התפשטות וירוסים וכימות קולורימטרי מבוסס תאים
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר את התפשטות נגיף הזיקה (ZIKV) בתאי כליות של קוף ירוק אפריקאי ורו ואת הכימות של ZIKV באמצעות שיטות זיהוי חיסוני קולורימטרי מבוססות תאים בפורמטים של 24 בארות ו-96 בארות (תפוקה גבוהה).
Abstract
נגיף זיקה (ZIKV) הוא נגיף המועבר על ידי יתושים השייך לסוג Flavivirus. זיהום ZIKV נקשר למומים מולדים במוח ואולי לתסמונת Guillain-Barré אצל מבוגרים. מחקר על ZIKV כדי להבין את מנגנוני המחלה חשוב כדי להקל על פיתוח החיסון והטיפול. שיטת כימות הנגיפים היא חיונית ובסיסית בתחום הווירולוגיה. בדיקת יצירת המיקוד (FFA) היא בדיקת כימות וירוסים המזהה את האנטיגן הנגיפי עם נוגדנים ומזהה את מוקדי הזיהום של תאים באמצעות טכניקת הצביעה החיסונית peroxidase. המחקר הנוכחי מתאר את פרוטוקול ההתפשטות והכימות של וירוסים באמצעות פורמטים של 24 בארות ו-96 בארות (תפוקה גבוהה). בהשוואה למחקרים דומים אחרים, פרוטוקול זה תיאר עוד יותר אופטימיזציה של גודל מוקדים, אשר יכול לשמש כמדריך להרחבת השימוש בבדיקה זו עבור וירוסים אחרים. ראשית, התפשטות ZIKV מבוצעת בתאי Vero במשך 3 ימים. סופרנאטנט התרבית המכיל ZIKV נקצר ומכומת באמצעות FFA. בקצרה, תרבית הנגיף מחוסנת על תאי ורו ומודגרת במשך 2-3 ימים. היווצרות מוקדים נקבעת לאחר תהליכי צביעה אופטימליים, כולל קיבוע תאים, חלחול, חסימה, קשירת נוגדנים ודגירת מצע פרוקסידז. מוקדי הנגיף המוכתמים מוצגים באמצעות מיקרוסקופ סטריאו (ספירה ידנית בפורמט 24 בארות) או מנתח תוכנה (ספירה אוטומטית בפורמט 96 בארות). ה- FFA מספק תוצאות ניתנות לשחזור, מהירות יחסית (3-4 ימים) ומתאים לשימוש עבור וירוסים שונים, כולל וירוסים שאינם יוצרי פלאק. לאחר מכן, פרוטוקול זה שימושי לחקר זיהום ZIKV וניתן להשתמש בו כדי לזהות וירוסים חשובים אחרים מבחינה קלינית.
Introduction
זיהום בנגיף זיקה (ZIKV) הוא מחלה נגיפית מתפתחת המועברת על ידי יתושים. הבידוד הראשון של ZIKV היה באוגנדה בשנת 1947 1,2; היא נותרה מוזנחת מ-1947 עד 2007, שכן הסימפטומים הקליניים הם לרוב א-סימפטומטיים ומאופיינים במחלת חום המגבילה את עצמה. בשנת 2007, מגיפת זיקה החלה באיי יאפ 3,4, ואחריה מגיפות גדולות יותר באזורי האוקיינוס השקט (פולינזיה הצרפתית, אי הפסחא, איי קוק וקלדוניה החדשה) משנת 2013 עד 2014 5,6,7,8, שם הסיבוך הנוירולוגי החמור תסמונת Guillain-Barré (GBS) דווח לראשונה במבוגרים 9. במהלך 2015 ו -2016, מגיפת ZIKV הנרחבת הראשונה שטפה את אמריקה לאחר הופעת הגנוטיפ האסייתי של ZIKV בברזיל כבר בשנת 201310. במהלך התפרצות זו, 440,000 עד 1.3 מיליון מקרים של מיקרוצפליה, והפרעות נוירולוגיות אחרות, דווחו בתינוקות שזה עתה נולדו11. כיום אין תרופה או טיפול ספציפיים לזיהום ZIKV; לפיכך, קיים צורך רפואי דחוף בחיסוני ZIKV המסוגלים למנוע זיהומים, במיוחד במהלך ההריון.
