Immunoprecipitazione della cromatina nel sistema modello cnidariano Exaiptasia diaphana
Summary
Viene presentato un saggio di immunoprecipitazione della cromatina (X-ChIP) contro il segno istonico H3K4me3 per l’organismo modello Exaiptasia diaphana . La specificità e l’efficacia del test sono confermate dalla PCR quantitativa e dal sequenziamento di nuova generazione. Questo protocollo consente di approfondire lo studio delle interazioni proteina-DNA nell’anemone di mare E. diaphana.
Abstract
Le modificazioni post-traduzionali degli istoni (PTM) e altre modificazioni epigenetiche regolano l’accessibilità della cromatina dei geni al meccanismo trascrizionale, influenzando così la capacità di un organismo di rispondere agli stimoli ambientali. L’immunoprecipitazione della cromatina accoppiata al sequenziamento ad alto rendimento (ChIP-seq) è stata ampiamente utilizzata per identificare e mappare le interazioni proteina-DNA nei campi dell’epigenetica e della regolazione genica. Tuttavia, il campo dell’epigenetica degli cnidari è ostacolato dalla mancanza di protocolli applicabili, in parte a causa delle caratteristiche uniche di organismi modello come l’anemone di mare simbiotico Exaiptasia diaphana, il cui alto contenuto di acqua e quantità di muco ostruiscono i metodi molecolari. Qui viene presentata una procedura ChIP specializzata, che facilita lo studio delle interazioni proteina-DNA nella regolazione genica di E. diaphana . Le fasi di reticolazione ed estrazione della cromatina sono state ottimizzate per un’immunoprecipitazione efficiente e quindi convalidate eseguendo ChIP utilizzando un anticorpo contro il marchio istonico H3K4me3. Successivamente, la specificità e l’efficacia del test ChIP sono state confermate misurando l’occupazione relativa di H3K4me3 attorno a diversi loci genici attivati costitutivamente utilizzando la PCR quantitativa e il sequenziamento di nuova generazione per l’analisi su scala genomica. Questo protocollo ChIP ottimizzato per l’anemone di mare simbiotico E. diaphana facilita lo studio delle interazioni proteina-DNA coinvolte nelle risposte dell’organismo ai cambiamenti ambientali che colpiscono gli cnidari simbiotici, come i coralli.
Introduction
Il rapporto 2022 dell’Intergovernmental Panel on Climate Change (IPCC) evidenzia che, nonostante la crescente consapevolezza e gli sforzi di mitigazione, ondate di calore marine sempre più intense e frequenti stanno mettendo le barriere coralline ad alto rischio di sbiancamento esteso e mortalità di massa entro i prossimi decenni1. Al fine di informare gli sforzi di conservazione e ripristino della barriera corallina, gli effetti attuali e previsti del cambiamento delle condizioni ambientali sugli cnidari bentonici sono oggetto di studio su più livelli biologici per comprendere i meccanismi sottostanti della risposta e della resilienza2.
La disponibilità di strumenti di ricerca applicabili agli cnidari bentonici è fondamentale per affrontare questa sfida e lo sviluppo di questi strumenti richiede uno sforzo attivo per trasferire agli organismi marini conoscenze e tecnologie consolidate in altri campi3. Gli ostacoli al lavoro con molte specie di coralli sono in parte alleviati utilizzando sistemi modello, come l’anemone di mare Exaiptasia diaphana (comunemente indicato come Aiptasia)4. Questi anemoni di mare a crescita rapida e facoltativamente simbiotici sono relativamente facili da allevare in condizioni di laboratorio, si riproducono sia sessualmente che asessualmente e mancano dello scheletro di carbonato di calcio5. Il genoma di riferimento5 di E. diaphana facilita l’uso di metodi epigenetici che richiedono il sequenziamento. Tuttavia, caratteristiche come un alto contenuto di acqua, la produzione di muco e basse quantità di tessuto per individuo sono sfide per la creazione di protocolli replicabili, frenando così la ricerca epigenetica su E. diaphana e altri cnidari con caratteristiche simili.
