機能性破骨細胞のヒト末梢血CD14⁺ 単球との鑑別

スコットランド国立輸血サービス(エジンバラ)から入手したバフィーコートとNHS血液移植(ニューカッスル)から入手した白血球円錐形は、完全に同意したNHS献血者から完全に匿名化された(識別できない)形式でグラスゴー大学の研究者に提供されます。バフィーコートと白血球コーンの血液成分は、スコットランドまたはイギリスのNHS献血センターで行われたNHS標準献血から製造されます。献血者は、承認された医学研究に使用される標準的なNHS臨床診療で使用されていない余剰血液について、献血時にインフォームドコンセントを与えます。NHS研究倫理委員会からの倫理的承認と、これらの献血を使用するための署名されたドナー同意書は、NHS献血サービスによって保持されます。承認された医学研究でこれらの同意された献血にアクセスして使用する承認が求められ、国立輸血サービス(スコットランド)およびNHS血液輸送(イングランド)の標準的な内部申請およびレビュープロセスを使用して取得されました。承認された医学研究に血液成分を使用するために、それ以上のNHS REC承認またはグラスゴー大学内部倫理委員会の承認は必要ありませんでした。 1. 開始前の一般的な注意事項 すべての作業を慎重に血液で進めてください。サンプルに存在する可能性のあるさまざまな感染性病原体の潜在的な危険性を考慮してください。 バイオセーフティ研究所では、手袋と白衣を着用しながら、無菌条件下ですべての作業を慎重に行ってください。 地域のガイドラインに従ってバイオセーフティー廃棄を実施してください。 地方自治体の規制に従って、サンプルを収集する前に適切な同意と倫理的承認を取得します。 一般に、1mLの新鮮な血液は100万PBMCを生成し、CD14 +単球はPBMCの約10%〜30%を占めます。比較すると、10 mLの白血球円錐には、5 x 10 8-15 x10 8 PBMCを含めることができます。PBMC 分離の詳細については、前のプロトコル37 を参照してください。 2.全血からの末梢血単核細胞(PBMC)の分離 健康なドナーから必要な量の新鮮な血液をリチウムヘパリン収集チューブに収集します。注:適切な抗凝固剤を含む他の収集チューブも使用できます(例:.、ヘパリンナトリウムチューブ)。細胞数が多い場合は、白血球コーンまたはバフィーコートを使用できます。 PBMCを分離するには、血液を新しい50 mLチューブに移し、滅菌した1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で、新鮮な血液または白血球コーン/バフィーコート用にそれぞれ1:1または1:3の比率で希釈します。 反転によって細胞を数回穏やかに混合する。 3 mLの密度勾配培地を含む15 mLチューブを準備します。密度勾配培地の上部に8〜10 mLの希釈血液をゆっくりと重ね、ブレーキなしで室温(RT)で400 x g で30分間遠心分離します。注意: 混合を防ぐために、密度勾配媒体の上に血液を注意深く塗布します。混合すると、PBMC が失われる可能性があります。 最上層(血漿を含む)をパスツールピペットで慎重に廃棄し、PBMC(白色のリング状構造)を含む下層間層を収集し、この層を新しい50 mLチューブに移します。 滅菌した1x PBSで細胞を最大50 mLまで懸濁し、フルブレーキでRTで300 x g で10分間遠心分離して残留密度勾配培地を洗い流します。 残留血小板を除去するには、ブレーキなしでRTで10分間、200 x g でさらにゆっくりと回転させてこのプロセスを繰り返します。 オプション:赤血球のキャリーオーバーを除去するには、赤血球溶解バッファー(10x、 材料表)を蒸留水で1:10に希釈し、希釈バッファー3 mLをペレットに塗布します。混合し、3分間インキュベートします。ペレットを最大50 mLの1x PBSで洗浄し、フルブレーキでRTで300 x g で10分間遠心分離します。 単離および精製されたPBMCを20 mLの1x PBSに再懸濁し、血球計算盤または他の標準的な方法に従ってカウントします。注:細胞希釈および細胞計数方法は、使用する細胞密度および計数装置に基づいて適宜調整する必要があります。 