כימות וירוסים הוא תהליך לקביעת מספר הנגיפים הקיימים בדגימה. היא ממלאת תפקיד חשוב במחקר, ומעבדות אקדמיות מערבות תחומים רבים, כגון רפואה ומדעי החיים. תהליך זה חשוב גם במגזרים מסחריים, כגון ייצור חיסונים נגיפיים, חלבונים רקומביננטיים, אנטיגנים נגיפיים או חומרים אנטי-ויראליים. שיטות או בדיקות רבות יכולות לשמש לכימות וירוסים12. בחירת השיטות או הבדיקות תלויה בדרך כלל במאפייני הנגיף, ברמת הדיוק הרצויה ובאופי הניסוי או המחקר. באופן כללי, ניתן לחלק את שיטות הכימות של וירוסים לשתי קטגוריות: בדיקות מולקולריות המזהות נוכחות של חומצת גרעין ויראלית (DNA או RNA) ובדיקות המודדות את ההדבקה בנגיף במבחנה12. תגובת שרשרת כמותית של פולימראז (qPCR, עבור DNA) או תגובת שרשרת כמותית של פולימראז שעתוק לאחור (qRT-PCR, עבור RNA)13 ו- PCR14 טיפתי דיגיטלי הן דוגמאות לטכניקות מולקולריות נפוצות המשמשות לכימות חומצת הגרעין הנגיפית במדגם נתון15. עם זאת, טכניקות מולקולריות רגישות מאוד אלה אינן יכולות להבדיל בין וירוסים בני קיימא ושאינם בני קיימא15. לכן, מחקר הדורש מידע על תכונות ביולוגיות, כגון הדבקה של וירוסים בתאים, אינו יכול להסתיים באמצעות הטכניקות המולקולריות שהוזכרו לעיל; יש צורך בבדיקות שיכולות למדוד ולקבוע את נוכחותם של וירוסים בני קיימא. בדיקות המודדות את ההדבקה בנגיף כוללות את בדיקת יצירת הפלאק (PFA), מינון זיהומי של 50% תרבית רקמה (TCID50), בדיקת מיקוד פלואורסצנטי ומיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM)12.
PFA, שפותחה על ידי רנאטו דולבקו בשנת 1952, היא אחת השיטות הנפוצות ביותר לטיטרציה של וירוסים, כולל עבור ZIKV16. הוא משמש כדי לקבוע ישירות את ריכוזי הנגיפים עבור virions lytic זיהומיות. השיטה מבוססת על יכולתו של וירוס ליטי לייצר השפעות ציטופתיות (CPEs; אזורים של מוות תאי או פלאקים, אזור של זיהום מוקף תאים לא נגועים) בחד-שכבה של תאים מחוסנים לאחר הדבקה ויראלית. עם זאת, ישנם מספר חסרונות לבדיקה המשפיעים על התועלת שלה. הבדיקה גוזלת זמן (אורכת כ-7-10 ימים, תלוי בווירוסים), תלויה ב-CPE ומועדת לשגיאות. במחקר הנוכחי, אנו מדווחים על טכניקה אימונוקולורימטרית, בדיקת יצירת מיקוד (FFA), לזיהוי וכימות ZIKV בפורמטים של לוחות 24 בארות ולוחות 96 בארות.
Protocol
Representative Results
Discussion
ישנן מספר בדיקות כדי לקבוע titer וירוס; ל- PFA יש פרוטוקול כימות וירוסים דומה ל- FFA, שבו החיסון נגד הנגיף מדולל כדי לאפשר הבחנה בין פלאקים או מוקדים בודדים. לאחר הצביעה, כל פלאק או מוקד מצביע על חלקיק זיהומי יחיד בחיסון19. ה- PFA מוכתם בסגול קריסטל כדי לדמיין היווצרות פלאק הנגרמת על ידי ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה קיבל תמיכה ממשרד ההשכלה הגבוהה מלזיה במסגרת תוכנית מענקי המחקר לטווח ארוך (LRGS MRUN שלב 1: LRGS MRUN/F1/01/2018) ומימון לתוכנית מרכז המצוינות של המוסד הגבוה (HICoE) (MO002-2019). איור 3 במחקר זה שמראה את זרימת העבודה של צביעה עבור בדיקת יצירת מוקדים מותאמת מתוך “DAB Immunohistochemistry” על ידי BioRender.com (2022). מקור: https://app.biorender.com/biorender-templates/t-5f3edb2eb20ace00af8faed9-dab-immunohistochemistry.
