从快速冷冻肝组织中分离细胞核用于单细胞多组学

所有动物实验均按照德国动物福利立法和上巴伐利亚州政府的规定进行。动物饲养是根据《德国动物福利法》第11条批准的，并按照指令2010/63 / EU执行。 1. 组织准备 通过颈椎脱位处死3个月大至22个月大的雄性C57BL / 6J小鼠。将动物放在解剖板上，用别针固定四肢，并用 70% 乙醇对腹部进行消毒。 按照Treuting等人的建议进行尸检16。打开腹部直至胸腔，观察肝脏，然后用镊子小心地取出肝脏，不要刺穿小叶。 用镊子握住横膈膜并用剪刀去除连接组织来提取完整的肝脏。 用冷磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗器官，用干净的纸巾拍干，然后将肝小叶切成几块用于不同目的：FF用于单核分离和多组学;多聚甲醛固定（10%PFA）用于石蜡包埋;和/或嵌入最佳切割温度（OCT）化合物中，以进行进一步的组织学分析（图1A）。 将肝脏碎片分装到冷冻管或 5 mL 螺旋盖管中，并立即在液氮中快速冷冻。将冷冻肝脏样品储存在-80°C，用于下游单核多组学实验（图1B，C）。注意：冷冻保存的组织可以在-80°C下安全储存数年，并且在使用前应始终在-80°C的干冰上运输。 2. 细胞核分离 台式清洁以及缓冲液和耗材的制备用 70% 乙醇和 RNase 净化溶液清洁工作台和移液器，或使用专用的无 RNase 台面和材料。 将水平吊篮和固定角度离心机、1.5 mL/2 mL 管和多孔板预冷至 4 °C，详情如下。 在干冰（-60°C）上预冷用于组织处理的无RNase一次性镊子，一次性无菌手术刀和培养皿。 将Dounce玻璃均质器和杵在冰上预冷（4°C）。将每个研杵（A 和 B）放入 5 mL 管中，以避免直接接触冰和潜在的 RNase 污染。 制备碘沙醇培养基（IDM）的稀释液（表1A），并用它来对60%碘沙醇储备密度梯度培养基进行50%和29%的稀释（分别为表1B和表1C）。 预冷所有试管。对于要处理的每个样品，请准备以下试管：准备三个 1.5 mL 低 DNA 结合管（一个用于过滤的组织匀浆，第二个用于 250 μL 50% 稀释的碘沙醇溶液，第三个用于清洁的细胞核悬浮液）。 准备一个含有 500 μL 29% 稀释度碘沙醇溶液的 2 mL 圆底管，用于密度梯度分离。 为细胞核分离培养基-2 （NIM-2） 和匀浆缓冲液 （HB） 准备一个 15 mL 锥形管。 制备细胞核分离介质-1（NIM-1）（表1D），并用它来制备NIM-2（表1E），然后制备HB（表1F）。在使用前添加两种RNAse抑制剂，如下文方案所述。 如 表1G所述制备细胞核储存缓冲液（NSB）。使用前加入重组RNA酶抑制剂。在用于 FACS 分选之前，将基于蛋白质的 RNA 酶抑制剂添加到 NSB 中（可选）。 在组织均质化后，用无菌水准备一个 500 mL 烧杯，浸泡 Dounce 均质机和杵，以实现均质机的最佳清洁和维护。 组织均质化在干冰上的培养皿内用预冷的手术刀切割20-30毫克（或5毫米3）的组织片。然后，立即将培养皿转移到湿冰（4°C）中。加入 1 mL HB，并使用冷手术刀尽可能切碎组织，使其易于用 1 mL 宽孔尖端吸出。注意：始终使用宽孔尖端进行所有组织/细胞核转移。作为替代方案，可以用无菌手术刀在无菌塑料盖上切割 1 mL 吸头以产生宽孔（图 2A）。 收集组织悬浮液，并将其转移到预冷的2 mL玻璃Dounce均质器中（图2B）。 