Imunoprecipitação da cromatina no sistema modelo cnidário Exaiptasia diaphana
Summary
Um ensaio de imunoprecipitação da cromatina (X-ChIP) contra a marca de histona H3K4me3 para o organismo modelo Exaiptasia diaphana é apresentado. A especificidade e a eficácia do ensaio são confirmadas por PCR quantitativo e sequenciamento de última geração. Este protocolo permite o aumento da investigação das interações proteína-DNA na anêmona-do-mar E. diaphana.
Abstract
As modificações pós-traducionais de histonas (PTMs) e outras modificações epigenéticas regulam a acessibilidade da cromatina dos genes à maquinaria transcricional, afetando assim a capacidade de um organismo de responder a estímulos ambientais. A imunoprecipitação da cromatina juntamente com o sequenciamento de alto rendimento (ChIP-seq) tem sido amplamente utilizada para identificar e mapear interações proteína-DNA nos campos da epigenética e regulação gênica. No entanto, o campo da epigenética dos cnidários é dificultado pela falta de protocolos aplicáveis, em parte devido às características únicas de organismos modelo, como a anêmona-do-mar simbiótica Exaiptasia diaphana, cujo alto teor de água e quantidades de muco obstruem os métodos moleculares. Aqui, é apresentado um procedimento especializado de ChIP, que facilita a investigação das interações proteína-DNA na regulação do gene E. diaphana . As etapas de reticulação e extração da cromatina foram otimizadas para imunoprecipitação eficiente e, em seguida, validadas pela realização de ChIP usando um anticorpo contra a marca de histona H3K4me3. Posteriormente, a especificidade e a eficácia do ensaio ChIP foram confirmadas medindo a ocupação relativa de H3K4me3 em torno de vários loci gênicos constitutivamente ativados usando PCR quantitativo e por sequenciamento de próxima geração para análise em escala genômica. Este protocolo ChIP otimizado para a anêmona-do-mar simbiótica E. diaphana facilita a investigação das interações proteína-DNA envolvidas nas respostas do organismo às mudanças ambientais que afetam os cnidários simbióticos, como os corais.
Introduction
O relatório de 2022 do Painel Intergovernamental sobre Mudanças Climáticas (IPCC) destaca que, apesar dos crescentes esforços de conscientização e mitigação, ondas de calor marinhas cada vez mais intensas e frequentes estão colocando os recifes de coral em alto risco de branqueamento extensivo e mortalidade em massa nas próximas décadas1. A fim de informar os esforços de conservação e restauração dos recifes de coral, os efeitos atuais e projetados das mudanças nas condições ambientais em cnidários bentônicos estão sendo investigados em vários níveis biológicos para entender os mecanismos subjacentes de resposta e resiliência2.
A disponibilidade de ferramentas investigativas aplicáveis a cnidários bentônicos é crucial para enfrentar esse desafio, e o desenvolvimento dessas ferramentas requer um esforço ativo para transferir conhecimento e tecnologias estabelecidas em outros campos para organismos marinhos3. Os obstáculos para trabalhar com muitas espécies de corais são parcialmente aliviados pelo uso de sistemas modelo, como a anêmona-do-mar Exaiptasia diaphana (comumente referida como Aiptasia)4. Essas anêmonas-do-mar facultativamente simbióticas de crescimento rápido são relativamente fáceis de manter em condições de laboratório, reproduzem-se sexuada e assexuadamente e não possuem o esqueleto de carbonato de cálcio5. O genoma de referência de acesso aberto5 de E. diaphana facilita o uso de métodos epigenéticos que requerem sequenciamento. No entanto, características como alto teor de água, produção de muco e baixas quantidades de tecido por indivíduo são desafios para o estabelecimento de protocolos replicáveis, restringindo assim a pesquisa epigenética em E. diaphana e outros cnidários com características semelhantes.
