Edição Gênica de Células B Primárias de Macaco Rhesus

Todos os procedimentos e experimentos com animais foram realizados de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas do National Institutes of Health. Um resumo dos protocolos a seguir é apresentado na Figura 1. Macacos rhesus (Macaca mulatta), machos e fêmeas, de origem genética indiana, com idades entre 2 e 8 anos, foram alojados e cuidados de acordo com as diretrizes do Comitê de Cuidados e Uso de Animais de Laboratório em uma instalação de nível de biossegurança 2. CUIDADO: Todos os experimentos foram realizados de acordo com as precauções universais para patógenos transmitidos pelo sangue, com técnicas estéreis/assépticas e equipamento adequado de nível 2 de biossegurança em capelas de fluxo laminar. 1. Produção de rAAV6 Preparar os reagentes para a produção de rAAV6.Projetar e clonar o molde de reparo dirigido por homologia entre as repetições terminais invertidas (ITRs) de AAV2 no pAAV vetorial usando técnicas padrão. Certifique-se de que os braços de homologia sejam de pelo menos ~250 bp em ambos os lados, mas tão pouco quanto 60 bp podem ser suficientes, embora braços de homologia mais longos sejam preferidos se o design de construção permitir. Se as sequências alvo de qualquer um dos sgRNAs usados estiverem presentes na HDRT, remova-as usando mutações silenciosas, que são mais eficazes no motivo adjacente do protoespaçador ou na região da semente do local alvo.NOTA: A síntese de genes combinada com a montagem de Gibson para clonagem eficiente32 pode ser realizada. Prepare um Maxiprep de um clone correto para transfecção. Para o design de sgRNA, o CHOPCHOP33 é recomendado, e uma lista de mais ferramentas pode ser encontrada em https://zlab.bio/guide-design-resources. A capacidade máxima de embalagem para AAV incluindo ITRs é de ~4,7 kb. AAV6 é o sorotipo mais comumente usado para edição de células hematopoéticas, particularmente células B9. Outros sorotipos de AAV para edição gênica de células B de macaco rhesus não foram testados, mas AAV28 e AAV-DJ10,11 foram usados em estudos em camundongos. Preparar meio de cultura 293AAV e meio de produção de acordo com a Tabela 1 e Tabela 2. Filtro estéril através de uma unidade filtrante de membrana de polietersulfona (PES) de 0,2 μm. Conservar a 4 °C. Preparar 1x solução de polietilenimina (PEI) (1 mg/mL, 100 mL). Em um copo de vidro de 250 mL, aqueça ~ 70 mL de H2O em um micro-ondas por ~30 s e, em seguida, adicione 100 mg de PEI. Adicione um agitador magnético e mexa até que o PEI esteja praticamente dissolvido. Ajuste o pH para 7 com HCl 1 M, depois completar até 100 mL com H2O, aguarde 10 min, verifique o pH novamente e ajuste se necessário. Filtre estéril a solução de PEI através de uma unidade filtrante de membrana de PES de 0,2 μm, alíquota, e armazene −20 °C. Após o descongelamento, a solução pode ser armazenada a 4 °C por até 2 meses. Preparar 5x solução de polietilenoglicol (PEG)/NaCl. Pesar 400 g de PEG 8.000 e 24 g de NaCl. Adicione um agitador magnético a um copo de vidro de 2 L, adicione o PEG 8.000 e o NaCl pesados e enxágue com ~ 550 mL de água deionizada. Mexa com o aquecimento e deixe ferver ou 80-90 °C até dissolver completamente. Ajuste o pH para ~7,4 com NaOH 1 M, depois ajuste o volume para 1 L usando um cilindro de medição e transfira-o para uma garrafa de vidro de 2 L com o agitador magnético. Autoclave o frasco, o agitador magnético e a solução em banho-maria por 30 min a 121 °C. Após a autoclavagem, resfriar a solução em uma câmara fria enquanto agita usando o agitador magnético para evitar a separação em diferentes fases. Alíquota, se necessário, e conservar a 4 °C. Prepare o tampão de formulação. Misturar 500 mL de DPBS com 50 μL de F-68 Plurônico a 10%. Filtrar estéril através de uma unidade de filtro de membrana de PES de 0,2 μm e armazenar à temperatura ambiente (TR). Cultura celular, transfecção e transdução para produção de rAAV6Descongelar, cultivar e congelar células de 293AAV conforme descrito pelo fabricante usando o meio