Cirurgia e Testes Comportamentais no Modelo de Transposição do Neuroma Tibial em Ratos
Summary
Este protocolo descreve o modelo de transposição do neuroma tibial, que envolve uma lesão do nervo tibial com subsequente transposição da extremidade proximal do nervo para uma posição subcutânea pré-tibial ou lateral. O teste comportamental da dor do neuroma e da hiperalgesia plantar é quantificado usando monofilamentos de Von Frey.
Abstract
A transposição do neuroma tibial (TNT) é um modelo de rato no qual a alodínia no sítio do neuroma (nervo tibial) pode ser avaliada independentemente da alodínia na superfície plantar da pata traseira inervada pelo nervo sural intacto. Esse modelo de TNT é adequado para testar terapias para a dor do neuroma, como a potencial superioridade de certas terapias cirúrgicas já utilizadas na clínica, ou para avaliar novos fármacos e seu efeito nas duas modalidades de dor no mesmo animal. Nesse modelo, uma lesão distal (neurotmese) é feita no nervo tibial, e a extremidade proximal do nervo é transposta e fixada subcutânea e pré-tibialmente para permitir a avaliação do sítio do neuroma com um monofilamento de Von Frey de 15 g. Para avaliar a alodínia sobre o nervo sural, os monofilamentos de Von Frey podem ser usados pelo método ascendente-descendente na região lateral plantar da pata traseira. Após o corte do nervo tibial, a hipersensibilidade mecânica se desenvolve no local do neuroma dentro de 1 semana após a cirurgia e persiste pelo menos até 12 semanas após a cirurgia. A alodínia na superfície plantar inervada sural desenvolve-se dentro de 3 semanas após a cirurgia em comparação com o membro contralateral. Com 12 semanas, um neuroma se forma na extremidade proximal do nervo tibial seccionado, indicado por dispersão e turbilhonamento de axônios. Para a cirurgia modelo TNT, múltiplos passos críticos (micro)cirúrgicos precisam ser seguidos, e alguma prática cirúrgica sob anestesia terminal é aconselhada. Em comparação com outros modelos de dor neuropática, como o modelo de lesão nervosa poupada, a alodínia sobre o sítio do neuroma pode ser testada independentemente da hipersensibilidade do nervo sural no modelo TNT. No entanto, o sítio do neuroma pode ser testado apenas em ratos, não em camundongos. As dicas e orientações fornecidas neste protocolo podem ajudar grupos de pesquisa que trabalham com dor a implementar com sucesso o modelo de TNT em seu serviço.
Introduction
Cada ferida, variando de simples lacerações a amputação de membros inteiros, é acompanhada por graus variados de lesão nervosa periférica. Tal lesão nervosa pode resultar na formação de um neuroma, um emaranhamento desorganizado de fibras nervosas brotantes. Os neuromas tornam-se dolorosos em 8%-30% dos pacientes, afetando severamente sua qualidade de vida 1,2,3,4,5. Após a amputação do membro, a dor do neuroma desenvolve-se em 50% dos pacientes 6,7,8. Os sintomas relatados incluem sensibilidade, dor espontânea, alodínia, hiperalgesia e hipersensibilidade mecânica ou térmica na área inervada9. Quando não tratada adequadamente em 1 ano, a dor do neuroma pode evoluir para um estado de dor crônica, resultando em alta carga social e custos médicos associados 10,11,12,13,14. Devido à baixa eficácia das intervenções farmacológicas atuais, a dor do neuroma é tratada preferencialmente pela remoção cirúrgica do neuroma doloroso, e o nervo tratado por várias técnicas cirúrgicas, como descrito na literatura15. É importante ressaltar que o alívio completo da dor é raro, a dor geralmente piora com o tempo e 40% dos pacientes não se beneficiam da cirurgia, indicando que novos tratamentos são necessários 1,16.
