使用扩增显微镜物理放大 整个果蝇 胚胎以进行超分辨率成像

该协议遵循阿肯色大学（UARK）关于无脊椎动物（如 果蝇黑腹果蝇）研究的指南，并得到了UARK机构生物安全委员会（协议#20001）的批准。 1. 果蝇 胚胎固定和脱膜化 注意：步骤1描述了手动去除卵黄膜的程序（手工剥离），卵黄膜是围绕胚胎的透明不透水膜。重要的是，手工剥离允许在ExM方案开始时选择适当分期的胚胎，从而大大提高了在ExM方案结束时以可用方向获得胚胎的可能性。然而，该ExM方案与批量胚胎收集和基于甲醇去除卵黄膜的标准程序完全兼容，在这种情况下，可以直接跳到步骤2（免疫荧光标记）。 准备或购买一些细玻璃针。针尖的实际尺寸并不重要，但要确保针头足够坚硬和锋利，足以刺穿固定胚胎的卵黄膜。使用微量移液管拉拔器从玻璃毛细管（外径1毫米，内径0.75毫米）制作针头，就像准备用于胚胎显微注射的针头一样18;或者，购买预拔针头。 使用标准 果蝇 技术19 收集胚胎，将>100成年 果蝇 放入用果汁/琼脂板20密封的通风塑料杯中。使用定时收集窗口富集适当阶段的胚胎16.例如，为了富集原肠胚形成（第6阶段）和收敛延伸（第7阶段）阶段，更换果汁平板，在25°C下收集胚胎2小时，然后取出平板，并在25°C下再老化2小时以获得~2-4小时大的胚胎。 为了从胚胎中除去蛋壳状绒毛膜，用50%漂白剂覆盖果汁板的表面（表1），用小画笔搅拌它们，将胚胎从琼脂表面释放出来，并等待3分钟使绒毛膜溶解。 使用画笔将去绒毛胚胎转移到含有 4 mL 庚烷（有机顶相）和 4 mL 固定缓冲液（水性底相; 表1）。从新鲜制备或最近打开的原液中新鲜稀释甲醛，并在添加胚胎之前立即与10x PBS和去离子水混合。注意：从多聚甲醛或玻璃安瓿中的16%EM级甲醛中制备甲醛。可以使用浓甲醛（例如，37%甲醛）的储备，尽管结果可能不太一致。 胚胎将积聚在有机相和水相之间的界面处。添加尽可能多的胚胎，以在界面处形成单层。如果将太多胚胎添加到小瓶中，它们也不会固定。 使用强力胶带，将闪烁瓶固定在桌面振荡器上，并以220rpm搅拌20分钟。为了获得最佳固定效果，在整个固定过程中，在有机相和水相之间保持强烈的乳液。 在固定期间，为每个样品准备以下其中一项。取一个塑料 6 厘米培养皿底座，其中一半装满 3% 琼脂，用剃须刀片或手术刀在琼脂中划出 ~5 cm x 3 cm 矩形。果汁/琼脂平板也可用于此目的。 使用小实验室刮刀，取出琼脂板。倒置培养皿的底部，并将其放在工作台上。将琼脂板放在倒置培养皿的顶部（图2A）。 取上培养皿的盖子，确保它是干燥的。戴上手套，在盖子内放一块双面胶带（胶带应略大于琼脂板; 图2B）。 从振荡器中取出小瓶，将它们直立放在工作台上，并让有机相和水相分离。正确固定的胚胎将保留在两个阶段之间的界面上。 使用装有乳胶灯泡的玻璃巴斯德移液管将固定的胚胎转移到琼脂板上。为防止胚胎粘附在移液管内部，请尽量将胚胎保持在移液管的窄颈内，并分多个小批量移植胚胎，而不是一次全部移植。一旦所有胚胎都在琼脂板上，使用P200移液器从胚胎周围除去大部分残留的庚烷。尽快（<3分钟）执行此步骤，以避免固定胚胎变干，这会对形态产生负面影响。 从~2cm的高度，用双面胶带将盖子放到琼脂板上，将胚胎粘附在胶带上（图2C）。轻轻地从琼脂板上取下盖子，将其倒置在工作台上，然后加入足够的PBS-吐温（表1）以覆盖盖子中的胚胎。 使用约100倍放大倍率和间接照明的立体解剖显微镜，使用形态学标记物识别正确分期的胚胎。对于第 6 阶段胚胎，使用可见的头沟和内陷的中胚层等标记物;对于第 7 阶段的胚胎，使用标记物，如延长的种带;对于第 11 阶段的胚胎，使用标记物，如完全延伸的胚芽和沿头尾轴16 的可见分割。为了收集所需的胚胎，首先用细玻璃针刺破胚胎前端或后端附近的卵黄膜（胚胎周围的透明椭圆形膜）;随着压力的释放，膜会稍微放气。然后，使用细镊子或金属探针，轻轻地将另一端的胚胎推入孔中;卵黄膜将保持粘附在双面胶带上。