Ensaio de Sedimentação à Base de Concanavalina A para Medir a Ligação ao Substrato de Fosfatases Glucanas

As fosfatases glucanas são membros de uma subfamília funcionalmente diversa de fosfatases de dupla especificidade (DSPs) dentro da^{superfamília 1} da proteína tirosina fosfatase (PTP). Eles têm sido encontrados na maioria das formas de vida, incluindo organismos fotossintéticos amplamente divergentes, humanos, vertebrados e alguns invertebrados e protistas ^2,3,4. As plantas contêm três fosfatases glucanas conhecidas: Starch Excess4 (SEX4), Like Sex Four1 (LSF1) e Like Sex Four2 (LSF2)^5,6,7. Plantas que não possuem fosfatases glucanas apresentam taxas reduzidas de degradação transitória do amido e acúmulo de amido nas folhas ^8,9. A laforina é o membro fundador da família das fosfatases glucanas, que desfosforila glicogênio em vertebrados e humanos ^3,10. As mutações da laforina resultam em doença de Lafora neurodegenerativa, uma forma autossômica recessiva fatal de epilepsia¹¹. As fosfatases glucanas são necessárias para o metabolismo do glicogênio e amido e têm emergido como enzimas importantes para a modulação do conteúdo de amido em plantas e tratamento da doença neurodegenerativa de^Lafora12,13. Estudos recentes de cristalografia de raios X em fosfatases de glucanas com substratos modelo de glucanas têm lançado luz sobre a ligação de substratos e o mecanismo catalítico da desfosforilação de glucanos^14,15,16,17. No entanto, a compreensão atual de como as fosfatases glucanas se ligam a seus substratos fisiológicos é incompleta.

O amido é um polímero insolúvel de glicose à base de amilopectina a 80%-90% e amilose a 10%-20%¹⁸. Os substratos para as fosfatases glucanas vegetais são moléculas de carboidratos fosforilados, como glicogênio e grânulos de amido. Os resíduos de glucosil fosforilados estão presentes a uma razão fosfato:resíduo de glucosil de 1:600. Curiosamente, os fosfatos estão presentes apenas nas moléculas de amilopectina¹⁹. A principal planta glucana fosfatase SEX4 atua no grânulo de amido para desfosforilar moléculas de amilopectina. A estrutura cristalina de raios X do SEX4 combinada com estudos de mutagênese guiada por estrutura demonstrou as especificidades únicas do substrato do SEX4 para diferentes posições dentro de uma estrutura glucana¹⁵. Recentemente, demonstramos que a atividade biologicamente relevante do SEX4 só pode ser observada quando atua sobre seus substratos de amilopectina solubilizados²⁰. No entanto, o entendimento das interações glucano-SEX4 tem se mostrado difícil devido à complexidade estrutural do substrato, especificidades de ligação mais amplas e baixas afinidades de ligação entre a proteína e seus substratos. Essas questões têm dificultado a capacidade de utilizar métodos comumente usados em interações proteína-ligante, tais como calorimetria de titulação isotérmica (ITC), espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) e ensaios baseados em ensaio imunoenzimático (ELISA).

Curiosamente, muito da nossa compreensão das interações carboidrato-proteína veio do estudo de lectinas. Concanavalina A () é uma leguminosa da família de proteínas extraídas originalmente do feijão-de-porco. O liga carboidratos com alta especificidade, o que é vantajoso para seu uso em aplicações de direcionamento e liberação de medicamentos. A ligação do a uma variedade de substratos contendo α-D-manosil e α-D-glicosil não redutores tem sido extensivamente estudada^19,20. Esferas de Sepharose ligadas a comercialmente disponíveis são comumente usadas para purificar glicoproteínas e glicolipídios²¹. O liga-se a essas glucanas via grupos hidroxila C3, C4 e C6 dos resíduos de glicose. As esferas de-Sepharose também têm sido usadas com sucesso para medir a ligação das interações glicogênio-proteína e amido-proteína^22,23. Neste estudo, usamos esferas-Sepharose para desenvolver um ensaio de ligação para medir as especificidades de ligação das interações fosfatase-amilopectina glucana.

Anteriormente, um ensaio de sedimentação baseado em foi empregado para avaliar a capacidade de ligação ao substrato da fosfatase glucana^14,20,24. Neste estudo, a mesma estratégia foi usada para desenvolver um novo método para determinar a afinidade de ligação das interações glucano-glucana fosfatase e carboidrato. Este método também tem uma vantagem para investigar várias interações carboidrato-proteína solubilizadas.