Um modelo padronizado de dor no rato auxilia na compreensão dos mecanismos que conduzem a dor do neuroma e pode ajudar a identificar novos tratamentos ou avaliar os já existentes usados na clínica. O modelo de transposição do neuroma tibial (TNT) foi descrito pela primeira vez por Dorsi e col. em 200817 e tem sido utilizado por diferentes grupos de pesquisa18,19,20. O objetivo geral deste método é ser capaz de testar diferentes técnicas de tratamento para a dor do neuroma. A vantagem do modelo sobre, por exemplo, o modelo de lesão nervosa poupada (SNI)21, é que ele permite testar a alodínia no sítio do neuroma. Isso porque o modelo envolve a transposição da terminação nervosa proximal do nervo tibial para uma posição pré-tibial subcutânea, onde pode ser sondado com monofilamentos de von Frey. Além disso, a alodínia se desenvolve na superfície plantar da pata traseira inervada pelo nervo sural intacto, o que pode ser avaliado independentemente da dor do neuroma no mesmo animal. Isso é semelhante aos sintomas de dor do neuroma em pacientes, onde a dor neuropática persistente após a remoção de um neuroma doloroso às vezes é causada pelos nervos vizinhos22. Além disso, a alodínia sobre um nervo seccionado com neuroma é uma modalidade de dor diferente da alodínia sobre o nervo vizinho intacto. Assim, esse modelo facilita a avaliação do efeito de novas terapias tanto na alodínia presente no sítio do neuroma quanto na dor neuropática mais disseminada testada na superfície plantar da pata traseira. Como a cirurgia realizada para criar o modelo TNT pode ser desafiadora, este artigo elabora o procedimento para apoiar os pesquisadores na implementação do modelo em suas instalações.
Protocol
Representative Results
Discussion
Etapas críticas do protocolo
O modelo TNT envolve cortar o nervo tibial e transpô-lo lateral e subcutaneamente para um local pré-tibial para permitir o teste de sensibilidade do neuroma, além de hiperalgesia plantar sobre o nervo sural. No modelo TNT, é fundamental que o local do neuroma seja visível para os pesquisadores. Portanto, uma cepa de rato albino é preferida porque as suturas subcutâneas são facilmente visíveis através da pele e a cor da sutura deve ser preferencialmente azul escu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer a Sabine Versteeg pela assistência durante a microcirurgia e a Anja van der Sar e Trudy Oosterveld-Romijn do Common Animal Laboratory (Gemeenschappelijk Dieren Laboratorium) por sua ajuda na preparação do microscópio e sala cirúrgica e no cuidado com os animais.
Esta pesquisa foi financiada por Axogen.
Materials
| Aesthesio | Linton Instrumentation | 514007 until 514015 | 0.6 g until 15 g monofilaments |
| Carprofen | Local Veterinary Pharmacy | n/a | The local veterinary pharmacy makes caprofen dilution |
| Cotton swabs | Nobamed | 974255 | |
| Electrocautery | Fine Science Tools | 18010-00 | |
| Ethanol 70% | Interchema BV | 400406 | |
| Ethilon 4.0 | Johnson & Johnson | 1854G | IMPORTANT: the color should be blue or black |
| Ethilon 8.0 | Johnson & Johnson | BV130-5 | |
| Isoflo, isoflurane Zoetis | Dechra Veterinary Products | B506 | |
| Mesh bottom cages | StoeltingCo | 57816 and 57824 | |
| Micro forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Micro needle holder | Fine Science Tools | 12076-12 | |
| Micro scissors | Fine Science Tools | 15019-10 | |
| Micro tweezers | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| NaCl 0.9% | Trademed | H7 1000-FRE | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12004-16 | |
| Ophthalmic ointment | Local Veterinary Pharmacy | n/a | The local veterinary pharmacy makes the ophthalmic ointment |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14001-12 | |
| Stereo surgical microscope | Leica | A60 F | |
| Sterile sheet with hole | Evercare OneMed | 1555-01 | |
| Surgical blade nr.15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11617-12 |
References
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