de cultura 293AAV acima e tripsina-EDTA para divisão. Recomenda-se congelar algumas passagens iniciais e usar as células para produção de AAV antes que elas atinjam a passagem 40. Para a produção de rAAV6, semear quatro placas de cultura celular de 15 cm com 5 x 106 células em 30 mL cada. As células estão prontas para transfecção geralmente 1-2 dias após a semeadura, quando atingem 80%-90% de confluência. Descongelar um Maxiprep do plasmídeo pAAV contendo o HDRT para ser embalado em AAV6. Ressuspender 85,6 μg do plasmídeo pAAV em 3 mL de meio DMEM puro. Dissolver 342 μL de 1 mg/mL de solução de PEI em 3 mL de meio DMEM puro. Incubar ambas as soluções por 10 min no TR. Misture ambos os tubos de 3 mL em um tubo de ~6,4 mL de mistura de transfecção e incube por 20 min em RT. Enquanto isso, descongele o vetor auxiliar habilitado para tetraciclina RepCap6 do freezer de -80 °C em banho-maria de 37 °C. Para transduzir as células 293AAV, adicionar o vetor auxiliar a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 25 usando a dose infecciosa mediana de cultura de tecido (TCID 50) e assumindo 1,15 x10 7 células/placa; normalmente, 2-10 μL é usado por prato de 15 cm. Agite e gire os pratos suavemente para distribuir. Após a incubação da mistura de transfecção, adicione 1,6 mL em cada uma das quatro placas de 15 cm. Incubar a 37 °C e 5% CO2 durante a noite.NOTA: Alternativamente, se os vetores rAAV6 de interesse já estiverem disponíveis, esses vetores podem ser usados para fornecer o genoma viral a ser empacotado, o que nega a necessidade de quaisquer plasmídeos com este sistema e produz títulos rAAV6 comparáveis. Para esta abordagem, as células 293AAV são co-transduzidas com o rAAV6 desejado em um MOI de 50 (baseado em cópias do genoma do rAAV6 [GC]/mL) juntamente com o vetor auxiliar. No dia seguinte, aspirar e descartar cuidadosamente o meio de cultura e substituir por 30 mL de meio de produção pré-aquecido. Incubar por mais 96 h antes da colheita. Nenhuma outra mudança de meio é recomendada para maximizar os rendimentos. Colheita e purificação do AAV6 recombinante do meioSem deslocar as células da placa, colete todo o sobrenadante celular em uma unidade filtrante com uma membrana de PES de 0,2 μm pelo menos 50% maior do que o volume do meio a ser filtrado. Em seguida, filtre o sobrenadante.OBS: Se forem desejados maiores rendimentos de rAAV6, as células podem ser colhidas e o rAAV extraído do pellet celular utilizando kits comerciais ou protocolos estabelecidos34,35. Como o AAV6 é secretado principalmente para o meio36, apenas sobrenadante foi usado, reduzindo mão de obra, custo e tempo. Adicionar 5x solução de PEG/NaCl ao sobrenadante filtrado a 25% do volume coletado; isso é tipicamente 30 mL se quatro placas de 15 cm de 30 mL forem usadas. Misture bem invertendo e, em seguida, incube durante a noite a 4 °C para precipitar as partículas virais.NOTA: As partículas de AAV são estáveis por até 2 dias nesta solução. Pré-resfriar uma centrífuga de balde oscilante com 250 mL de insertos de tubo a 4 °C. Preparar uma unidade de filtro centrífugo de 4 mL com um ponto de corte de 100 kDa e um filtro de seringa de PES hidrofílico de 0,22 μm pré-tratando cada membrana com 2 mL de F-68 Plurônico a 10% por pelo menos 1 h em RT. Transfira a mistura AAV-PEG/NaCl para um tubo de 250 mL, centrifugar a 2.500 x g por 1 h a 4 °C e, em seguida, remover cuidadosamente todo o sobrenadante por aspiração. Ressuspender a pastilha viral bege a branca por vórtice em 4 mL de HEPES 1 M até ressuspender totalmente. Se necessário, deixe repousar por 5 min, e volte a vomitar. Ressuspender com pipeta sorológica de 5 mL e transferir o volume total para um tubo de 15 mL. Em um exaustor, adicione um volume igual de clorofórmio à suspensão do vírus – normalmente 4 mL. Vórtice vigorosamente por 2 min e, em seguida, centrifugue a 1.000 x g por 5 min no RT. Coletar a camada superior (sobrenadante contendo AAV) em um novo tubo de 50 mL e descartar a camada inferior (clorofórmio).CUIDADO: Soluções contendo clorofórmio