Конвейер для характеристики структурных пороков сердца у плодной мыши
Summary
В этой статье подробно описываются методы диагностики врожденных пороков сердца у мышей (ИБС) с использованием эхокардиографии плода, некропсии и эпископического флуоресцентного изображения (EFIC) с использованием эпископической конфокальной микроскопии (ECM) с последующей трехмерной (3D) реконструкцией.
Abstract
Врожденные пороки сердца (ИБС) являются основными причинами младенческой смертности в Соединенных Штатах. В 1980-х годах и ранее большинство пациентов с умеренной или тяжелой ИБС умерли до совершеннолетия, с максимальной смертностью в течение первой недели жизни. Замечательные достижения в хирургических методах, диагностических подходах и медицинском управлении привели к заметному улучшению результатов. Для удовлетворения критических исследовательских потребностей в понимании врожденных пороков сердца мышиные модели обеспечили идеальную исследовательскую платформу, поскольку они имеют очень похожую анатомию сердца с людьми и короткие показатели беременности. Сочетание генной инженерии с высокопроизводительными инструментами фенотипирования позволило воспроизвести и диагностировать структурные пороки сердца для дальнейшего выяснения молекулярных путей, стоящих за ИБС. Использование неинвазивной эхокардиографии плода для скрининга сердечных фенотипов в мышиных моделях в сочетании с высокой точностью эпископического флуоресцентного захвата изображения (EFIC) с использованием эпископической конфокальной микроскопии (ECM) гистопатологии с трехмерными (3D) реконструкциями позволяет детально взглянуть на анатомию различных врожденных пороков сердца. Этот протокол описывает полный рабочий процесс этих методов для получения точного диагноза врожденных пороков сердца у мышей. Применение этого протокола фенотипирования к модельным организмам позволит проводить точную диагностику ИБС, давая представление о механизмах ИБС. Выявление основных механизмов ИБС предоставляет возможности для потенциальных методов лечения и вмешательств.
Introduction
Врожденные пороки сердца (ИБС) являются наиболее распространенным врожденным дефектом новорожденных 1,2, затрагивающим около 0,8-1,7% новорожденных и приводящим к значительной неонатальной смертности и заболеваемости3. Генетическая этиология сильно показана при ИБС 4,5. Генетически модифицированные мышиные модели широко использовались для понимания сложности ИБС и механизмов, которые их вызывают из-за того, что мыши имеют четырехкамерные сердца и сопоставимые последовательности ДНК развития сердца у мышей и человеческих плодов6. Идентификация фенотипа мышиных мутантов является фундаментальным первым шагом в характеристике функции гена-мишени. Мышиные модели, выражающие эффекты дозирования генов, в которых одна генетическая мутация может привести к спектру сердечных дефектов, имитирующих ИБС человека, важны для понимания сложности ИБС и механизмов, которые их вызывают.
В этой статье описывается конвейер для характеристики сердечных фенотипов в мышиных моделях. Применяемые методы используют эхокардиограмму плода7, за которой следуют некропсия и гистопатология ECM 7,8, которая может отображать подробную анатомию развивающихся мышиных сердечных фенотипов. Эхокардиограмма плода является неинвазивной модальностью, которая позволяет напрямую визуализировать несколько эмбрионов с разумным разрешением изображения. Кроме того, эхокардиограмма плода обеспечивает быстрое определение общего количества эмбрионов в помете, стадий их развития, а также относительной ориентации и расположения в роге матки. Используя спектральный допплеровский / цветовой поток, аномальные эмбрионы могут быть идентифицированы на основе структуры, гемодинамического нарушения, ограничения роста или развития водянки. Поскольку исследование эхокардиограммы плода является неинвазивным методом, его можно использовать для сканирования в течение нескольких дней и наблюдения за изменениями гемодинамики или морфологии сердца. Получение качественной визуализации эхокардиограмм плода требует практики и мастерства, так как специфические пороки сердца могут быть пропущены из-за отсутствия опыта и знаний. Из-за этого более точный анализ морфологии сердца может быть получен путем сочетания некропсии и гистопатологии ECM. Некропсия обеспечивает прямую визуализацию структуры дуги, относительных отношений аорты и легочной артерии, размера желудочков и предсердий, положения сердца относительно грудной клетки и бронхолегочных структур. Тем не менее, внутренние особенности, такие как сердечные клапаны и толщина стенки, могут быть трудно оценить только с помощью некропсии. Таким образом, Гистопатология ECM рекомендуется для окончательного диагноза. Гистопатология ECM – это метод визуализации с высоким разрешением, который позволяет как 2D, так и 3D-реконструкцию стека изображений9. Эти изображения получаются с помощью последовательной эпископической флуоресцентной визуализации образца, встроенного в парафин, поскольку он тонко секционируется через последовательный интервал автоматическим микротомом. В отличие от классической гистологии, изображения захватываются в виде сечения, прежде чем он будет вырезан из блока, так что все изображения захватываются в одной системе отсчета. Из-за этого стек 2D-изображений, созданный гистопатологией ECM, может быть легко и надежно реконструирован в трех измерениях. Это делается с помощью средства просмотра DICOM, которое позволяет 3D-визуализацию изображений в трех анатомических плоскостях: корональной, сагиттальной и поперечной. Из этих 3D-реконструкций с высоким разрешением может быть поставлен окончательный сердечный диагноз. Применение этих трех различных модальностей визуализации, по отдельности или в комбинации, может обеспечить точную характеристику структурных пороков сердца у эмбрионов мышей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Генетически модифицированные мыши были использованы для понимания патомеханизмов врожденных пороков сердца. Протоколы, которые мы предоставляем в этом исследовании, направлены на оптимизацию и стандартизацию процесса оценки пороков сердца плода мышей. Тем не менее, есть критические…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Никакой.