Modificações epigenéticas podem alterar o fenótipo sem alterar a sequência de nucleotídeos genômicos de um organismo, regulando os processos associados à cromatina6. A regulação epigenética dos cnidários é investigada principalmente nos contextos de história evolutiva e desenvolvimento 7,8,9,10, estabelecimento e manutenção da simbiose 11,12,13 e resposta a mudanças ambientais14,15. Especificamente, variações nos padrões de metilação do DNA, que, na maioria dos casos, envolvem a adição de um grupo metil a uma base de citosina, foram observadas em resposta a mudanças nas condições ambientais, como aquecimento13 e acidificação dos oceanos16. Os padrões de metilação do DNA também demonstraram ser hereditários intergeracionalmente, enfatizando o papel da epigenética na aclimatação de corais a estressores ambientais17. Em comparação com a metilação do DNA, houve relativamente poucos estudos sobre outros reguladores epigenéticos importantes, como RNAs não codificantes11,18,19, fatores de transcrição 9,10 ou modificações pós-traducionais de histonas (PTMs) em cnidários20. A investigação de proteínas associadas ao DNA é especialmente exigente, pois os métodos disponíveis requerem acesso a um genoma de referência do organismo de estudo e são caros devido ao grande tamanho das amostras e anticorpos de alta especificidade necessários3. Com uma ampla variedade de grupos químicos que formam PTMs em resíduos específicos de histonas, entender as paisagens de modificação da cromatina em cnidários, especialmente no contexto de estresses ambientais iminentes, continua sendo um grande desafio.
O objetivo deste trabalho é avançar na investigação de PTMs de histonas, variantes de histonas e outras proteínas associadas à cromatina em cnidários, apresentando um protocolo otimizado de imunoprecipitação da cromatina (ChIP) para o modelo de coral E. diaphana (protocolo original de Bodega et al.21). O ChIP pode ser combinado com PCR quantitativo para caracterizar interações proteína-DNA específicas do locus ou sequenciamento de próxima geração (NGS) para mapear essas interações em todo o genoma. Em geral, proteínas e DNA são reticulados reversivelmente de modo que a proteína de interesse (POI) permanece ligada ao mesmo locus ao qual está associada in vivo. Embora o método comum de reticulação amplamente utilizado no sistema modelo de mamíferos seja geralmente mantido em 15 minutos ou menos à temperatura ambiente, a abordagem de reticulação foi otimizada para permitir que o formaldeído penetre através do muco produzido por E. diaphana de forma mais eficaz. O tecido é então congelado em nitrogênio líquido, homogeneizado e lisado para extrair os núcleos das células. A perda de material nessas etapas é evitada usando apenas um tampão de lise e, em seguida, passando diretamente para a sonicação, que fragmenta a cromatina em fragmentos de ~ 300 pb de comprimento. Esses fragmentos são incubados com um anticorpo específico para o POI com precisão de nível PTM. O imunocomplexo anticorpo-proteína-DNA é precipitado usando esferas magnéticas que se ligam aos anticorpos primários, selecionando assim apenas os segmentos de DNA associados ao POI. Após a reversão da reticulação e limpeza do precipitado, os segmentos de DNA produzidos podem ser usados para qPCR ou construção de biblioteca de DNA para sequenciamento para mapear os segmentos para um genoma de referência e, assim, identificar os loci aos quais o POI está associado. Mais detalhes sobre as considerações para cada etapa podem ser encontrados em Jordán-Pla e Visa22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Seguindo o protocolo acima, o DNA obtido foi usado com sucesso para ChIP-qPCR e ChIP-Seq. O mesmo perfil de pico geral para H3K4me3 relatado anteriormente de outros organismos 26,27,28 foi obtido aqui, com o pico mais alto ao redor do TSS e alto enriquecimento nos locais esperados no ChIP-qPCR. O número relativamente alto de leituras mapeadas multiplicadas nos dados ChIP-Seq pode ter sido causado por duplicatas de PCR. A quantidade de leituras mapeadas exclusivamente pode ser aumentada por mudanças no protocolo de preparação da biblioteca de DNA para reduzir as duplicatas de PCR. Existem vários métodos de normalização para dados ChIP-qPCR, com o método de porcentagem de entrada apresentado aqui sendo mais comumente usado. Esse método normaliza o IP e as amostras simuladas diretamente para a entrada, com a desvantagem de que a entrada é processada de forma diferente das amostras IP e simuladas durante o ChIP, o que pode introduzir erros. O método alternativo de enriquecimento de dobra normaliza o sinal do IP com base no sinal da simulação usando os mesmos conjuntos de primers, fornecendo assim uma relação sinal-fundo. No entanto, a intensidade do sinal da amostra simulada pode variar fortemente, o que, por sua vez, tem grandes efeitos nos dados. Uma discussão detalhada sobre ChIP-qPCR e normalização de dados pode ser encontrada em Haring et al.29.