são resíduos perigosos. Seguir as orientações institucionais para seu descarte. Coloque o sobrenadante contendo AAV sob uma capela de fumo e deixe evaporar o clorofórmio restante durante 30 minutos. Enquanto isso, lave a unidade de filtro centrífugo pré-tratado e o filtro de seringa. Adicionar 1,5 ml de tampão de formulação à unidade filtrante centrífuga pré-tratada. Centrifugar a 3.500 x g por 10 min a 15 °C em um rotor de caçamba oscilante. Repita esta etapa com 4 mL de tampão de formulação para lavar a membrana. Enxaguar o filtro da seringa duas vezes com 5 mL de tampão de formulação usando uma seringa de 5 mL. Coloque o sobrenadante contendo ~4 mL de AAV da extração de clorofórmio em uma seringa de 5 mL, conecte o filtro de seringa lavado e filtre diretamente na unidade de filtro centrífugo. Centrifugar a 3.500 x g durante 25 minutos a 15 °C e, em seguida, confirmar se a solução de AAV no filtro está entre 50-100 μL. Se o volume da solução for de >100 μL, continue a centrifugar. Depois de remover o filtrado, adicionar 4 mL de tampão de formulação dentro do copo da unidade filtrante centrífuga e misturar a solução uniformemente por pipetagem. Centrifugar a 3.500 x g durante 25 minutos a 15 °C e, em seguida, confirmar se a solução de AAV no filtro está entre 50-100 μL. Se o volume da solução for de >100 μL, continue a centrifugar. Repita este passo para outra lavagem. Após a centrifugação final, confirmar se o volume da solução é de 50-70 μL; se não, continue a centrifugar. Transfira a preparação para um tubo de 1,5 mL. Alíquota, se desejar, e armazenar a -80 °C. Determinação de títulos de AAV6 recombinante por qPCRNOTA: Os primers qPCR recozidos na região ITR devem, portanto, ser adequados para todas as construções clonadas em pAAV.Descongelar uma alíquota do rAAV6 a ser titulado e uma alíquota do material de referência AAV6. O material de referência AAV6 deve estar próximo de 4 x 1011 GC/mL; caso contrário, ajuste as diluições em conformidade. Realizar um digestor DNase I para remover qualquer DNA plasmidial livre remanescente na preparação rAAV6 combinando 2,0 μL da amostra ou material de referência AAV6 com 15,6 μL de H 2 O livre de nuclease,2,0μL de tampão 10x DNase I e 0,4 μL de DNase I. Misture e incube suavemente durante 30 minutos a 37 °C e, em seguida, transfira para o gelo. Trata-se da diluição 1 (ver Tabela 3). Preparar diluições seriadas de cinco vezes de todas as amostras e do material de referência AAV6, tal como indicado no quadro 3 abaixo, com água. Prepare um master mix de qPCR verde SYBR. Por poço, misturar 4,7 μL de água livre de nuclease com 10 μL de mistura mestre SYBR Green, 0,15 μL de primer ITR forward a 100 μM e 0,15 μL de ITR primer reverse a 100 μM.NOTA: Cada amostra é medida em duplicata, com 16 poços para o padrão de referência, 8 poços por amostra e 2 poços para um controle sem gabarito. Prepare 10% a mais de combinação mestre para contabilizar o erro de pipetagem. Em uma placa de reação óptica de 96 ou 384 poços, carregue 15 μL/poço da mistura mestre de qPCR verde SYBR. Em seguida, carregar 5 μL de amostras e material de referência AAV6 ou água livre de nuclease para o controle sem molde. Para o padrão de referência AAV6, diluição de carga 2 a diluição 9. Para as amostras, diluição da carga 5 à diluição 8. Meça cada diluição em duplicado. Evite bolhas. Sele a placa carregada com filme transparente óptico, centrifugue a 800 x g por 1 min no RT e carregue a placa no instrumento qPCR com a configuração apropriada de 96 ou 384 poços. Configure e execute o instrumento qPCR usando a detecção SYBR com as seguintes condições de ciclagem: 98 °C por 3 min, depois 40 ciclos de 98 °C por 15 s e 58 °C por 30 s, seguidos por uma curva de fusão. Analise os dados com o software do instrumento usando a concentração do material de referência AAV6 em cópias do genoma por milímetro (GC/mL) como curva padrão (ver Tabela 3). Calcular a concentração final da amostra multiplicando pelo factor de diluição. Certifique-se de que a curva padrão R2 está próxima de 1,0, a eficiência da PCR é de 90%-110%, a linha de base foi removida, a curva de fusão mostra um único pico, os valores de C t mudam de acordo com as diluições e as duplicatas estão dentro de 0,5C t; caso contrário, exclua valores atípicos. Espere rendimentos como na Figura 2. 