Materials
| 0.22 µm Polyethersulfone syringe filter | Sartorius | S6534-FMOSK | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Nest | 615601 | |
| 10 mL sterile serological pipette | Labserv | 14955156 | |
| 1x Dulbecco’s phosphate-buffered saline (dPBS) | Gibco | 14190-136 | |
| 2.0 mL Screw cap tube | Axygen | SCT-200-SS-C-S | |
| 24-well plate | Corning | 3526 | |
| 25 mL Sterile serological pipettes | Labserv | 14955157 | |
| 3,3'Diaminobenzidine (DAB) peroxidase substrate | Thermo Scientific | 34065 | |
| 37 °C incubator with 5% CO2 | Sanyo | MCO-18AIC | |
| 5 mL sterile serological pipette | Labserv | 14955155 | |
| 50 mL centrifuge tube | Falcon | LAB352070 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Corning | 430725U | |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | |
| Anti-flavivirus monoclonal antibody, 4G2 (clone D1-4G2-4-15) | MilliporeSigma | MAB10216 | |
| Autoclaved 20x Phosphate buffered saline (PBS) | N/A | N/A | 22.8 g of 8 mM Na2HPO4, 4.0 g of 1.5 mM KH2PO4, 160 g of 0.14 M NaCl, 4.0 g of 2.7 mM KCl, 1 L of MilliQ H2O |
| Biological safety cabinet, Class II | Holten | HB2448 | |
| CTL S6 Universal ELISpot/FluoroSpot Analyzer | ImmunoSpot, Cellular Technology Limited (CTL) | CTL-S6UNV12 | Commercial software analyzer |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12800-017 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen | SFBS | |
| Goat anti-mouse IgG secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase (HRP) | MilliporeSigma | 12-349 | |
| Hemacytometer | Laboroptik LTD | Neubauer improved | |
| IGEPAL CA-630 detergent | Sigma-Aldrich | I8896 | Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanolIGEPAL |
| Inverted microscope | ZEISS | TELAVAL 31 | |
| Laboratory rocker | FINEPCR | CR300 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Low viscosity carboxymethyl cellulose (CMC) | Sigma-Aldrich | C5678 | |
| Multichannel micropipette (10 – 100 µL) | Eppendorf | 3125000036 | |
| Multichannel micropipette (30 – 300 µL) | Eppendorf | 3125000052 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Single channel pipettes (10 – 100 µL) | Eppendorf | 3123000047 | |
| Single channel pipettes (100 – 1000 µL) | Eppendorf | 3123000063 | |
| Single channel pipettes (20 – 200 µL) | Eppendorf | 3123000055 | |
| Skim milk | Sunlac Low Fat | N/A | Prepare 3% Skim milk in 1x PBS for blocking stage in staining |
| Sodium Hypochlorite | Clorox | N/A | To disinfect any discarded infectious liquid waste from flasks/plates |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Syringe disposable, Luer Lock, 10 mL with 21 G Needle | Terumo | SS10L21G | |
| Vero African green monkey kidney cells | – | ECACC 88020401 | Received from collaborator. However, Vero cells obtained from other suppliers should be able to be used with some optimization. |
References
- Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), 509-520 (1952).
- Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), (1952).
- Duffy, M. R., et al. Zika virus outbreak on Yap Island, Federated States of Micronesia. The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2536-2543 (2009).
- Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area. Clinical Microbiology and Infection. 20 (10), O595-O596 (2014).
- Cao-Lormeau, V. -. M., et al. Zika virus, French polynesia, South pacific, 2013. Emerging Infectious Diseases. 20 (6), 1085-1086 (2014).
- Dupont-Rouzeyrol, M., et al. Co-infection with Zika and dengue viruses in 2 patients, New Caledonia, 2014. Emerging Infectious Diseases. 21 (2), 381-382 (2015).