Le modifiche epigenetiche possono alterare il fenotipo senza modificare la sequenza nucleotidica genomica di un organismo, regolando i processi associati alla cromatina6. La regolazione epigenetica degli Cnidari è per lo più studiata nei contesti della storia evolutiva e dello sviluppo 7,8,9,10, dell’instaurazione e del mantenimento della simbiosi 11,12,13 e della risposta ai cambiamenti ambientali 14,15. In particolare, sono state osservate variazioni nei modelli di metilazione del DNA, che, nella maggior parte dei casi, comportano l’aggiunta di un gruppo metilico a una base di citosina, in risposta a condizioni ambientali mutevoli come il riscaldamento13 e l’acidificazione degli oceani16. È stato anche dimostrato che i modelli di metilazione del DNA sono ereditabili intergenerazionalmente, sottolineando il ruolo dell’epigenetica nell’acclimatazione dei coralli ai fattori di stress ambientale17. Rispetto alla metilazione del DNA, ci sono stati relativamente pochi studi su altri importanti regolatori epigenetici, come gli RNA non codificanti 11,18,19, i fattori di trascrizione 9,10 o le modificazioni post-traduzionali degli istoni (PTM) negli cnidari20. Lo studio delle proteine associate al DNA è particolarmente impegnativo in quanto i metodi disponibili richiedono l’accesso a un genoma di riferimento dell’organismo in studio e sono costosi a causa delle grandi dimensioni dei campioni e degli anticorpi ad alta specificità necessari3. Con un’ampia varietà di gruppi chimici che formano PTM in corrispondenza di specifici residui istonici, comprendere i paesaggi di modificazione della cromatina negli cnidari, specialmente nel contesto di imminenti stress ambientali, rimane una grande sfida.
Lo scopo di questo lavoro è quello di far progredire lo studio dei PTM istonici, delle varianti istoniche e di altre proteine associate alla cromatina negli cnidari presentando un protocollo ottimizzato di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) per il modello di corallo E. diaphana (protocollo originale di Bodega et al.21). La ChIP può essere combinata con la PCR quantitativa per caratterizzare le interazioni proteina-DNA locus-specifiche o con il sequenziamento di nuova generazione (NGS) per mappare queste interazioni nell’intero genoma. In generale, le proteine e il DNA sono reversibilmente reticolati in modo che la proteina di interesse (POI) rimanga legata allo stesso locus a cui è associata in vivo. Mentre il comune metodo di reticolazione ampiamente utilizzato nel sistema modello di mammifero è solitamente mantenuto a 15 minuti o meno a temperatura ambiente, l’approccio di reticolazione è stato ottimizzato per consentire alla formaldeide di penetrare attraverso il muco prodotto da E. diaphana in modo più efficace. Il tessuto viene quindi congelato in azoto liquido, omogeneizzato e lisato per estrarre i nuclei dalle cellule. La perdita di materiale in queste fasi viene evitata utilizzando un solo tampone di lisi e poi passando direttamente alla sonicazione, che frammenta la cromatina in frammenti lunghi ~300 bp. Questi frammenti vengono incubati con un anticorpo specifico per il POI fino a una precisione a livello di PTM. L’immunocomplesso anticorpo-proteina-DNA viene precipitato utilizzando sfere magnetiche che si legano agli anticorpi primari, selezionando così solo i segmenti di DNA associati al POI. Dopo l’inversione del cross-link e la pulizia del precipitato, i segmenti di DNA prodotti possono essere utilizzati per la qPCR o la costruzione di librerie di DNA per il sequenziamento per mappare i segmenti su un genoma di riferimento e, quindi, identificare i loci a cui è associato il POI. Maggiori dettagli sulle considerazioni per ogni passaggio sono disponibili in Jordán-Pla e Visa22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Seguendo il protocollo di cui sopra, il DNA ottenuto è stato utilizzato con successo per ChIP-qPCR e ChIP-Seq. Lo stesso profilo di picco generale per H3K4me3 precedentemente riportato da altri organismi 26,27,28 è stato ottenuto qui, con il picco più alto intorno alla TSS e un alto arricchimento nei siti attesi nella ChIP-qPCR. Il numero relativamente elevato di letture mappate multiple nei dati ChIP-Seq potrebbe essere stato causato da duplicati PCR. La quantità di letture mappate in modo univoco potrebbe essere aumentata modificando il protocollo di preparazione della libreria di DNA per ridurre i duplicati PCR. Esistono diversi metodi di normalizzazione per i dati ChIP-qPCR, con la percentuale del metodo di input qui presentato che è più comunemente usato. Questo metodo normalizza l’IP e simula i campioni direttamente all’input, con lo svantaggio che l’input viene elaborato in modo diverso dall’IP e dai campioni simulati durante il ChIP, il che può introdurre errori. Il metodo alternativo di arricchimento del fold normalizza il segnale dell’IP in base al segnale del mock utilizzando gli stessi set di primer, fornendo così un rapporto segnale-sfondo. Tuttavia, l’intensità del segnale del campione simulato può variare notevolmente, il che, a sua volta, ha grandi effetti sui dati. Una discussione dettagliata sulla ChIP-qPCR e sulla normalizzazione dei dati può essere trovata in Haring et al.29.
