Un método de homogeneización rápido, simple y estandarizado para preparar emulsiones de antígeno/adyuvante para inducir encefalomielitis autoinmune experimental
Summary
Para inducir la encefalomielitis autoinmune experimental, un modelo animal de esclerosis múltiple, los ratones son inmunizados con una emulsión de agua en aceite que contiene un autoantígeno y un adyuvante completo de Freund. Si bien existen varios protocolos para la preparación de estas emulsiones, aquí se presenta un protocolo de homogeneización rápido, simple y estandarizado para la preparación de emulsiones.
Abstract
La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) comparte características inmunológicas y clínicas similares con la esclerosis múltiple (EM) y, por lo tanto, se usa ampliamente como modelo para identificar nuevos objetivos farmacológicos para un mejor tratamiento del paciente. La EM se caracteriza por varios cursos diferentes de la enfermedad: EM recurrente-remitente (EMRR), EM progresiva primaria (EMPP), EM progresiva secundaria (EMSP) y una forma rara de EM progresiva-recurrente (EMPR). Aunque los modelos animales no imitan con precisión todos estos fenotipos contrastantes de enfermedades humanas, existen modelos EAE que reflejan algunas de las diferentes manifestaciones clínicas de la EM. Por ejemplo, la EAE inducida por la glicoproteína oligodendrocitos de mielina (MOG) en ratones C57BL / 6J imita la EMPP humana, mientras que la EAE inducida por la proteína proteolípida de mielina (PLP) en ratones SJL / J se asemeja a RRMS. Otros autoantígenos, como la proteína básica de mielina (MBP), y una serie de cepas de ratón diferentes también se utilizan para estudiar la EAE. Para inducir la enfermedad en estos modelos EAE de autoinmunización con antígenos, se prepara una emulsión de agua en aceite y se inyecta por vía subcutánea. La mayoría de los modelos de EAE también requieren una inyección de toxina pertussis para que la enfermedad se desarrolle. Para una inducción EAE consistente y reproducible, es necesario un protocolo detallado para preparar los reactivos para producir emulsiones antígeno/adyuvantes. El método descrito aquí aprovecha un método estandarizado para generar emulsiones de agua en aceite. Es simple y rápido y utiliza un homogeneizador agitador en lugar de jeringas para preparar emulsiones de calidad controlada.
Introduction
Una ruptura de la tolerancia inmunológica puede resultar en la generación de trastornos autoinmunes, como la esclerosis múltiple (EM). Se estima que 2,8 millones de personas viven con EM en todo el mundo1. Aunque la causa exacta de la EM es todavía en gran parte desconocida, la desregulación de las células T y B autorreactivas, así como los defectos en la función Treg, juegan un papel importante en la patogénesis de la enfermedad 2,3.
Los modelos animales de enfermedades autoinmunes son herramientas esenciales para investigar posibles modalidades terapéuticas. El modelo experimental de encefalomielitis autoinmune (EAE) ha sido utilizado durante casi un siglo por investigadores interesados en la EM4. En los primeros experimentos, la incidencia de la enfermedad era relativamente baja. La introducción del adyuvante completo de Freund (CFA), que contiene Mycobacterium y toxina pertussis, permitió la inducción consistente de EAE en ratones4. Lo más importante es que es necesario mezclar CFA con un antígeno específico del sistema nervioso central (SNC) para generar una emulsión homogénea de agua en aceite para inducir EAE. Los modelos EAE más comunes actualmente disponibles se basan en la inmunización activa de ratones con péptidos encefalitogénicos. Los antecedentes genéticos de los ratones juegan un papel importante en la susceptibilidad a la enfermedad, con péptidos de glicoproteína oligodendrocitos de mielina (MOG35-55) y proteína proteolípida de mielina (PLP139-151) utilizados para inducir EAE en ratones C57BL / 6J y SJL, respectivamente5. Sin embargo, también se pueden usar otras cepas de ratón y péptidos derivados del SNC.