2. Preparação de meios e estímulos de células B Prepare o meio de descongelamento: Combine RPMI-1640 com 20% FCS. Filtro estéril através de uma unidade de filtro de membrana de PES de 0,2 μm. Conservar a 4 °C. Preparar meio de cultura de células B: Combinar os reagentes da Tabela 4 e, em seguida, filtrar estéril através de uma unidade de filtro de membrana de PES de 0,2 μm. Conservar a 4 °C. Ressuspender cada um dos estimulantes de células B na Tabela 5 nas concentrações de estoque em meio de cultura de células B, exceto CpG ODN, que deve ser ressuspendido em água livre de nucleases. Conservar a -80 °C. Se realizar depleção negativa de células não B (etapa 4 opcional), prepare a DPBS (sem cálcio, sem magnésio) com 2% de SFB (DPBS a 2% de SFB). Filtro estéril através de uma unidade de filtro de membrana de PES de 0,2 μm. Conservar a 4 °C. 3. Preparação e cultura de células B de macaco rhesus OBS: Macacos rhesus criopreservados PBMCs ou esplenócitos são utilizados para configurar a cultura celular30,31. Meio de descongelamento pré-aquecido e meio de cultura de células B em banho-maria a 37 °C. Descongelar os estimulantes de células B da Tabela 5 no gelo. Preparar um tubo de tamanho adequado contendo meio de descongelamento pré-aquecido. O ideal é que isso seja mais de 10 vezes o volume das células descongeladas. Descongelar um a dois criósforos de PBMCs ou esplenócitos de cada vez em banho-maria a 37 °C e decantar no tubo preparado com meio pré-aquecido. Enxágue os criotubos para coletar todas as células. Centrifugar as células a 200 x g por 10 min em TR.NOTA: Essas configurações de centrifugação reduzem a contaminação plaquetária enquanto preservam os rendimentos do PBMC. Velocidades mais altas, como 350 x g por 5 min, podem ser usadas. Ressuspender as células em meio de descongelamento de 10 mL para lavagem. Repetir os passos 3.4 e 3.5 para um total de três centrifugações para remover o meio de congelação. Após a última centrifugação, ressuspender as células a uma estimativa de ~5 x 106 células/mL em meio de cultura de células B.NOTA: O protocolo acima cultiva PBMC inteiros ou preparações de esplenócitos com contaminação por outras células. Se forem necessárias culturas de células B mais puras, embora com rendimentos totais de células B significativamente reduzidos, continue com a etapa 4. Não foram observadas diferenças nas eficiências de edição entre os dois métodos. Diluir uma alíquota de 10 μL de células, conforme necessário, com meio de cultura de células B para contagem. Contagem com hemocitômetro e coloração com azul de tripano, combinando volumes iguais de células ressuspensas e solução de azul de tripano a 0,4%. Ajustar a concentração celular para 3 x 106 células/mL com meio de cultura de células B de acordo com a contagem celular. Em seguida, adicione os estimulantes de células B às suas concentrações finais, de acordo com a Tabela 5, e misture. Transfira as células para uma placa de cultura celular apropriada. No geral, 0,6 x 10 6-0,7 x 106 células/cm 2 é recomendado. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO 2 durante 48 h ±2 h. 4. Depleção negativa opcional de células não-B NOTA: O rendimento e a pureza dependem da porcentagem de entrada de células B entre as CMSP, que podem diferir drasticamente entre macacos rhesus individuais27. Espere 80%-95% de pureza, 60% de eficiência e 1 x 10 6-1,5 x 106 células de 1 x 107 PBMCs. Após a última lavagem (passo 3.6), ressuspender as células a 1 x 108 células/mL em SFB DPBS 2% e bloco Fc humano diluído 1:200. As contagens de células são baseadas no número de células descongeladas. Incubar por 15 min em gelo para bloquear os receptores Fc e, em seguida, adicionar os anticorpos biotinilados na Tabela 6. Incubar por mais 20 min no