用额外的 0.5-1 mL HB 清洗培养皿，并收集所有剩余的组织碎片，同时将所有东西放在冰上。 用松散的杵 A 在冰上缓慢而小心地做五笔。上下拉杵时，使用杵的扭转动作避免产生气泡。确保杵在每次冲程时小心地从均质器的顶部移动到底部。 随后，用紧杵 B 在冰上进行10-15次缓慢的划动。避免产生气泡。注意：建议在用研杵 B 划10次后在显微镜下目视检查细胞核，以确定是否需要更多笔划。通过使用台盼蓝染色（台盼与样品的比例为 1：1）和手动血细胞计数器（例如，将 10 μL 台盼蓝与 10 μL 细胞核悬浮液混合，并使用 10 μL 混合物在显微镜下检查; 图 2C）。 通过 50 μm 细胞过滤器过滤匀浆，同时将其转移到预冷的 1.5 mL 管中。对含有大量结缔组织团块的匀浆使用多个过滤器和/或管。 冲洗均质器和过滤器，并用额外的 0.5-1 mL HB 彻底收集所有组织匀浆。进行密度梯度离心。 密度梯度离心将过滤后的匀浆在预冷的固定角度离心机中以1，000×g 在4°C下离心8分钟。 样品旋转时，制备一个含有 250 μL 50% 碘沙醇稀释液的 1.5 mL 管和一个含有 500 μL 29% 碘沙醇稀释液的 2 mL 管。将两个管子放在冰上。 离心后，使用真空泵在不干扰沉淀的情况下吸出上清液。注意：使用手动移液会影响最终细胞核悬浮液的质量。 使用 1 mL 宽孔移液器吸头向沉淀中加入 250 μL HB，然后非常缓慢地重悬。 将 250 μL 细胞核悬浮液转移到含有 250 μL 50% 碘沙醇稀释液的预冷 1.5 mL 管中，轻轻但彻底地混合以产生 25% 碘沙醇/细胞核悬浮液。 将 500 μL 的 25% 碘沙醇/细胞核悬浮液转移到含有 500 μL 29% 碘沙醇稀释液的预冷 2 mL 管中。注意：将 500 μL 的 25% 碘沙醇/细胞核悬浮液轻轻沉积在 500 μL 29% 碘沙醇溶液的顶部，以使 25%/29% 碘沙醇混合物显示出清晰的相分离。使用管壁的侧面，将移液器吸头定位为45°角，以创建此梯度界面。从那时起，必须轻柔地处理管子，以免干扰这种梯度。 将试管在预冷的摆动桶离心机中以 12，500 g 离心 20 分钟，制动器设置为 OFF。 在离心步骤完成之前，在进行scRNA-seq管道时将RNAse抑制剂添加到NSB缓冲液中（参见 表1G）。 离心后，使用真空泵在不干扰沉淀的情况下吸出上清液。注意：使用手动移液会影响最终细胞核悬浮液的质量。 使用 1 mL 宽孔移液器吸头，将沉淀轻轻重悬于 100-300 μL NSB 中，并将细胞核悬浮液转移到干净的预冷 1.5 mL 管中。 使用台盼蓝溶液（台盼与样品的比例为 1：1）和手动血细胞计数器（例如，将 10 μL 台盼蓝与 10 μL 细胞核悬浮液混合，并使用 10 μL 混合物进行计数; 图 2D）。 立即使用获得的细胞核悬浮液进行单核基因组学测定。注意：NSB中的细胞核悬浮液可以在4°C下冷藏长达1周，以便通过流式和/或成像流式细胞术进行进一步分析，但不能用于snRNA-seq或snATAC-seq。 3. 用于肝细胞倍性分析或基于良好的测序方法的细胞核分选 对于基于流式细胞术的细胞分选，通过 50 μm 过滤器将细胞核悬浮液过滤到预冷的 5 mL FACS 管中。 使用装有 100 μm 喷嘴的流式细胞术分选仪。将FACS管装载到分选机上，并预览样品。 为细胞核分选设置门控策略，从散射门开始，绘制前向散射区域与侧向散射区域 （FSC-A/SSC-A），然后是 Hoechst-高度与 Hoechst-区域（细胞核门），然后是 Hoechst-宽度与 Hoechst-区域（单线门）。