Um grande ajuste no método apresentado acima em comparação com os protocolos ChIP comuns é o tempo de reticulação muito mais longo, de cerca de 15 minutos para proteínas histonas para uma incubação noturna. O principal objetivo desse ajuste é facilitar a penetração do fixador formaldeído através da camada de muco no tecido mais profundo de E. diaphana para preservar as interações proteína-DNA dentro do núcleo. A otimização desta etapa é fundamental para garantir reticulação suficiente para preservar as interações proteína-DNA sem reticulação tanto que o cisalhamento da cromatina por sonicação se torne ineficaz. A adição de detergentes como SDS também pode aumentar a eficiência da sonicação29. Além disso, uma longa incubação com formaldeído facilitou a etapa de homogeneização e resultou em uma amostra moída mais fina e uniformemente em comparação com anêmonas frescas ou congeladas que foram homogeneizadas antes da etapa de reticulação. As faixas recomendadas de comprimentos de fragmentos variam entre 100 pb e 1.000 pb29,30 e podem depender da proteína alvo. É fundamental que cada usuário otimize as condições de sonicação para atingir o comprimento desejado do fragmento com o menor poder de sonicação possível, pois a sobressonicação pode desnaturar as proteínas e, assim, impactar o IP31. Outra limitação do ChIP é a quantidade de material necessária, que afeta particularmente organismos relativamente pequenos, como as anêmonas; Esse problema foi resolvido reduzindo a perda de amostra entre as etapas. Após homogeneizar a amostra, ela foi lisada imediatamente, omitindo várias etapas comuns de preparação dos núcleos. O pool de amostras obtido de 20 anêmonas geralmente continha cromatina suficiente para três IPs e controles simulados e de entrada. A quantidade de material de partida (ou seja, o número de anêmonas) pode ser reduzida ainda mais no futuro, especialmente ao realizar um ChIP com apenas uma proteína-alvo. Dependendo do método a jusante pretendido, os controles devem ser ajustados; para ChIP-qPCR, deve-se considerar a inclusão de controles adicionais29, enquanto para ChIP-seq, a simulação pode ser omitida em favor de um controle de entrada.
Embora a validação de anticorpos esteja fora do escopo deste protocolo e, portanto, tenha sido apenas brevemente abordada aqui, é uma etapa crítica antes de realizar o ChIP. Especialmente ao usar anticorpos comerciais em espécies de invertebrados, a disponibilidade de anticorpos específicos para os alvos desejados pode ser uma limitação. Na primeira etapa, a sequência da cauda H3 N-terminal de E. diaphana e outros organismos modelo, incluindo peixe-zebra e camundongos, foi comparada e considerada altamente conservada12. A especificidade do anticorpo foi então testada usando imunofluorescência, que co-localizou os sinais do ácido nucléico e do anticorpo. O perfil de pico de H3K4me3 em torno do TSS obtido a partir dos dados de sequenciamento dá mais confiança em relação à especificidade do anticorpo.
