JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
신경과학

Гипоталамические кисспептиновые нейроны как мишень для записи цельноклеточных пластырей

Published: March 17, 2023
doi:
10.3791/64989
, , ,
1Department of Anatomy, Instituto de Ciencias Biomedicas,Universidade de Sao Paulo

Summary

Здесь мы представляем протокол для выполнения цельноклеточного пластыря на срезах мозга, содержащих нейроны кисспептина, первичный модулятор клеток гонадотропин-рилизинг-гормона (ГнРГ). Добавляя знания об активности кисспептиновых нейронов, этот электрофизиологический инструмент послужил основой для значительных достижений в области нейроэндокринологии за последние 20 лет.

Abstract

Кисспептины необходимы для созревания оси гипоталамо-гипофиз-гонад (HPG) и фертильности. Нейроны гипоталамического кисспептина, расположенные в передневентральном перивентрикулярном ядре и ростральном перивентрикулярном ядре, а также дугообразное ядро гипоталамуса, проецируются на нейроны гонадотропин-рилизинг-гормона (ГнРГ) и другие клетки. Предыдущие исследования показали, что передача сигналов кисспептина происходит через рецептор Kiss1 (Kiss1r), в конечном итоге возбуждая активность нейронов ГнРГ. У людей и экспериментальных животных кисспептины достаточны для индукции секреции ГнРГ и, следовательно, высвобождения лютеинизирующего гормона (ЛГ) и гормона-стимулятора фолликулов (ФСГ). Поскольку кисспептины играют важную роль в репродуктивных функциях, исследователи работают над тем, чтобы оценить, как внутренняя активность нейронов гипоталамуса кисспептина способствует действиям, связанным с размножением, и определить первичные нейротрансмиттеры / нейромодуляторы, способные изменять эти свойства. Метод цельноклеточного пластыря стал ценным инструментом для исследования активности нейронов кисспептина в клетках грызунов. Этот экспериментальный метод позволяет исследователям регистрировать и измерять спонтанные возбуждающие и тормозные ионные токи, мембранный потенциал покоя, возбуждение потенциала действия и другие электрофизиологические свойства клеточных мембран. В настоящем исследовании рассматриваются важнейшие аспекты метода цельноклеточного пластыря, известные как электрофизиологические измерения, определяющие гипоталамические кисспептиновые нейроны, и обсуждение соответствующих вопросов о методе.

Introduction

Ходжкин и Хаксли сделали первую внутриклеточную запись потенциала действия, описанного в нескольких научных исследованиях. Эта запись была выполнена на аксоне кальмара, который имеет большой диаметр (~ 500 мкм), что позволяет поместить микроэлектрод внутрь аксона. Эта работа предоставила большие возможности для научных исследований, которые впоследствии завершились созданием режима напряжения-зажима, который был использован для изучения ионной основы генерации потенциала действия 1,2,3,4,5,6,7,8. С годами методика совершенствовалась, и она стала широко применяться в научныхисследованиях6,9. Изобретение метода патч-зажима, которое произошло в конце 1970-х годов благодаря исследованиям, инициированным Эрвином Неером и Бертом Сакманном, позволило исследователям регистрировать одиночные ионные каналы и внутриклеточные мембранные потенциалы или токи практически в каждом типе клеток, используя только один электрод 9,10,11,12. Запись с помощью патч-зажима может быть выполнена на различных тканевых препаратах, таких как культивируемые клетки или срезы тканей, либо в режиме зажима напряжения (удерживая клеточную мембрану при заданном напряжении, позволяющем записывать, например, зависимые от напряжения токи и синаптические токи), либо в режиме токового зажима (позволяя регистрировать, например, изменения мембранного потенциала покоя, индуцированные ионными токами, потенциалы действия и частота постсинаптических потенциалов).