3. PBMC由来のCD14+ 単球の濃縮 メーカーのプロトコル(材料表)に従って、ヒトCD14+選択キットを使用してPBMCからCD14+単球を分離します。注:古典的なCD14 + CD16− 単球は、OC前駆体35の主な供給源です。代替精製方法を検討することができる。 1 x 107 PBMCSを適切なポリスチレン丸底チューブ(つまり、選択キットマグネットに適合する)に移し、セルを300 x g で5分間ペレット化します。 上清を廃棄し、細胞ペレットを細胞分離バッファー(PBS、2%ウシ胎児血清[FBS]、1 mMエチレンジアミン四酢酸[EDTA])に最終濃度1 x 108 細胞/mLまで再懸濁し、蓋をした状態で100 μLあたり10 μLの抗体カクテルで10分間インキュベートします。注:細胞は1 x 108 細胞/ mLで再懸濁されます。それに応じて音量を調整します。 インキュベーション後、100 μLあたり10 μLの磁性ナノ粒子ビーズを添加し、蓋をした状態で3分間インキュベートします。注:抗体カクテルと磁気ビーズの容量を調整して、10 μL/mLの濃度を取得します。 細胞分離バッファーで容量を2.5 mLに補充し、チューブを磁石(蓋なし)に入れ、3分間インキュベートします。負の細胞集団を、チューブがまだ磁石内にある間に反転によって1つの連続移動によって破棄します。注意: >2 x 108 PBMCとより大きな磁石を使用する場合は、製造元の指示に従って、細胞分離バッファーを最大5 mLまたは10 mLまで補充します。 チューブを磁石から取り外し、磁気ビーズに付着した濃縮CD14+ 単球を2.5 mLの細胞分離バッファーに再懸濁して洗浄します。前と同じように磁石の中で3分間インキュベートし、負の画分を捨てて、もう一度繰り返します。 採取したすべての細胞を300 x g で5分間遠心分離し、上清を廃棄し、細胞を5 mLのアルファ最小必須培地(α-MEM; 資料表)1%のL-グルタミン、1%のペニシリン/ストレプトマイシン(完全なα-MEM)、および10Sを補給します。注:フローサイトメトリー による 濃縮後の純度チェックが推奨され、≥96%の純度が期待されます。追加の洗浄ステップ(ステップ3.6)は、純度を高めることができる。 4.インビトロでのOC分化 血球計算盤を使用して濃縮CD14+ 単球をカウントします。 細胞を300 x g で5分間ペレット化し、10Sを添加した完全α-MEMに1 x 106 細胞/mLで再懸濁します。 OCを分化させるには、M-CSFを最終濃度25 ng/mLで細胞懸濁液に加えます。注:1 mLの細胞懸濁液に対して、100 μg/mLのストック濃度から0.25 μLのM-CSFを追加します。 細胞懸濁液を完全にピペッティングして混合し、平底96ウェルプレートで100 μL/ウェルをプレート100 μL/ウェルでホモジナイズし、最終細胞密度1 x 105 セル/ウェルにします。 200 μL/ウェルの滅菌蒸留水をプレーティングセルの周囲のウェルに追加して、培地の蒸発と培養システムでのエッジ効果を防ぎます。 細胞を5%CO2と共に37°Cで約18〜20時間一晩インキュベートする。 一晩インキュベートした後、P200ピペットを使用して吸引して培地の半分(50 μL/ウェル)を慎重に除去し、ウェルの底に触れないようにし、10S、25 ng/mL M-CSF、および50 ng/mL RANKLを含む新鮮な温かい完全α-MEMと交換し、最終濃度は25 ng/mL です。注:1 mLの培地に対して、100 μg/mLのストック濃度から0.25 μLのM-CSFと0.5 μLのRANKLを追加します。 3日ごとに培地を交換し、細胞を7〜14日間OCに分化させます(図1)。注:M-CSFおよびRANKL濃度は、培養全体で一定に保ちます。 図1:OC差別化ワークフロー。 PBMCからのCD14+ 単球単球単離と、M-CSFおよびRANKLの存在下での成熟OCへの分化の概略図を7〜14日間。RT =室温。BioRender.com で作成された画像。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 5. 破骨細胞のTRAP染色 培地を注意深く取り出し、分化した付着性OCを100 μL/ウェルの固定液で固定し、1分間インキュベートします。