- Zander, R. A., et al. Th1-like plasmodium-specific memory CD4+ T cells support humoral immunity. Cell Reports. 21 (7), 1839-1852 (2017).