Использование техники патч-зажима сделало возможным несколько заметных открытий. Действительно, основополагающие данные об электрофизиологических свойствах нейронов кисспептина гипоталамуса, расположенных в передневентральных перивентрикулярных и ростральных перивентрикулярных ядрах (AVPV / PeNKisspeptin), также известных как ростральная перивентрикулярная область третьего желудочка (RP3V), и дугообразное ядро гипоталамуса (АРГкисспептин)13,14,15 представляют особый интерес. В 2010 году Ducret et al. выполнили первые записи нейронов AVPV / PeNKisspeptinу мышей, используя другой электрофизиологический инструмент, метод зажима свободных клеток. Эти исследования предоставили электрическое описание нейроновкисспептина AVPV / PeN и продемонстрировали, что их паттерны возбуждения зависят от эстрального цикла16. В 2011 году Qiu et al. использовали технику зажима всей клетки, чтобы продемонстрировать, что нейроныАРГ кисспептина экспрессируют эндогенные токи кардиостимулятора17. Впоследствии Gottsch et al. показали, что кисспептиновые нейроны проявляют спонтанную активность и экспрессируют кальциевые токи как h-типа (кардиостимулятор), так и T-типа, предполагая, что нейроныАРГ кисспептина разделяют электрофизиологические свойства с другими нейронами кардиостимулятора центральной нервной системы18. Кроме того, было продемонстрировано, что нейроныАРГ кисспептина демонстрируют половую диморфную скорость возбуждения и что нейроны AVPV / PeNKisspeptin проявляют бимодальный мембранный потенциал покоя (RMP), на который влияют чувствительные к АТФ калиевые каналы (KATP)19,20. Кроме того, было установлено, что гонадные стероиды положительно влияют на спонтанную электрическую активность нейронов кисспептина у мышей 19,20,21. Упоминаются первые работы, изучающие электрофизиологические свойства кисспептиновых нейронов 16,17,18,19,20. С тех пор во многих исследованиях использовался метод цельноклеточного пластыря, чтобы продемонстрировать, какие факторы/нейромодуляторы достаточны для модуляции электрической активности нейронов кисспептина (рис. 1)17,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32.

Учитывая важность этого метода для изучения нейронов, необходимых для размножения, среди других типов клеток, не рассмотренных здесь, в этой статье описываются основные этапы разработки метода патч-зажима целых клеток, такие как приготовление растворов, рассечение и разрезание мозга, а также выполнение уплотнения клеточной мембраны для записей. Кроме того, обсуждаются соответствующие вопросы о методе, такие как его преимущества, технические ограничения и важные переменные, которые необходимо контролировать для оптимальной экспериментальной работы.

Protocol

Все процедуры на животных были одобрены Комитетом по этике животных Института биомедицинских наук при Университете Сан-Паулу и выполнялись в соответствии с этическими принципами, принятыми Бразильским колледжем экспериментов на животных. 1. Приготовление растворов…

Representative Results

Для изучения возможного влияния человеческого рекомбинантного гормона роста (hGH) на активность гипоталамических кисспептиновых нейронов мы провели запись цельноклеточного пластыря в срезах мозга и оценили, вызывает ли этот гормон острые изменения активности нейронов AVPV/PeN Kisspeptin и ARH<s…

Discussion

Развитие метода цельноклеточного пластыря оказало значительное влияние на научное сообщество, считаясь чрезвычайно важным для развития научных исследований и создания нескольких открытий. Его влияния на науку было достаточно, чтобы кульминацией стала Нобелевская премия по медицине…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование было поддержано Исследовательским фондом Сан-Паулу [номера грантов FAPESP: 2021/11551-4 (JNS), 2015/20198-5 (TTZ), 2019/21707/1 (RF); и Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) – Финансовый кодекс 001» (HRV).