付着細胞を傷つけないように、ウェルの底に触れないでください。注:固定液は次のように調製されます:12.5 mLのクエン酸塩溶液(TRAP染色キットに含まれています)、32.5 mLのアセトン、および5 mLの37%ホルムアルデヒド。 300μLの滅菌蒸留水でウェルを3回洗浄します。洗浄後、プレートをタップして乾かします。 製造元の指示に従って染色溶液を調製します(材料表)。5 μLのファストガーネットと5 μLの亜硝酸ナトリウムを加えて、ファストガーネット溶液を作ります。転倒混和し、RTで3分間インキュベートします。 滅菌蒸留水900 μL、ナフトール10 μL、酢酸塩溶液40 μL、酒石酸塩溶液50 μL、ファストガーネット溶液10 μLを混合して、染色液1 mLを調製します。 新たに調製した染色液を100 μL/ウェル加え、プレートを37°Cの暗所で20分間インキュベートします。 インキュベーション後、反転により染色液を除去し、プレートを300 μL/ウェルの蒸留水で3回洗浄します。 ペーパータオルのプレートを軽くたたいて余分な水分を取り除きます。プレートを開いたままにして、光から保護して一晩風乾させます。注意: ドライプレートは最大6か月間保管できます。時々、残留緩衝液は顕微鏡下で見えるカビの発生を促進することができます。これは、影響を受けたウェルを蒸留水で洗浄し、再び風乾させることでいつでも除去できます。 タイルオプション付きの明視野顕微鏡を使用して10倍または20倍で画像を撮影し、ウェル表面全体をキャプチャします。 細胞カウンタープラグインを備えた画像解析ソフトウェアを使用して、3つ以上の核を持つTRAP+ 紫色染色細胞として識別されたOCを手動でカウントします。注:ウェルあたりのTRAP+ OCの数はドナーによって異なり、~200〜1,600 OC /ウェル、平均約1,000 OC /ウェルの範囲で変動する可能性があります。さらに、データを分析するには、OC数を3つの異なるウェル(技術的複製)で決定し、各条件および各生物学的複製について平均を計算する必要があります。 6.骨吸収アッセイ 新たに濃縮したCD14+単球をリン酸カルシウムでコーティングした96ウェルオステオアッセイプレートに1 x 105 細胞/ウェルでプレートし、ステップ4.1〜4.8に示すようにOCを7〜14日間分化させ、3日ごとに培地を交換します。注:象牙質/象牙または牛皮質骨スライスは、骨アッセイプレートの代わりに使用できます。もしそうなら、吸収される基質がより複雑であるため、培養の合計時間を14〜21日に延長する必要があります。 終了時点で、ウェルの底に触れないように培地を慎重に取り除き、10%次亜塩素酸ナトリウム溶液で細胞を溶解します。ウェルを蒸留水で3回洗います。 明視野顕微鏡で乾板をスキャンし、画像解析ソフトを用いて回収した吸収ピットの画像を解析/定量化します。 7. アクチン環蛍光染色 単離したCD14+単球のプレート100 μL/ウェルを18ウェルチャンバースライドに1 x 105 細胞/ウェルの細胞密度でプレートします。前述のように、M-CSFとRANKLの存在下でOCを区別します(ステップ4.1〜4.8)、3日ごとに培地を交換することを含みます。 終了時点で培地を静かに取り出し、200 μL/ウェルの予熱PBS、pH 7.4で各ウェルを2回洗浄します。どのステップの間にもウェルを乾かさないでください。 サンプルをPBS中の100 μL/ウェルの4%ホルムアルデヒド溶液で固定し、穏やかな振とうしながらオービタルシェーカーでRTで10分間インキュベートします。注意: メタノールは、固定プロセス中にアクチンを破壊する可能性があります。したがって、メタノール含有固定剤は避けるのが最善です。好ましい固定液はメタノールフリーホルムアルデヒドである。プロトコルのこのステップで使用されたオービタルシェーカーは、10のうち3の電力設定に設定されました。 200 μL/ウェルのPBSで2回洗浄し、PBSで希釈した0.1%Triton X-100溶液100 μL/ウェルで細胞を透過処理し、穏やかな振とうしながらオービタルシェーカーでRTで10分間インキュベートします。 200 μL/ウェルのPBSで2回洗浄します。非特異的結合をブロックしてシグナルを増加させるには、2%ウシ血清アルブミン(BSA)/PBS溶液で作製したブロッキング溶液100 μL/ウェルを追加します。