- Roth, A., et al. Concurrent outbreaks of dengue, chikungunya and Zika virus infections-an unprecedented epidemic wave of mosquito-borne viruses in the Pacific 2012-2014. Euro Surveillance. 19 (41), 20929 (2014).
- Tognarelli, J., et al. A report on the outbreak of Zika virus on Easter Island, South Pacific, 2014. Archives of Virology. 161 (3), 665-668 (2016).
- Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome-case report, French Polynesia, December 2013. Euro Surveillance. 19 (9), 20720 (2014).
- Faria, N. R., et al. Zika virus in the Americas: early epidemiological and genetic findings. Science. 352 (6283), 345-349 (2016).
- Rapid risk assessment: Zika virus epidemic in the Americas: potential association with microcephaly and Guillain-Barré syndrome – 4th update. European Centre for Disease Prevention and Control Available from: https://www.ecdc.europa.eu/en/publications-data/rapid-risk-assessment-zika-virus-epidemic-americas-potential-association (2015)
- Payne, S. Methods to study viruses. Viruses. , 37-52 (2017).
- Bustin, S. A., Mueller, R. Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis. Clinical Science. 109 (4), 365-379 (2005).
- Sedlak, R. H., Jerome, K. R. Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 75 (1), 1-4 (2013).
- Bae, H. -. G., Nitsche, A., Teichmann, A., Biel, S. S., Niedrig, M. Detection of yellow fever virus: a comparison of quantitative real-time PCR and plaque assay. Journal of Virological Methods. 110 (2), 185-191 (2003).
- Dulbecco, R. Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 38 (8), 747-752 (1952).
- Nahapetian, A. T., Thomas, J. N., Thilly, W. G. Optimization of environment for high density Vero cell culture: effect of dissolved oxygen and nutrient supply on cell growth and changes in metabolites. Journal of Cell Science. 81, 65-103 (1986).
- Agbulos, D. S., Barelli, L., Giordano, B. V., Hunter, F. F. Zika virus: quantification, propagation, detection, and storage. Current Protocols in Microbiology. 43, (2016).
- Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Current Protocols in Microbiology. 31, (2013).
- Bolívar-Marin, S., Bosch, I., Narváez, C. F. Combination of the focus-forming assay and digital automated imaging analysis for the detection of dengue and Zika viral loads in cultures and acute disease. Journal of Tropical Medicine. 2022, 2177183 (2022).
- Dangsagul, W., et al. Zika virus isolation, propagation, and quantification using multiple methods. PLoS One. 16 (7), e0255314 (2021).
- Brien, J. D., et al. Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3. Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).
- Lazear, H. M., et al. A mouse model of Zika virus pathogenesis. Cell Host & Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).
- Miner, J. J., et al. Zika virus infection during pregnancy in mice causes placental damage and fetal demise. Cell. 165 (5), 1081-1091 (2016).
- Kang, W., Shin, E. -. C. Colorimetric focus-forming assay with automated focus counting by image analysis for quantification of infectious hepatitis C virions. PLoS One. 7 (8), e43960 (2012).
- Brien, J. D., et al. Isolation and quantification of Zika virus from multiple organs in a mouse. Journal of VIsualized Experiments. (150), e59632 (2019).
- Payne, A. F., Binduga-Gajewska, I., Kauffman, E. B., Kramer, L. D. Quantitation of flaviviruses by fluorescent focus assay. Journal of Virological Methods. 134 (1-2), 183-189 (2006).
- Moser, L. A., et al. Growth and adaptation of Zika virus in mammalian and mosquito cells. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (11), e0006880 (2018).
- Ishimine, T., Tadano, M., Fukunaga, T., Okuno, Y. An improved micromethod for infectivity assays and neutralization tests of dengue viruses. Biken Journal. 30 (2), 39-44 (1987).
- Leiva, S., et al. Application of quantitative immunofluorescence assays to analyze the expression of cell contact proteins during Zika virus infections. Virus Research. 304, 198544 (2021).
- Lee, E. M., Titus, S. A., Xu, M., Tang, H., Zheng, W. High-throughput Zika viral titer assay for rapid screening of antiviral drugs. ASSAY and Drug Development Technologies. 17 (3), 128-139 (2019).