Materials

Compounds for aCSF, internal and slicing solutions
ATP Sigma Aldrich/various A9187
CaCl2 Sigma Aldrich/various C7902
D-(+)-Glucose Sigma Aldrich/various G7021
EGTA Sigma Aldrich/various O3777
HEPES Sigma Aldrich/various H3375
KCL Sigma Aldrich/various P5405
K-gluconate Sigma Aldrich/various G4500
KOH Sigma Aldrich/various P5958
MgCl2 Sigma Aldrich/various M9272
MgSO4 Sigma Aldrich/various 230391
NaCl Sigma Aldrich/various S5886
NaH2PO4  Sigma Aldrich/various S5011
NaHCO3 Sigma Aldrich/various S5761
nitric acid Sigma Aldrich/various 225711 CAUTION
Sucrose Sigma Aldrich/various S1888
Equipments
Air table TMC 63-534
Amplifier Molecular Devices Multiclamp 700B
Computer various –
DIGIDATA 1440 LOW-NOISE DATA ACQUISITION SYSTEM Molecular Devices DD1440
Digital peristaltic pump Ismatec ISM833C 
Faraday cage TMC 81-333-03
Imaging Camera Leica DFC 365 FX
Micromanipulator Sutter Instruments Roe-200
Micropipette Puller Narishige PC-10
Microscope Leica DM6000 FS
Osteotome Bonther equipamentos & Tecnologia/various 128
Recovery chamber Warner Instruments/Harvard apparatus – can be made in-house
Recording chamber Warner Instruments 640277
Spatula Fisher Scientific /various FISH-14-375-10; FISH-21-401-20
Vibratome  Leica VT1000 S
Water Bath  Fisher Scientific /various Isotemp
Software and systems
AxoScope 10 software Molecular Devices – Commander Software
LAS X wide field system Leica – Image acquisition and analysis
MultiClamp 700B Molecular Devices MULTICLAMP 700B Commander Software
PCLAMP 10 SOFTWARE FOR WINDOWS Molecular Devices Pclamp 10 Standard
Tools
Ag/AgCl electrode, pellet, 1.0 mm Warner Instruments 64-1309
Curved hemostatic forcep various –
cyanoacrylate glue LOCTITE/various –
Decapitation scissors various –
Filter paper various –
Glass capillaries (micropipette) World Precision Instruments, Inc TW150F-4
Iris scissors Bonther equipamentos & Tecnologia/various 65-66
Pasteur glass pipette  Sigma Aldrich/various CLS7095B9-1000EA
Petri dish various –
Polyethylene tubing  Warner Instruments 64-0756
Razor blade for brain dissection TED PELLA TEDP-121-1
Razor blade for the vibratome TED PELLA TEDP-121-9
Scissors Bonther equipamentos & Tecnologia/various 71-72, 48,49; 
silicone teat various –
Slice Anchor  Warner Instruments 64-0246
Syringe filters Merck Millipore Ltda SLGVR13SL Millex-GV 0.22 μm
Tweezers Bonther equipamentos & Tecnologia/various 131, 1518
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bezanilla, F. Single sodium channels from the squid giant axon. Biophysical Journal. 52 (6), 1087-1090 (1987).
  2. Clay, J. R. Potassium current in the squid giant axon. International Review of Neurobiology. 27, 363-384 (1985).
  3. Gandini, M. A., Sandoval, A., Felix, R. Patch-clamp recording of voltage-sensitive Ca2+ channels. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (4), 329-325 (2014).
  4. Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).
  5. Perkins, K. L. Cell-attached voltage-clamp and current-clamp recording and stimulation techniques in brain slices. Journal of Neuroscience Methods. 154 (1-2), 1-18 (2006).
  6. Suk, H. J., Boyden, E. S., van Welie, I. Advances in the automation of whole-cell patch clamp technology. Journal of Neuroscience Methods. 326, 108357 (2019).
  7. Cole, K. S., Curtis, H. J. Electric impedance of the squid giant axon during activity. The Journal of General Physiology. 22 (5), 649-670 (1939).
  8. Bernstein, J. Ueber den zeitlichen Verlauf der negativen Schwankung des Nervenstroms. Pflüger, Archiv für die Gesammte Physiologie des Menschen und der Thiere. 1 (1), 173-207 (1868).
  9. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Archiv. 391 (2), 85-100 (1981).
  10. Hill, C. L., Stephens, G. J. An introduction to patch clamp recording. Methods in Molecular Biology. 2188, 1-19 (2021).
  11. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
  12. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review of Physiology. 46, 455-472 (1984).
  13. Gottsch, M. L., et al. A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion in the mouse. Endocrinology. 145 (9), 4073-4077 (2004).
  14. Smith, J. T., Cunningham, M. J., Rissman, E. F., Clifton, D. K., Steiner, R. A. Regulation of Kiss1 gene expression in the brain of the female mouse. Endocrinology. 146 (9), 3686-3692 (2005).
