加齢黄斑変性症マウスモデルにおける網膜色素性上皮病変を評価および定量化するためのプロトコル

加齢黄斑変性症(AMD)は、55歳以上の人々に影響を与える一般的な失明性疾患^です1。多くの研究者は、網膜色素上皮(RPE)内の機能不全は、AMD²の早期かつ重要な病態学的事象であると考えています。RPEは、隣接する視受容体と脈絡膜血管の恒常性を維持する役割を負った偏光細胞の単層^です3。RPE内の疾患関連メカニズムを調べるために、細胞培養モデル⁴、⁵、マウス6^、7、8など、さまざまなモデルが存在します。最近の報告では、RPE細胞培養モデル⁴の標準化されたプロトコルと品質管理基準が記載されているが、マウスモデルにおけるRPEの表現型を標準化しようとした報告はない。実際、AMDのマウスモデルに関する多くの出版物には、RPEの完全な説明やRPEの病状の定量化が欠けています。このプロトコルの全体的な目標は、AMDマウスモデルを使用する科学者に、偏りのない定量的評価を備えた標準的なRPE表現型分析法を提示することです。

以前の出版物は、3つの画像技術を通じてマウスにおけるいくつかのRPE病理の存在を指摘している。たとえば、光学顕微鏡法により、研究者はマウス網膜の肉眼的形態を観察し(図1A)、RPEの菲薄化、空胞化、移動などのRPEの病状を検出できます。AMDマウスモデルにおけるRPEの薄化は、それぞれのコントロールからのRPEの高さの偏差によって例示されます(図1B)。RPE空胞化は、微小液胞化(図1C)とマクロ液胞化(図1D)の2つのカテゴリーに分けることができます。RPE微小液胞化は、その全体の高さに影響を及ぼさないRPE内の液胞の存在によって要約されるが、マクロ液胞化は、光受容体の外側セグメントに突出する液胞の存在によって示される。RPEの移動は、網膜断面におけるRPE単層上の色素の焦点集合体によって区別されます(図1E)。AMDドナーの眼における遊走性RPE細胞は、分化クラスター68(CD68)9などの免疫細胞マーカーに対して免疫反応性を示し、RPE破片または分化形質転換を受けているRPEを巻き込む免疫細胞を表す可能性があることに注意する必要があります^9。透過型電子顕微鏡と呼ばれる別のイメージング技術により、研究者はRPEとその基底膜の微細構造を視覚化することができます(図2A)。この手法により、基底層流沈着(BLamD)として知られるマウスの優勢なサブRPE沈着物を特定することができます(図2B)¹⁰。最後に、共焦点顕微鏡は、RPEフラットマウントのイメージングを通じてRPE細胞の構造を明らかにすることができます(図3A)。この方法により、RPE異形症、つまりRPEの古典的なハニカム形状からの偏差を明らかにすることができます(図3B)。また、RPE細胞内に3つ以上の核が存在するRPE多核化を検出することもできます(図3C)。現在のAMDマウスモデルに存在するRPE病理の種類の要約については、文献^6,7からこれらのレビューを参照します。

AMDを研究している研究者は、表現型プロトコルの前にマウスを使用してRPEの病状を調査することの長所と短所を知っておく必要があります。マウスは、それらの比較的短い寿命および費用対効果、ならびにそれらの遺伝的および薬理学的操作性のために有利である。マウスはまた、RPE遊走、異形症、および多核形成を含むRPE変性変化を示し、AMDドナー眼で観察される11、¹²、13、^14、15、^16、17;これは、同様のメカニズムがマウスとヒトにおけるこれらのRPE病状の発症の根底にある可能性があることを示唆しています。ただし、マウス研究のヒトAMDへの翻訳可能性を制限する重要な違いがあります。第一に、マウスには、AMDで優先的に影響を受ける視力に必要な人間の網膜の解剖学的に異なる領域である黄斑がありません。第二に、RPEの菲薄化や空胞化など、マウスの一部のRPE病理は、通常、AMDドナーの目には見られません¹⁸。第三に、マウスはAMD病理の特徴であるドルーゼンを発症しません¹⁹。ドルーゼンは脂質およびタンパク質を含む沈着物であり、RPE基底膜とブルッフ膜(BrM)の内側コラーゲン層との間に形成される基底膜タンパク質はほとんどありません¹⁹。ドルーゼンは、マウスの一般的なサブRPE沈着物であるBLamDとは、その組成と解剖学的位置の両方が異なります。BLamDは、BrMのRPE基底膜とRPE²⁰の基底折り畳みとの間に形成される、年齢およびストレス依存性の細胞外マトリックスに富む異常です。興味深いことに、BLamDはマウスとヒトの両方で同様のタンパク質組成と外観を持っています⁶、^10、21。最近の研究は、BLamDがAMDの後期段階への進行に影響を与えることによってAMDの病態生物学において作用する可能性があることを示唆しています^18,22;したがって、これらの沈着物は、マウス網膜における罹患RPEを表し得る。これらの利点と限界に関する知識は、マウス研究の結果をAMDに変換することに関心のある研究者にとって重要です。

このプロトコルでは、RPEの病状を視覚化するために、光、透過電子、および共焦点顕微鏡のために目を準備する方法について説明します。また、統計的検定のためにRPEの病状を偏りのない方法で定量化する方法についても説明します。概念実証として、RPE表現型プロトコルを利用して、膜貫通タンパク質135-(Tmem135)過剰発現マウスおよび老化野生型(WT)C57BL/6Jマウスで観察された構造的RPE病理を調査します。要約すると、現在利用可能な標準プロトコルがないため、AMDマウスモデルでRPEを特徴付けるための表現型決定方法論を説明することを目的としています。AMDマウスモデルでも影響を受ける光受容体または脈絡膜の病状の調査と定量化に関心のある研究者は、このプロトコルが研究に役立たない可能性があります。