穏やかな振とうでオービタルシェーカーでRTで20分間インキュベートします。 ブロッキング溶液を除去し、2% BSA/PBS溶液で希釈した蛍光結合ファロイジン溶液100 μL/ウェルを加えます。穏やかな揺れとうで光から保護されたオービタルシェーカーでRTで20分間インキュベートします。注意: メーカーの推奨に従ってファロイジン染料の濃度を調整します。 200 μL/ウェルのPBSで2回洗浄し、300 nM DAPIを含むPBS溶液100 μL/ウェルで核を染色し、光から保護された穏やかな振とうでオービタルシェーカーでRTで10〜15分間インキュベートします。注:DAPIを蒸留水で希釈して、14.3 mM(5 mg / mL)のDAPIストック溶液を作ります。原液をさらに最終濃度300μMに希釈する。最後に、300 μM DAPI溶液をPBSでもう一度希釈して最終濃度300 nMにします。 10〜15分後、DAPI溶液を取り出し、100 μL /ウェルPBSと交換します。注:選択したチャンバースライドに応じて、適切な容量のPBS(18ウェルチャンバースライドの場合は100 μL/ウェル)で保管するか、カバーガラスと適切な封入剤を使用してスライドを取り付けます。チャンバースライドは冷蔵庫で最大1週間保存できます。18ウェルチャンバースライドの場合、染色容量は50〜100 μL、洗浄には200〜300 μLを使用します。それに応じて、他のチャンバースライドサイズに合わせてスケールアップします。蒸発を避けるために、インキュベーション期間中はカバーガラスを蓋付きの容器の中に保管してください。オービタルシェーカーの使用をお勧めしますが、必須ではありません。 適切な免疫蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡と4倍から40倍の倍率を使用して染色を視覚化します。 8. フローサイトメトリーソーティング による 成熟OCおよびOC前駆体の濃縮 新たに濃縮したCD14+ 単球を1 x 106 細胞/mLで再懸濁し、上記と同じ方法でM-CSFおよびRANKLの存在下で成熟OCに分化させます(ステップ4.1-4.8)。注:96ウェルプレートからより大きなプレートサイズにスケールアップする場合は、 表1に従ってください。これらの容量は、1 x 106 細胞/mL溶液から計算され、細胞間融合に最適な密度を提供します。 7日目に、温かいPBSでウェルを1回洗浄し、1 mL(使用するプレートサイズによって決定される容量)に50 μLのアキュターゼを加えます。細胞を5%CO2 で37°Cで20分間インキュベートします。 インキュベーション後、光学顕微鏡でプレートをチェックして、細胞が剥離したかどうかを確認します。さらに、プレートを四方から軽くたたき、上下にピペッティングしてセルを切り離します。 細胞懸濁液を15 mLのコニカルチューブに集めます。ウェルを温かいPBS(Ca 2+なし、Mg2+なし)で洗浄し、それらを細胞懸濁液と組み合わせます。ほとんどのセルが剥離するまで、手順8.2〜8.3を1〜2回繰り返します。注:フローサイトメトリー分析で表面染色の前に推奨される方法であるアキュターゼは、非常に大きなOCを剥離しません。回収率は~50%-70%です。 細胞を300 x g で5分間遠心分離し、細胞ペレットを1 mLのPBSに再懸濁し、トリパンブルー排除により細胞をカウントします。 細胞を1 x 106 細胞/mLで再懸濁し、1 x 105 細胞に対応する100 μLを除去し、それらの細胞を新しいポリプロピレン試験管に移します。200 μLのセルソーティングバッファーを加え、染色されていないコントロールとして氷上に置いておきます。 残りの細胞を、RTで1:750で10分間希釈し、光から保護する生/死染料で染色します。注:高いバックグラウンド染色を避けるために、FBSがない場合にライブ/デッド染色を実行する必要があります。 生/死染色細胞懸濁液を入れた15 mLの回収チューブに、温かい細胞ソーティングバッファー(1x PBS、Ca 2+なし、Mg2+なし、1% FBS、および5 mM EDTA)を補充し、300 x gで5分間遠心分離して細胞をペレット化します。