将不需要的胚胎粘附在胶带上。 定期用玻璃巴斯德移液管收集漂浮的脱皮脱脂化胚胎，并将它们移动到1.5mL微量离心管中。 此时，请执行以下步骤之一。直接进行免疫荧光标记步骤。脱膜的胚胎可以直接进入封闭溶液（步骤2.2）。在进行下一步之前，不要让胚胎在PBS-吐温或封闭溶液（表1）中停留超过16小时。 将胚胎移入甲醇中储存。尽可能多地去除 PBS-吐温，然后加入 1 mL 甲醇。胚胎沉淀后，尽可能多地去除甲醇，并加入 1 mL 新鲜甲醇。将胚胎无限期地储存在-20°C。甲醇储存还允许从多个集合中汇集胚胎。 2. 免疫荧光标记 注意：除了抗体孵育步骤外，确切的液体量和时间在本节中并不重要。要进行冲洗或洗涤，让胚胎沉淀到管底部，在不吸吮胚胎的情况下尽可能多地去除液体，然后加入 ~1 mL 新液体;使用装有乳胶灯泡的玻璃巴斯德移液管，以获得最佳的清晰度和控制效果。对于冲洗步骤，胚胎不会摇晃，只是让它们沉淀;对于洗涤步骤，将胚胎在章动器上摇动指定的时间，然后让其沉淀。 如果胚胎未储存在甲醇中，请继续执行步骤2.2。如果胚胎储存在甲醇中，则用PBS-Tween冲洗两次，然后用PBS-Tween洗涤两次20分钟。 在 1 mL 封闭溶液中洗涤胚胎 30-60 分钟。 将胚胎与在抗体溶液（表1）中稀释的一抗在室温下孵育2小时，或优选在4°C下孵育过夜。 以尽可能小的体积（50-300μL）执行此步骤以保存一抗;在章动器上摇摆不是严格要求的。将典型免疫荧光实验中使用的一抗量增加至少 50% 用于 ExM。使用以下一抗浓度：抗Par-3豚鼠多克隆21 ：1：200，抗GFP兔多克隆1：100。 除去一抗溶液（如果需要，在4°C保存），用PBS-Tween冲洗两次，然后用PBS-Tween洗涤15分钟四次。 将胚胎与荧光二抗一起孵育，最终体积为300μL（在抗体溶液中稀释），在室温下在章动器上孵育1小时。在此步骤中可以添加荧光标记的链霉亲和素。从这一步开始，尽可能保护胚胎免受过度和长时间的光照，例如用不透明的盒盖盖住试管或将样品放在抽屉中。使用以下浓度：1：500 用于与 Alexa Fluor 488 融合的抗兔 IgG 山羊多克隆抗体;1：500 用于与 Alexa Fluor 568 融合的抗豚鼠 IgG 山羊多克隆抗体;链霉亲和素-Alexa Fluor 488 的比例为 1：1000。 取出并处理二抗溶液。用PBS-Tween冲洗胚胎两次，并用PBS-Tween洗涤15分钟四次。 此时，胚胎可以在黑暗中储存在4°C，但尽快处理样品（<24小时）。 3. 制备PDMS孔 注意：PDMS 孔最多可以提前 2 周制作。 将培养箱或热板设置为55°C，并将可以将锥形管旋转至15°C的离心机设置为15°C。 要制备PDMS溶液（表1），请将50 mL锥形管放入刻度的二级容器中，并使用注射器向管中加入10 g有机硅弹性体基质。然后，加入1g有机硅弹性体固化剂，将管子倒置数次混合。 通过向第二个 50 mL 锥形管中加入适量的水来创建平衡管。将PDMS溶液在15°C下以500× g 离心3分钟，然后将其倒入10cm培养皿中至~1mm的深度。如有必要，用空气软管轻轻吹在溶液上去除气泡。让PDMS溶液在55°C下凝固过夜。 PDMS板固化后，使用手术刀在略小于22 mm x 22 mm盖玻片的方形区域划痕。在每个正方形内，划痕并取出一个 ~8 毫米宽的正方形孔。 将每个方形PDMS孔转移到22 mm x 22 mm盖玻片上，并牢固地粘附（图2D）。准备六个或更多的盖玻片应该产生大量扩增的胚胎进行成像。 4.将胚胎粘附在盖玻片上 施加足够的0.1%聚-L-赖氨酸以覆盖每个孔（~50μL）内的盖玻片表面，并将它们置于55°C培养箱中风干。重复此步骤以增加粘附性。 在1x PBS中短暂冲洗胚胎一次以除去吐温洗涤剂，然后将>10个胚胎转移到每个聚-L-赖氨酸包被的孔中。 