Un importante aggiustamento nel metodo presentato sopra rispetto ai comuni protocolli ChIP è il tempo di reticolazione molto più lungo, da circa 15 minuti per le proteine istoniche a un’incubazione notturna. Lo scopo principale di questo aggiustamento è quello di facilitare la penetrazione della formaldeide fissativa attraverso lo strato di muco nel tessuto più profondo di E. diaphana per preservare le interazioni proteina-DNA all’interno del nucleo. L’ottimizzazione di questa fase è fondamentale per garantire una reticolazione sufficiente a preservare le interazioni proteina-DNA senza reticolare così tanto da rendere inefficace il taglio della cromatina mediante sonicazione. Anche l’aggiunta di detergenti come l’SDS può aumentare l’efficienza della sonicazione29. Inoltre, è stato riscontrato che una lunga incubazione con formaldeide facilita la fase di omogeneizzazione e ha portato a un campione macinato più finemente e uniformemente rispetto agli anemoni freschi o congelati che sono stati omogeneizzati prima della fase di reticolazione. Gli intervalli raccomandati di lunghezza dei frammenti variano tra 100 bp e 1.000 bp29,30 e possono dipendere dalla proteina bersaglio. È fondamentale che ogni utente ottimizzi le condizioni di sonicazione per raggiungere la lunghezza del frammento desiderata con la minor potenza di sonicazione possibile, poiché un’eccessiva sonicazione può denaturare le proteine e, quindi, influire sull’IP31. Un’altra limitazione della ChIP è la quantità di materiale richiesto, che colpisce in particolare organismi relativamente piccoli come gli anemoni; Questo problema è stato risolto riducendo la perdita di campione tra i passaggi. Dopo aver omogeneizzato il campione, è stato immediatamente lisato, omettendo così diverse fasi comuni di preparazione dei nuclei. Il pool di campioni ottenuto da 20 anemoni conteneva generalmente abbastanza cromatina per tre IP e controlli sia di simulazione che di input. La quantità di materiale di partenza (cioè il numero di anemoni) potrebbe essere ulteriormente ridotta in futuro, specialmente quando si esegue una ChIP con una sola proteina bersaglio. A seconda del metodo a valle previsto, i controlli dovrebbero essere adeguati; per ChIP-qPCR, dovrebbe essere considerato per includere controlli aggiuntivi29, mentre per ChIP-seq, il mock può essere omesso a favore di un controllo di input.
Sebbene la validazione degli anticorpi sia al di fuori dell’ambito di questo protocollo e sia stata, quindi, solo brevemente accennata qui, è un passaggio critico prima di eseguire ChIP. Soprattutto quando si utilizzano anticorpi commerciali su specie di invertebrati, la disponibilità di anticorpi specifici per i bersagli desiderati può essere una limitazione. Nella prima fase, la sequenza della coda H3 N-terminale di E. diaphana e di altri organismi modello, tra cui zebrafish e topi, è stata confrontata e si è scoperto che era altamente conservata12. La specificità dell’anticorpo è stata quindi testata utilizzando l’immunofluorescenza, che ha co-localizzato i segnali dell’acido nucleico e dell’anticorpo. Il profilo di picco di H3K4me3 attorno al TSS ottenuto dai dati di sequenziamento fornisce ulteriore sicurezza riguardo alla specificità dell’anticorpo.