gelo. Completar o tubo com DPBS 2% FCS e girar a 200 x g por 10 min a 4 °C. Ressuspender as células em SFB 2% DPBS a 80% do volume a partir do passo 4.1 (ou seja, 80 μL por 1 x 107 células). Adicionar esferas magnéticas de estreptavidina à suspensão celular a 20% do volume do passo 4.1 (ou seja, 20 μL de contas por 1 x 107 células). Incubar as células por 15 min no gelo e agitar ocasionalmente. Enquanto isso, por 1 x 108 células, prepare um separador magnético com uma grande coluna de depleção magnética e um filtro de pré-separação. Enxaguar o filtro e a coluna de pré-separação com 2 mL de DPBS 2% FCS por gravidade e descartar o fluxo. Instale um tubo de coleta de 15 mL.NOTA: O uso de outras colunas, como colunas de seleção positiva ou outros sistemas de purificação de esferas magnéticas, pode reduzir drasticamente a pureza. Após a incubação, completar as células para 0,5 mL com DPBS 2% FCS se o volume for <0,5 mL. Se o volume for ≥0,5 mL, basta prosseguir. Coloque a suspensão da célula no filtro de pré-separação na coluna preparada e colete o fluxo no tubo de 15 mL. Eluir as células B enriquecidas não ligadas duas vezes adicionando 1 mL de DPBS 2% FCS no filtro de pré-separação. Coletar as células não ligadas no mesmo tubo por fluxo de gravidade.NOTA: Eluição adicional pode aumentar marginalmente o rendimento. A pureza e a eficiência podem ser avaliadas pela citometria de fluxo das células de entrada, das células enriquecidas e das células retidas na coluna. Para obter as células retidas na coluna, remova a coluna do ímã e lave com 3 mL de DPBS 2% FCS usando o êmbolo fornecido. Se desejar, avaliar a pureza por citometria de fluxo como na Figura 3 utilizando os reagentes da Tabela 7. Centrifugar as células B enriquecidas a 200 x g durante 10 minutos a 4 °C. Ressuspender as células a uma estimativa de ~5 x 106 células/mL em meio de cultura de células B e continuar na etapa 3.7. 5. Edição genética primária de células B de macaco rhesus Após ativar as células B do macaco rhesus por 48 h ± 2 h, prepare os reagentes para eletroporação e transdução.Pré-aquecer DMSO, tampão duplex livre de nuclease, tampão T e tampão E (kit de eletroporação de 10 μL) ou E2 (kit de eletroporação de 100 μL) do kit de eletroporação para RT. Descongelar os estimulantes rAAV6 HDRT e células B da Tabela 5 no gelo. Ressuspenda os sgRNAs CRISPR-Cas9 a 100 μM em buffer duplex. Reconstitua por 10 min no RT e misture por vórtice e agitação. Mantenha os sgRNAs reconstituídos no gelo até o uso. Conservar a -80 °C.NOTA: Os sgRNAs CRISPR-Cas9 podem ser projetados com várias ferramentas on-line (ver 1.1.1) e podem variar drasticamente em sua eficiência de corte. Recomenda-se o teste empírico da eficiência de corte usando ensaios como TIDE37 ou ICE38. Por eletroporação de 10 μL, preparar 550 μL de meio de cultura de células B com todos os estimulantes da Tabela 5 e adicionar 1% de DMSO. Dimensione os volumes em 10 vezes para eletroporações de 100 μL. Opcionalmente, 10% desse meio pode ser preparado sem antibiótico-antimicótico, o que aumenta ligeiramente a viabilidade celular após a transfecção. Por eletroporação de 10 μL, preparar um poço de uma placa de cultura celular de 48 poços com 50 μL do meio de cultura de células B com estimulantes e sem antibiótico-antimicótico, se o utilizar. Para eletroporações de 100 μL, pipetar 500 μL para os poços de uma placa de 6 poços. Adicione rAAV6 HDRT ao meio nos poços, até 20% do volume no poço. Apontar para MOIs que variam de 1 x 10 5-1 x 10 6 com base no número de células por transfecção (eletroporação de 10 μL: 5 x 10 5 células; eletroporação de 100 μL:5 x 106 células) e o GC na preparação de rAAV6. Altas concentrações de estoque de rAAV6 de 5 x 1013 GC/mL a 5 x10 14 GC/mL são recomendadas para atingir MOIs altos com baixos volumes.NOTA: MOIs mais baixos podem levar à redução da eficiência de edição, e MOIs de 5 x 105 geralmente estão perto das eficiências máximas de edição que vimos. Não foi observada influência de MOIs variáveis na viabilidade de células B. Recomenda-se