Materials
| 1x phosphate-buffered saline solution (PBS), PH7.4 | Sigma Aldrich | P3813 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes (or preferred vial for tissue storage) | SealRite | 1615-5599 | |
| 10% buffered formalin phosphate solution | Fisher Chemical | SF100-4 | |
| 100% Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) fixative | ThermoScientific | 28908 | 4% working concentration freshly prepared in 1x PBS at 4 °C |
| 50 mL tubes | Falcon | 352070 | |
| 6–12 Well plate or 20 mL vial for embryo storage | Falcon | 353046 | |
| Dissecting microscope | Leica | MDG36 | |
| Dissecting Pins (A1 or A2 grade) | F.S.T | 26002-15 | |
| Dissecting Plate | F.S.T | FB0875713 | Petri dish with paraffin base |
| Embedding molds | Sakura | 4133 | |
| Extra narrow scissors (10.5 cm) | F.S.T | 14088-10 | 1–2 pairs |
| Fiji application/Image J | NIH | Fiji.sc | |
| Fine tip (0.05 mm x 0.01 mm) Dissecting Forceps (11 cm) | F.S.T | 11252-00 | 2 Pairs |
| Hot forceps | F.S.T | 11252-00 | For orientation of embryos |
| Industrial Marker for Wax Blocks | Sharpie | 2003898 | Formatted for labratory use |
| Jenoptik ProgRes C14plus Microscope Camera | Jenoptik | 017953-650-26 | |
| Jenoptik ProgRess CapturePro acquisition software | Jenoptik | jenoptik.com | |
| Large glass beaker | Fisher Scientific | S111053 | For melting paraffin |
| Leica M165 FC binocular microscope (16.5:1 zoom optics) | Leica | M165 FC | |
| OsiriX MD Version 12.0 | OsiriX | osirix-viewer.com | |
| Paraplast embedding paraffin wax | Millipore Sigma | 1003230215 | |
| Small glass beaker | Fisher Scientific | S111045 | |
| Small, perforated spoon (14.5 cm) | F.S.T | 10370-17 | |
| Straight Vannas Scissors (4–8 mm) | F.S.T | 15018-10 | A pair |
| Vevo2100 ultrahigh-frequency ultrasound biomicroscope | FUJIFILM VisualSonics Inc. | Vevo2100 | |
| Xylene | Fisher Chemical | UN1307 |
References
- Wu, W., He, J., Shao, X. Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017. 의학. 99 (23), e20593 (2020).
- vander Linde, D., et al. Birth prevalence of congenital heart disease worldwide: a systematic review and meta-analysis). Journal of the American College of Cardiology. 58 (21), 2241-2247 (2011).
- Yang, Q., et al. Racial differences in infant mortality attributable to birth defects in the United States. Birth Defects Research. Part A, Clinical and Molecular Teratology. 76 (10), 706-713 (1989).
- Patel, A., et al. Prevalence of noncardiac and genetic abnormalities in neonates undergoing cardiac operations: Analysis of the society of thoracic surgeons congenital heart surgery database. The Annals of Thoracic Surgery. 102 (5), 1607-1614 (2016).
- Pierpont, M. E., et al. Genetic basis for congenital heart disease: Revisited: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation. 138 (21), e653-e711 (2018).
- Krishnan, A., et al. A detailed comparison of mouse and human cardiac development. Pediatric Research. 76 (6), 500-507 (2014).
- Liu, X., et al. Interrogating congenital heart defects with noninvasive fetal echocardiography in a mouse forward genetic screen. Circulation. Cardiovascular Imaging. 7 (1), 31-42 (2014).
- Liu, X., Tobita, K., Francis, R. J., Lo, C. W. Imaging techniques for visualizing and phenotyping congenital heart defects in murine models. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Review. 99 (2), 93-105 (2013).
- Tsuchiya, M., Yamada, S. High-resolution histological 3D-imaging: episcopic fluorescence image capture is widely applied for experimental animals. Congenital Anomalies (Kyoto. 54 (4), 250-251 (2014).
- Yu, Q., Tian Leatherbury, ., Lo, X., W, C. Cardiovascular assessment of fetal mice by in utero echocardiography). Ultrasound in Medicine and Biology. 34, 741-752 (2008).
- Rosenthal, J., et al. Rapid high resolution three-dimensional reconstruction of embryos with episcopic fluorescence image capture. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Review. 72 (3), 213-223 (2004).
- Weninger, W. J., Mohun, T. Phenotyping transgenic embryos: a rapid 3-D screening method based on episcopic fluorescence image capturing. Nature Genetics. 30 (1), 59-65 (2002).