Outra consideração em relação à especificidade do anticorpo é a possibilidade de qualquer interação com os dinoflagelados simbióticos que E. diaphana, assim como muitos outros antozoários, hospedam em suas células. Análises de transcriptoma em dinoflagelados dos gêneros Lingulodinium32 e Symbiodinium33 encontraram genes codificadores de histonas, incluindo histona central H3 e várias variantes H3 em baixos níveis de expressão, e a extensão da conservação funcional do código de histonas não é clara34. Marinov e Lynch34 compararam a conservação da sequência de caudas N-terminais variantes H3 dentro e entre espécies de dinoflagelados, e as espécies de Symbiodiniaceae mostraram uma alta divergência em torno da lisina 4 na sequência da cauda, especialmente quando se considera a congruência de aminoácidos adjacentes à lisina 4 como um fator. Esta região também demonstrou divergir de outras espécies modelo, como Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster e Saccharomyces cerevisiae, que correspondem à sequência de E. diaphana12. Portanto, o risco de interação não intencional do anticorpo contra H3K4me3 com dinoflagelado H3 é baixo. Além disso, as sequências são alinhadas apenas ao genoma de E. diaphana , e os primers de qPCR devem ser específicos para sequências de E. diaphana , fornecendo uma camada extra de filtração de quaisquer sequências precipitadas não intencionalmente.
O protocolo ChIP apresentado produz DNA suficiente para qPCR, bem como sequenciamento de próxima geração e, embora a otimização individual por cada usuário provavelmente seja necessária, ele fornece um ponto de partida para o aumento da investigação das interações proteína-DNA em cnidários bentônicos, possivelmente no contexto de simbiose e mudanças ambientais.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nenhum.
Materials
| 1 kb Plus DNA Ladder | Invitrogen | 10787018 | |
| 100% Ethanol | |||
| 15 mL falcon tubes | |||
| 16% Formaldehyde Solution (w/v), Methanol-free | Thermo scientific | 28906 | |
| 5 mL tube | |||
| 5PRIME Phase Lock tubes | Quantabio | 2302820 | Phase lock gel – light |
| AGANI needle 25 G | Terumo | AN*2516R1 | |
| Agarose | |||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Bowtie | open source, available from https://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml | ||
| Branson sonifier 250 | Branson | Sonicator | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430 R | With rotors for 15 mL and 1.5 mL tubes |
| ChIP-grade antibody (here polyclonal H3K4me3 antibody) | Diagenode | C15410003 | |
| Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | 2 tablets/mL water for 100x stock |
| Cover glass | vwr | 48393 194 | |
| Disposable Spatula | vwr | 80081-188 | |
| DNA purification kit (here QIAGEN QIAquick PCR purification kit) | QIAGEN | 28104 | |
| Dounce tissue grinder | Wheaton | tight pestle | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) 1x | gibco | 14190-094 | |
| Dynabeads Protein G | Thermo Fisher Scientific | 10004D | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3609 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | 324626 | |
| Electrophoresis system | |||
| Ethidium bromide | |||
| FASTQC v0.11.9 | software | ||
| Gel Doc EZ Documentation System | Bio-Rad | 1708270 | Gel imaging system |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 50046 | |
| Injekt-F Tuberculin syringe 1 mL | B. Braun | 9166017V | |
| Linear acrylamide (5 mg/mL) | Invitrogen | AM9520 | |
| Low-retention 1.5 mL tube | |||
| Magnetic separation rack | for 1.5 mL tubes | ||
| Microscope | |||
| Microscope slide | |||
| Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS) | open source | ||
| Mortar and pestle, porcelain | |||
| NanoDrop 2000c spectrophotometer | Thermo scientific | ND-2000C | |
| N-lauroylsarcosine | Sigma-Aldrich | 61739 | |
| Nuclease-free water | |||
| Pasteur pipette | |||
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol Mixture (25:24:1) | Sigma-Aldrich | 77617 | |
| Proteinase K (20 mg/mL) | Ambion | AM2546 | |
| Purple Loading Dye 6x | New England BioLabs | B7024S | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
| RNase Cocktail Enzyme Mix | Invitrogen | AM2286 | RNase A = 500 U/mL, RNase T1 = 20000 U/mL |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | |
| TAE buffer | |||
| Thermomixer | Eppendorf | 5384000012 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
| Triton X-100 solution | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | Danger: may cause cancer. Suspected of damagin fertility or the unborn child |
| Tube rotator SB3 | Stuart | ||
| UltraPure SDS Solution, 10% | Invitrogen | 15553027 | |
| Vacuum pump |
References
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