在赫斯特面积直方图上可视化细胞核倍性剖面。注意：为了获得更好的峰分辨率，请在线性刻度上可视化Hoechst通道（450/50）（图3A）。 对于分选到 96/384 孔板中，设置液滴延迟，并使用联苯胺底物-辣根过氧化物酶 （TMB-HRP） 的比色法优化板对齐，如前所述 6. 将样品冷却和板架设置为在4°C冷却，样品旋转以300rpm打开。 以 ~1 x 105 个细胞核/mL 的样品浓度和 200-500 个事件/秒的流速对单个细胞核进行分选。 4. 通过成像细胞术对核参数进行目视检查和定量（可选） 加载含有 50 μL 细胞核悬浮液的 0.5 mL 管，浓度为 2 ×10 7 个细胞核/mL。 根据纵横比与Hoechst荧光通道设置 所有事件 门，以可视化细胞核倍性轮廓（图3B）。 使用明场 （BF） 和 Hoechst 荧光通道以 40 倍放大倍率采集样品。 使用成像细胞术软件使用明场测量和Hoechst荧光强度检查和定量2n和4n细胞核（图3C）。 5. 单核RNA-seq、ATAC-seq或多组文库构建和测序 对于基于液滴的snRNA-seq方法，将纯化的细胞核悬浮液直接加载到微流体装置中，以进行自动平行分配和分子条形码17。 在单细胞分区装置中完成微流控运行后，收集凝胶珠包封的细胞核，孵育并清洁，如制造商指南17中所述。 使用以下程序对cDNA预扩增进行11个聚合酶链反应（PCR）循环：在98°C下3分钟，（在98°C下15秒，在63°C下20秒，在72°C下1分钟）x 11，在72°C下1分钟，并在4°C下保持。 继续末端修复和A尾步骤和适配器连接，如制造商17所示。对于随后的最终基因表达文库构建，使用以下程序执行10个PCR循环：98°C下45秒，（98°C下20秒，54°C下30秒，72°C下20秒）x 10，72°C下1分钟，并保持在4°C。 将获得的文库排序为每个核~20，000-50，000个平均读取。 对于基于液滴的联合多组学（RNA + ATAC）测序，将肝核在裂解缓冲液中孵育5分钟，然后标记它们1小时，如前所述18。 将标记的细胞核直接加载到微流体装置中，以进行自动平行分区和分子条形码。 微流体运行完成后，收集凝胶珠包封的细胞核，孵育并按照制造商18的说明进行清洁。 使用以下程序对cDNA预扩增步骤进行六个PCR循环：72°C下5分钟，98°C下3分钟，（98°C下20秒，63°C下30秒，72°C下1分钟）x 6，72°C下1分钟，并保持在4°C。 取 35 μL 预扩增的样品，并按如下方式进行 cDNA 扩增：98 °C 下 3 分钟，（98 °C 下 15 秒，63 °C 下 20 秒，72 °C 下 1 分钟）x 6，72 °C 下 1 分钟，并保持在 4 °C。 继续末端修复和A尾步骤和适配器连接，如制造商18 所示。对于随后的最终样品索引PCR，执行15个PCR循环，如下所示：98°C下45秒，（98°C下20秒，54°C下30秒，72°C下20秒）x 15，72°C下1分钟，并保持在4°C。 对于ATAC文库的构建，请使用40μL，并使用以下程序扩增六个PCR循环以进行样品索引：98°C下45秒，（98°C下20秒，67°C下30秒，72°C下20秒）x 6，72°C下1分钟，并保持在4°C。 按照制造商的建议，将获得的多组基因表达文库测序为每个细胞核 20，000 个读取对的最小读取深度，将多组 ATAC 文库的最小读取深度为每个细胞 25，000 个读取对18。