让胚胎沉降到孔底。使用巴斯德移液管从粘附的胚胎中去除多余的液体。立即继续执行下一步。 5. 活化和凝胶化 注意：活化是指将MA-NHS添加到胚胎中，这将修饰样品蛋白质和抗体，使它们能够与水凝胶结合。凝胶化是指在每个孔的胚胎内部和周围产生水凝胶。在凝胶化过程中，胚胎被单体溶液渗透，然后用凝胶溶液处理以形成水凝胶。 通过用活化溶液填充孔（1mM MA-NHS，在1x PBS中新鲜稀释; 表1）。在1小时内大约每10分钟改变一次该溶液。 用1x PBS冲洗胚胎三次。将胚胎在单体溶液（表1）中在4°C下孵育45分钟。 当胚胎位于单体溶液中时，制备凝胶溶液（表1）。制备 ~2 mL 凝胶溶液足以覆盖整个 10 cm 培养皿的 PDMS 孔。请务必最后添加 APS，因为它将启动聚合并开始凝胶化。从粉末中稀释催化氧化剂（例如，1% TEMPO w/v 在水中）。将 1,960 μL 单体溶液与 30 μL 10% TEMED 和 10 μL 1% TEMPO 混合。 为避免一次聚合整批凝胶溶液，请小批量工作。将凝胶溶液（不含APS）在PCR条带的八个管之间分成125μL等分试样。 使用真空从三个PDMS孔中取出单体溶液，同时注意不要破坏胚胎。将 5 μL APS 加入到其中一个含有凝胶溶液的 PCR 管中以引发聚合。在孔中快速分配聚合凝胶溶液（每孔~40μL）。重复此操作，直到覆盖所有孔和胚胎。 让样品在37°C下凝胶1.5-2.5小时。 每隔一段时间搅拌一次水凝胶以监测聚合。固化的水凝胶不会摆动。较厚的水凝胶需要更长的时间才能完成聚合和固化。 6.消化和膨胀 注意：较厚和较大的凝胶需要更长的时间才能膨胀，凝胶的中心可能需要几个小时才能完全膨胀;这可以通过修剪凝胶的边缘来加快速度。随着凝胶的膨胀，它们的折射率将变得几乎与水的折射率相同，并且它们将变得非常难以看到。 凝胶化完成后，从盖玻片上剥离PDMS孔，同时尽量不要干扰水凝胶。如果需要，切掉多余的水凝胶材料。 将水凝胶（仍附着在盖玻片上）单独转移到六孔板的孔中（图2E）。请注意，水凝胶在消化过程中可能会略微膨胀。 在37°C下用消化缓冲液（表1）完全覆盖凝胶1小时。 通常，30 mL 消化缓冲液足以覆盖 6 孔板中的凝胶。 消化后，将每种水凝胶从盖玻片上滑下来，将它们单独转移到6厘米的培养皿中。可能需要使用第二个盖玻片来去除凝胶。用去离子水填充每个培养皿以扩增凝胶。在1-2小时内更换水3至4次，直到凝胶完全膨胀（预计宽度增加约4倍）。 7. 安装和成像 注意：膨胀水凝胶几乎完全由水组成，使其几乎透明且极其脆弱。可以使用长盖玻片操纵凝胶，以移动它们并将它们拾取。一次只能安装和成像一两块凝胶，因为凝胶会逐渐释放水分并开始在盖玻片周围滑动。 使用巴斯德移液管，尽可能多地从培养皿中去除多余的水，以尽量减少凝胶在处理时四处移动。 将每个扩增的凝胶（胚胎在底面上）操纵到大盖玻片（例如，24 mm x 40 mm）上进行成像。 用凝胶将每个盖玻片安装在倒置激光扫描共聚焦显微镜的物镜上。使用显微镜上的落射荧光或明场显微镜模式，使用低放大倍率（5倍或10倍）或中放大倍率（20倍）空气物镜定位正确分位和定向的标本。 要以高分辨率成像，请切换到高放大倍率（60倍、63倍或100倍）油浸物镜或水浸物镜。胚胎的表面必须在物镜的聚焦范围内（63倍物镜距离盖玻片<300μm）才能成像。 使用显微镜上的激光扫描共聚焦模式从样品中收集数据。确保收集具有良好动态范围的非饱和图像，并在每张图像中使用适当数量的像素来捕获有关样本23的最大可能信息。 图 2：手动脱膜和使用水凝胶 。 （A） 从琼脂/果汁平板上切下琼脂板。（B） 将双面胶带放在 6 厘米培养皿的盖子内。（C） 将胚胎粘附在胶带盖上。（D） 带有方形孔的 PDMS 板粘附在 22 mm x 22 mm 的盖玻片上。（E） 盖玻片，在 6 孔板内带有 PDMS 孔。 请点击这里查看此图的较大版本.