Un’altra considerazione riguardante la specificità degli anticorpi è la possibilità di qualsiasi interazione con i dinoflagellati simbiotici che E. diaphana, così come molti altri antozoi, ospitano nelle loro cellule. Le analisi del trascrittoma nei dinoflagellati dei generi Lingulodinium32 e Symbiodinium33 hanno trovato geni codificanti istoni, tra cui l’istone H3 centrale e diverse varianti di H3 a bassi livelli di espressione, e l’entità della conservazione funzionale del codice istonico non è chiara34. Marinov e Lynch34 hanno confrontato la conservazione della sequenza delle code N-terminali della variante H3 all’interno e tra le specie di dinoflagellati, e le specie di Symbiodiniaceae hanno mostrato un’elevata divergenza intorno alla lisina 4 nella sequenza della coda, specialmente se si considera la congruenza degli amminoacidi adiacenti alla lisina 4 come fattore. È stato anche dimostrato che questa regione diverge da altre specie modello come Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster e Saccharomyces cerevisiae, che corrispondono alla sequenza di E. diaphana12. Pertanto, il rischio di interazione non intenzionale dell’anticorpo contro H3K4me3 con il dinoflagellato H3 è basso. Inoltre, le sequenze sono allineate solo al genoma di E. diaphana e i primer qPCR dovrebbero essere specifici per le sequenze di E. diaphana , fornendo un ulteriore strato di filtrazione di eventuali sequenze precipitate involontariamente.
Il protocollo ChIP presentato produce DNA sufficiente per la qPCR e il sequenziamento di nuova generazione e, sebbene sia probabilmente necessaria l’ottimizzazione individuale da parte di ciascun utente, fornisce un punto di partenza per l’aumento dell’indagine sulle interazioni proteina-DNA negli cnidari bentonici, possibilmente nel contesto della simbiosi e dei cambiamenti ambientali.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nessuno.
Materials
| 1 kb Plus DNA Ladder | Invitrogen | 10787018 | |
| 100% Ethanol | |||
| 15 mL falcon tubes | |||
| 16% Formaldehyde Solution (w/v), Methanol-free | Thermo scientific | 28906 | |
| 5 mL tube | |||
| 5PRIME Phase Lock tubes | Quantabio | 2302820 | Phase lock gel – light |
| AGANI needle 25 G | Terumo | AN*2516R1 | |
| Agarose | |||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Bowtie | open source, available from https://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml | ||
| Branson sonifier 250 | Branson | Sonicator | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430 R | With rotors for 15 mL and 1.5 mL tubes |
| ChIP-grade antibody (here polyclonal H3K4me3 antibody) | Diagenode | C15410003 | |
| Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | 2 tablets/mL water for 100x stock |
| Cover glass | vwr | 48393 194 | |
| Disposable Spatula | vwr | 80081-188 | |
| DNA purification kit (here QIAGEN QIAquick PCR purification kit) | QIAGEN | 28104 | |
| Dounce tissue grinder | Wheaton | tight pestle | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) 1x | gibco | 14190-094 | |
| Dynabeads Protein G | Thermo Fisher Scientific | 10004D | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3609 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | 324626 | |
| Electrophoresis system | |||
| Ethidium bromide | |||
| FASTQC v0.11.9 | software | ||
| Gel Doc EZ Documentation System | Bio-Rad | 1708270 | Gel imaging system |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 50046 | |
| Injekt-F Tuberculin syringe 1 mL | B. Braun | 9166017V | |
| Linear acrylamide (5 mg/mL) | Invitrogen | AM9520 | |
| Low-retention 1.5 mL tube | |||
| Magnetic separation rack | for 1.5 mL tubes | ||
| Microscope | |||
| Microscope slide | |||
| Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS) | open source | ||
| Mortar and pestle, porcelain | |||
| NanoDrop 2000c spectrophotometer | Thermo scientific | ND-2000C | |
| N-lauroylsarcosine | Sigma-Aldrich | 61739 | |
| Nuclease-free water | |||
| Pasteur pipette | |||
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol Mixture (25:24:1) | Sigma-Aldrich | 77617 | |
| Proteinase K (20 mg/mL) | Ambion | AM2546 | |
| Purple Loading Dye 6x | New England BioLabs | B7024S | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
| RNase Cocktail Enzyme Mix | Invitrogen | AM2286 | RNase A = 500 U/mL, RNase T1 = 20000 U/mL |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | |
| TAE buffer | |||
| Thermomixer | Eppendorf | 5384000012 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
| Triton X-100 solution | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | Danger: may cause cancer. Suspected of damagin fertility or the unborn child |
| Tube rotator SB3 | Stuart | ||
| UltraPure SDS Solution, 10% | Invitrogen | 15553027 | |
| Vacuum pump |
References
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