La calidad de la emulsión CFA/péptido es un factor crítico que determina la penetrancia de la enfermedad en el modelo6 de inmunización activa EAE. Se debe preparar una emulsión homogénea de agua en aceite mezclando los péptidos encefalitogénicos disueltos en tampón acuoso con CFA, de lo contrario los animales no desarrollarán la enfermedad. Se han publicado numerosos protocolos sobre la preparación de emulsiones CFA/péptidos. Los ejemplos incluyen el uso de un vórtice7, sonicación8, jeringas y un conector T de tres vías9, o una jeringa solo5. Sin embargo, todos estos métodos son difíciles de estandarizar y a menudo se asocian con protocolos largos y complicados.
En comparación con todos los métodos anteriores, el método simple descrito aquí para la preparación de emulsiones ofrece las ventajas de no tener diferencias de persona a persona y ser relativamente rápido. La emulsión es generada por un homogeneizador que agita los reactivos con una velocidad, tiempo y temperatura establecidos, asegurando resultados rápidos y consistentes. Además de inducir enfermedad en el modelo EAE, este método también puede ser utilizado para estudiar otros modelos de enfermedades autoinmunes como la artritis inducida por colágeno (CIA) y la artritis inducida por antígenos (AIA)6. Por lo tanto, se anticipa que este método puede ser utilizado para inducir consistentemente la enfermedad en otros modelos animales que dependen de emulsiones de agua en aceite con autoantígenos, como la neuritis autoinmune experimental (EAN)10, la tiroiditis autoinmune experimental (EAT)11, la uveítis autoinmune (EAU)12 y la miastenia gravis (MG)13. Este método también induce respuestas inmunes generales, como la hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) de manera consistente6, y por lo tanto podría usarse para administrar vacunas contra el cáncer y la malaria (ver discusión).
Por lo tanto, se ha desarrollado un método rápido (tiempo total de preparación ~ 30 min), simple (todos los reactivos se pueden preparar y almacenar) y estandarizado (la emulsión se logra utilizando un homogeneizador de agitación) y se presenta aquí. Las emulsiones CFA/antígeno preparadas utilizando este protocolo inducen consistentemente la enfermedad en modelos animales autoinmunes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las emulsiones de agua en aceite, como el antígeno/adyuvante de Freund, se han utilizado durante más de medio siglo para inducir EAE17. Actualmente no existe un método estandarizado para preparar emulsiones de antígenos que sea independiente de la influencia humana. La mezcla manual con jeringas es estándar para la mayoría de los laboratorios, sin embargo, este método lleva mucho tiempo, a menudo resulta en una pérdida excesiva de material y la calidad difiere según el científico que lo …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El autor desea agradecer a las unidades de alojamiento de animales de la Universidad de Lund, Camilla Björklöv y Agnieszka Czopek, por su apoyo, y a Richard Williams, del Instituto Kennedy de Reumatología, Universidad de Oxford, Reino Unido, por la crítica constructiva y el apoyo lingüístico que produce este manuscrito.
Materials
| 1 mL Injection syringe | B. Braun | 9166017V | |
| 1 mL Injection syringe | Sigma-Aldrich | Z683531 | |
| 7 ml empty tubes with caps | Bertin-Instruments | P000944LYSK0A.0 | 7 mL tube |
| 50 mL sterile centrifuge tube | Fisher Scientific | 10788561 | 50 mL tube |
| Bordetella pertussis toxin | Sigma-Aldrich | P2980 | Store at -20 °C |
| Dispersant, light mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Store at RT |
| Emulsion kit | Bertin-Instruments | D34200.10 ea | Containing a tube, cap, and plunger |
| Incomplete Freund's Adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Store at +4 °C |
| Mycobacterium tuberculosis, H37RA | Fisher Scientific | DF3114-33-8 | Store at +4 °C |
| Mastersizer 2000 | Malvern Panalytical | N/A | Particle size analyzer |
| Minilys-Personal homogenizer | Bertin-Instruments | P000673-MLYS0-A | Shaking homogenizer |
| MOG 35-55 Peptide | Innovagen | N/A | |
| Montanide ISA 51 VG | Seppic | 36362Z | FDA-approved oil adjuvant |
| Pall Acrodisc Syringe Filters 0.2 μm | Fisher Scientific | 17124381 | Sterlie filter |
| PBS, Ca2+/Mg2+ free | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
| Phase-Constrast Microscope | Olympus | BX40-B | |
| Steel Beads 3.2 mm | Fisher Scientific | NC0445832 | Autoclave and store at RT |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 648463 | Store at RT |
References
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