a inclusão de controles sem rAAV6 HDRT, sem transfecção RNP e sem ambos. Pré-aqueça os pratos preparados e o meio restante transferindo-os para uma incubadora a 37 °C com 5% de CO2. Por eletroporação de 10 μL, preparar 1,15 μL de ribonucleoproteína (RNP): Misturar 0,4 μL de 61 μM Cas9 com 0,75 μL de sgRNA 100 μM em tampão duplex. Prepare extra (recomenda-se 30% a mais para uma única eletroporação) devido a erro de pipetagem e para evitar bolhas ao carregar as pontas de eletroporação. Escala 10 vezes para pontas de 100 μL. Incubar o RNP por pelo menos 15 min em RT antes de misturar com as células. Após a incubação, várias RNPs podem ser combinadas se mais de um locus for alvo simultaneamente. Não foram observadas diferenças significativas na eficiência com até três locos ao mesmo tempo. Enquanto isso, prepare as células para a eletroporação. Mantenha as células em RT o tempo todo para evitar choques de temperatura. Colher as células após 48 h ± 2 h de cultura em recipiente apropriado. Enxágue as louças com DPBS para coletar o número máximo de células. Centrifugar as células a 200 x g por 10 min no TR. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em DPBS a ~2 x 106 células/mL. Combinar 10 μL de solução de azul de tripano a 0,4% com 10 μL da suspensão celular e contar utilizando um hemocitómetro.OBS: Neste momento, devido à perda durante a colheita e lavagem, espera-se cerca de 60% das células que foram colocadas em cultura 48 h ± 2h antes. Enquanto isso, centrifugar as células a 200 x g por 10 min no RT. Descarte o sobrenadante, certificando-se de minimizar qualquer DPBS restante. Ressuspender as células em tampão T pré-aquecido (RT) a 5,55 x 107 células/mL com base na contagem de células acima. Configure o sistema de transfecção ligando a máquina e configurando-a para 1.350 V, 15 ms e 1 pulso. Coloque a estação de pipetas dentro da capela de fluxo laminar Para cada conjunto de 10 eletroporações, preparar um tubo de transfecção com 3 mL de tampão E (para transfecções de 10 μL) ou E2 (para transfecções de 100 μL). Insira o tubo na estação de pipetas. Por eletroporação de 10 μL, combinar 1,15 μL de RNP com 9 μL de células. Certifique-se de ter um volume suficiente (+ 30%) para evitar aspirar ar para a ponta de eletroporação. Incubar em RT por 1-2 min antes da eletroporação. Aspirar 10 μL ou 100 μL de RNP e mistura celular na ponta de eletroporação de tamanho adequado em uma pipeta de eletroporação, inserir a pipeta carregada na estação de pipeta e iniciar a eletroporação. Certifique-se de que as pontas estão completamente livres de bolhas de ar para evitar o arranque. Observe durante a eletroporação para verificar se o arco não ocorre. Ejetar imediatamente as células eletroporadas para o pequeno volume de meio preparado, pré-aquecido, com ou sem rAAV6 dentro da placa de 48 poços (transfecções de 10 μL) ou 6 poços (transfecções de 100 μL). Repita as etapas 5.15-5.17 com as amostras restantes. Adicionar amostras controle sem transfecção aos poços de cultura. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO 2 por 4 h ±2 h e, em seguida, adicionar o meio de cultura de células B preparado e pré-aquecido contendo estimulantes, DMSO e antibiótico/antimicótico: 450 μL para transfecções de 10 μL ou 4,5 mL para transfecções de 100 μL. Continuar a incubação a 37 °C com 5% de CO2 por 12-24 h. Em seguida, trocar o meio para meio de cultura de células B contendo estimulantes e antibiótico/antimicótico sem DMSO se desejar cultura prolongada. A análise do DNA genômico pode ser feita após 24 h. A PCR digital em gotículas utilizando um primer fora do braço de homologia e um primer dentro da pastilha pode ser usada para quantificar a eficiência de edição39. Realizar PCRs para amplificar o local de inserção e sequenciamento de Sanger para verificar a edição correta. Para análise dos níveis de proteína, cultivar as células por 40-48 h após a eletroporação para permitir alterações na expressão proteica, e realizar uma análise por citometria de fluxo usando os reagentes da Tabela 7.