  15. Smith, J. T., et al. Differential regulation of KiSS-1 mRNA expression by sex steroids in the brain of the male mouse. Endocrinology. 146 (7), 2976-2984 (2005).
  16. Ducret, E., Gaidamaka, G., Herbison, A. E. Electrical and morphological characteristics of anteroventral periventricular nucleus kisspeptin and other neurons in the female mouse. Endocrinology. 151 (5), 2223-2232 (2010).
  17. Qiu, J., Fang, Y., Bosch, M. A., Rønnekleiv, O. K., Kelly, M. J. Guinea pig kisspeptin neurons are depolarized by leptin via activation of TRPC channels. Endocrinology. 152 (4), 1503-1514 (2011).
  18. Gottsch, M. L., et al. Molecular properties of Kiss1 neurons in the arcuate nucleus of the mouse. Endocrinology. 152 (11), 4298-4309 (2011).
  19. de Croft, S., et al. Spontaneous kisspeptin neuron firing in the adult mouse reveals marked sex and brain region differences but no support for a direct role in negative feedback. Endocrinology. 153 (11), 5384-5393 (2012).
  20. Frazão, R., et al. Shift in Kiss1 cell activity requires estrogen receptor alpha. The Journal of Neuroscience. 33 (7), 2807-2820 (2013).
  21. DeFazio, R. A., Elias, C. F., Moenter, S. M. GABAergic transmission to kisspeptin neurons is differentially regulated by time of day and estradiol in female mice. The Journal of Neuroscience. 34 (49), 16296-16308 (2014).
  22. Mansano, N. D. S., et al. Vasoactive intestinal peptide exerts an excitatory effect on hypothalamic kisspeptin neurons during estrogen negative feedback. Molecular and Cellular Endocrinology. 542, 111532 (2022).
  23. Jamieson, B. B., Piet, R. Kisspeptin neuron electrophysiology: Intrinsic properties, hormonal modulation, and regulation of homeostatic circuits. Frontiers in Neuroendocrinology. 66, 101006 (2022).
  24. Silveira, M. A., et al. STAT5 signaling in kisspeptin cells regulates the timing of puberty. Molecular and Cellular Endocrinology. 448, 55-65 (2017).
  25. Silveira, M. A., et al. Acute effects of somatomammotropin hormones on neuronal components of the hypothalamic-pituitary-gonadal axis. Brain Research. 1714, 210-217 (2019).
  26. Cravo, R. M., et al. Leptin signaling in Kiss1 neurons arises after pubertal development. PLoS One. 8 (3), e58698 (2013).
  27. Manfredi-Lozano, M., et al. Defining a novel leptin-melanocortin-kisspeptin pathway involved in the metabolic control of puberty. Molecular Metabolism. 5 (10), 844-857 (2016).
  28. Qiu, J., et al. Insulin excites anorexigenic proopiomelanocortin neurons via activation of canonical transient receptor potential channels. Cell Metabolism. 19 (4), 682-693 (2014).
  29. de Croft, S., Boehm, U., Herbison, A. E. Neurokinin B activates arcuate kisspeptin neurons through multiple tachykinin receptors in the male mouse. Endocrinology. 154 (8), 2750-2760 (2013).
  30. Frazao, R., et al. Estradiol modulates Kiss1 neuronal response to ghrelin. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 306 (6), E606-E614 (2014).
  31. True, C., Verma, S., Grove, K. L., Smith, M. S. Cocaine- and amphetamine-regulated transcript is a potent stimulator of GnRH and kisspeptin cells and may contribute to negative energy balance-induced reproductive inhibition in females. Endocrinology. 154 (8), 2821-2832 (2013).
  32. Navarro, V. M., et al. Regulation of NKB pathways and their roles in the control of Kiss1 neurons in the arcuate nucleus of the male mouse. Endocrinology. 152 (11), 4265-4275 (2011).
  33. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024 (2016).
  34. Gibson, A. G., Jaime, J., Burger, L. L., Moenter, S. M. Prenatal androgen treatment does not alter the firing activity of hypothalamic arcuate kisspeptin neurons in female mice. eNeuro. 8 (5), (2021).
  35. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain. Stereotaxic Coordinates. 2nd edition. , (2001).
  36. Cravo, R. M., et al. Characterization of Kiss1 neurons using transgenic mouse models. 신경과학. 173, 37-56 (2011).
  37. Emane, M. N., Delouis, C., Kelly, P. A., Djiane, J. Evolution of prolactin and placental lactogen receptors in ewes during pregnancy and lactation. Endocrinology. 118 (2), 695-700 (1986).
  38. Fuh, G., Colosi, P., Wood, W. I., Wells, J. A. Mechanism-based design of prolactin receptor antagonists. The Journal of Biological Chemistry. 268 (8), 5376-5381 (1993).