注:細胞凝集を防ぐために、ソーティングバッファーには高濃度のEDTAと低濃度のFBSが推奨されます。 1 x 105 セルに対応するボリュームを取り出し、OSCARアイソタイプコントロール用の新しいポリプロピレン試験管に移します。残りの細胞をすべて別のポリプロピレン試験管に移して、染色と細胞選別を行います。注:ポリプロピレン試験管は、細胞がポリスチレン管よりもこれらの管に付着する可能性が低いため、選別に使用されます。 チューブを400 x g で5分間回転させて細胞をペレット化し、余分な上清を転倒させて廃棄します。 この細胞ペレットを下記 表2に調製した抗体マスターミックス溶液に再懸濁する。オスカー抗体の代わりに、オスカーアイソタイプコントロールチューブをCD14抗体およびオスカーアイソタイプコントロールで染色します。 細胞を光から保護された4°Cで30分間インキュベートします。 30分後、5倍量のセルソーティングバッファーを加えて細胞を洗浄し、400 x g で4°Cで5分間遠心分離した。 細胞を300〜1,000 μLのコールドセルソーティングバッファーに再懸濁し、100μMノズルを備えたフローサイトメトリーソーティングマシンを使用して細胞を取得します。注:OCは非常に粘着性のある細胞であるため、選別する前に滅菌済みの70μmメンブレンでOCをろ過することが重要です。 OCとプレOCをCD14−OSCAR+としてゲートします。OSCARアイソタイプコントロールチューブに基づいてOSCAR+ ゲートを設定します。 選別した細胞を、8°Cで20Sを添加した完全なα-MEMを含むポリプロピレン試験管に集めます。 ソーティング後、300 x gでRTで5分間遠心分離して細胞をペレット化し、細胞をカウントし、ダウンストリームアプリケーション用に再懸濁します。注:通常、~1 x 105 ソートされたプレOC / OCを取得するには、0日目にメッキされた~10x 10 6 セルから始めます。低い回収率は、アキュターゼによる剥離中の細胞損失、および染色および選別のための処理によって影響を受ける。滅菌バッファーと試薬を使用して手順全体を実行し、滅菌条件下で作業することをお勧めします。 9.ミトコンドリア活性のATPアッセイ 濃縮されたCD14+ 単球を、前述ののと同じ方法で96ウェルプレートでM-CSFおよびRANKLの存在下でインキュベートします(ステップ4.1-4.8)。コントロールとして使用するために、4つの追加条件を3連でプレートします。 発光ATP検出アッセイキットを使用して、製造元のマニュアルに従ってATPアッセイを実施してください。簡単に説明すると、ATP溶液を調製するために、凍結乾燥基質に10mLの基質緩衝溶液を加え、RTで30分間インキュベートするために放置する。注:細胞内ATP産生を測定するために、さまざまな方法を使用できます。ここでは、発光によるATP産生の検出に用いた。 インキュベーション中に、コントロールを準備し、次のようにコントロールウェルに直接追加します:10 mMおよび100 mMの2-デオキシ-D-グルコース(2DG)、1 μMのオリゴマイシン、および1 μMのオリゴマイシンと組み合わせた100 mM 2DG。5%CO2で37°Cで30分間インキュベートします。注:2DGは解糖をブロックし、オリゴマイシンは酸化的リン酸化の阻害剤です。これら2つの阻害剤を組み合わせると、解糖と酸化的リン酸化 を介して ATP産生が完全に失われるため、ATPアッセイの内部コントロールとして機能します。10 mM および 100 mM 2DG コントロールの場合、100 μL 培養ウェルあたりそれぞれ 0.5 μL および 5 μL の 2M 2DG ストック溶液を追加します。1 μMのオリゴマイシンの場合、5 mMストック溶液を培地で1:100に希釈し、専用のコントロールウェルに2 μL/ウェルを加えます。最後のコントロールとして、ウェルあたり5 μLの2DGと2 μLの希釈オリゴマイシン溶液を追加します。 50 μLのATP溶液を各ウェルに加えて反応を停止し、光から保護された700 rpmのシェーカーでRTで5〜10分間インキュベートします。 上清100 μLをATPアッセイ専用の96ウェルホワイトボトムプレートに移し、ルミネセンスリーダーを使用してプレートを読み取ります。