  39. Barinaga, M. Ion channel research wins physiology Nobel. Science. 254 (5030), 380 (1991).
  40. Colquhoun, D. Neher and Sakmann win Nobel Prize for patch-clamp work. Trends in Pharmacological Sciences. 12 (12), 449 (1991).
  41. Greger, R. Nobel Prize for Medicine and Physiology 1991. Analysis of the function of single ion channel. Deutsche Medizinische Wochenschrift. 116 (48), 1849-1851 (1991).
  42. Brau, M. E., Vogel, W., Hempelmann, G. Possible applications of the "patch-clamp" method in anesthesiologic research; comment. Anasthesiologie, Intensivmedizin, Notfallmedizin, Schmerztherapie. 31 (9), 537-542 (1996).
  43. Cahalan, M., Neher, E. Patch clamp techniques: an overview. Methods in Enzymology. 207, 3-14 (1992).
  44. Kornreich, B. G. The patch clamp technique: principles and technical considerations. Journal of Veterinary Cardiology. 9 (1), 25-37 (2007).
  45. Neher, E., Sakmann, B. The patch clamp technique. Scientific American. 266 (3), 44-51 (1992).
  46. Sachs, F., Auerbach, A. Single-channel electrophysiology: use of the patch clamp. Methods in Enzymology. 103, 147-176 (1983).
  47. Dallas, M., Bell, D. . Patch Clamp Electrophysiology: Methods and Protocols. 1st edition. , (2021).
  48. Robinson, R. A., Stokes, R. H. . Electrolyte Solutions. 2nd edition. , (1959).
  49. de Souza, G. O., et al. Gap junctions regulate the activity of AgRP neurons and diet-induced obesity in male mice. The Journal of Endocrinology. 255 (2), 75-90 (2022).
  50. Houades, V., Koulakoff, A., Ezan, P., Seif, I., Giaume, C. Gap junction-mediated astrocytic networks in the mouse barrel cortex. The Journal of Neuroscience. 28 (20), 5207-5217 (2008).
  51. Richerson, G. B., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Experimental Neurology. 131 (1), 133-143 (1995).
  52. Pan, J. T., Li, C. S., Tang, K. C., Lin, J. Y. Low calcium/high magnesium medium increases activities of hypothalamic arcuate and suprachiasmatic neurons in brain tissue slices. Neuroscience Letters. 144 (1-2), 157-160 (1992).
  53. Hamill, O. P., McBride, D. W. Induced membrane hypo/hyper-mechanosensitivity: a limitation of patch-clamp recording. Annual Review of Physiology. 59, 621-631 (1997).
  54. Herbison, A. E., Moenter, S. M. Depolarising and hyperpolarising actions of GABA(A) receptor activation on gonadotrophin-releasing hormone neurones: towards an emerging consensus. Journal of Neuroendocrinology. 23 (7), 557-569 (2011).
  55. Qiu, J., et al. High-frequency stimulation-induced peptide release synchronizes arcuate kisspeptin neurons and excites GnRH neurons. eLife. 5, e16246 (2016).
  56. Chaves, F. M., Mansano, N. S., Frazão, R., Donato, J. Tumor necrosis factor α and interleukin-1β acutely inhibit AgRP neurons in the arcuate nucleus of the hypothalamus. International Journal of Molecular Sciences. 21 (23), 8928 (2020).
  57. Chaves, F. M., et al. Effects of the isolated and combined ablation of growth hormone and IGF-1 receptors in somatostatin neurons. Endocrinology. 163 (5), 045 (2022).
  58. Wasinski, F., et al. Growth hormone receptor in dopaminergic neurones regulates stress-induced prolactin release in male mice. Journal of Neuroendocrinology. 33 (3), e12957 (2021).
  59. Furigo, I. C., Ramos-Lobo, A. M., Frazao, R., Donato, J. Brain STAT5 signaling and behavioral control. Molecular and Cellular Endocrinology. 438, 70-76 (2016).
  60. Zampieri, T. T., et al. Postnatal overnutrition induces changes in synaptic transmission to leptin receptor-expressing neurons in the arcuate nucleus of female mice. Nutrients. 12 (8), 2425 (2020).
  61. Furigo, I. C., et al. Growth hormone regulates neuroendocrine responses to weight loss via AgRP neurons. Nature Communication. 10 (1), 662 (2019).

Tags

Whole-cell Patch-clamp RecordingsElectrophysiological PropertiesCell MembranesIonic CurrentsCellular ResponseBrain DissectionHypothalamusOptic NerveVibratomeACSF SolutionMicroscopeAmplifierDigitizerMicromanipulatorPerfusion Pump

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Silva, J. d. N., Zampieri, T. T., Vieira, H. R., Frazao, R. Hypothalamic Kisspeptin Neurons as a Target for Whole-Cell Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (193), e64989, doi:10.3791/64989 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image