Propagación de virus y cuantificación colorimétrica basada en células
Summary
El presente protocolo describe la propagación del virus del Zika (ZIKV) en células de riñón de mono verde africano Vero y la cuantificación del ZIKV utilizando métodos de inmunodetección colorimétrica basados en células en formatos de 24 y 96 pocillos (alto rendimiento).
Abstract
El virus del Zika (ZIKV) es un virus transmitido por mosquitos que pertenece al género Flavivirus. La infección por ZIKV se ha asociado con anomalías cerebrales congénitas y, potencialmente, con el síndrome de Guillain-Barré en adultos. La investigación sobre el ZIKV para comprender los mecanismos de la enfermedad es importante para facilitar el desarrollo de vacunas y tratamientos. El método de cuantificación de virus es crucial y fundamental en el campo de la virología. El ensayo de formación de foco (FFA) es un ensayo de cuantificación de virus que detecta el antígeno viral con anticuerpos e identifica los focos de infección de las células mediante la técnica de inmunotinción de peroxidasa. El presente estudio describe el protocolo de propagación y cuantificación del virus utilizando formatos de 24 y 96 pocillos (alto rendimiento). En comparación con otros estudios similares, este protocolo ha descrito además la optimización del tamaño de los focos, lo que puede servir como guía para ampliar el uso de este ensayo para otros virus. En primer lugar, la propagación del ZIKV se realiza en células Vero durante 3 días. El sobrenadante de cultivo que contiene ZIKV se cosecha y cuantifica utilizando el FFA. Brevemente, el cultivo del virus se inocula en células Vero y se incuba durante 2-3 días. La formación de focos se determina después de procesos de tinción optimizados, incluida la fijación celular, la permeabilización, el bloqueo, la unión de anticuerpos y la incubación con sustrato de peroxidasa. Los focos de virus teñidos se visualizan utilizando un microscopio estereoscópico (recuento manual en formato de 24 pocillos) o un analizador de software (recuento automatizado en formato de 96 pocillos). El FFA proporciona resultados reproducibles y relativamente rápidos (3-4 días) y es adecuado para ser utilizado para diferentes virus, incluidos los virus que no forman placa. Posteriormente, este protocolo es útil para el estudio de la infección por ZIKV y podría utilizarse para detectar otros virus clínicamente importantes.
Introduction
La infección por el virus del Zika (ZIKV) es una enfermedad viral emergente transmitida por mosquitos. El primer aislamiento del ZIKV fue en Uganda en 1947 1,2; Permaneció desatendida desde 1947 hasta 2007, ya que los síntomas clínicos son más comúnmente asintomáticos y se caracterizan por enfermedad febril autolimitada. En 2007, la epidemia de zika comenzó en las islas Yap 3,4, seguida de epidemias más grandes en las regiones del Pacífico (Polinesia Francesa, Isla de Pascua, Islas Cook y Nueva Caledonia) de 2013 a 2014 5,6,7,8, donde se notificó por primera vez la complicación neurológica grave síndrome de Guillain-Barré (SGB) en adultos 9. Durante 2015 y 2016, la primera epidemia generalizada de ZIKV se extendió por las Américas después de la aparición del genotipo asiático de ZIKV en Brasil en 201310. Durante este brote, se notificaron entre 440.000 y 1,3 millones de casos de microcefalia y otros trastornos neurológicos en recién nacidos11. Actualmente no existe una cura o tratamiento específico para la infección por ZIKV; por lo tanto, existe una necesidad médica urgente de vacunas contra el ZIKV capaces de prevenir infecciones, particularmente durante el embarazo.
La cuantificación de virus es un proceso para determinar el número de virus presentes en una muestra. Desempeña un papel importante en la investigación, y los laboratorios académicos abarcan muchos campos, como la medicina y las ciencias de la vida. Este proceso también es importante en sectores comerciales, como la producción de vacunas virales, proteínas recombinantes, antígenos virales o agentes antivirales. Se pueden utilizar muchos métodos o ensayos para la cuantificación del virus12. La elección de los métodos o ensayos normalmente depende de las características del virus, el nivel de precisión deseado y la naturaleza del experimento o investigación. En general, los métodos de cuantificación de virus se pueden dividir en dos categorías: ensayos moleculares que detectan la presencia de ácido nucleico viral (ADN o ARN) y ensayos que miden la infectividad del virus in vitro12. La reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR, para el ADN) o la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (qRT-PCR, para el ARN)13 y la PCR digital en gotas14 son ejemplos de técnicas moleculares comunes utilizadas para cuantificar el ácido nucleico viral en una muestra determinada15. Sin embargo, estas técnicas moleculares altamente sensibles no pueden diferenciar entre virus viables y no viables15. Por lo tanto, la investigación que requiere información sobre características biológicas, como la infectividad del virus en las células, no puede completarse utilizando las técnicas moleculares antes mencionadas; Se necesitan ensayos que puedan medir y determinar la presencia de virus viables. Los ensayos que miden la infectividad del virus incluyen el ensayo de formación de placa (PFA), la dosis infecciosa de cultivo de tejidos al 50% (TCID50), el ensayo de foco fluorescente y la microscopía electrónica de transmisión (TEM)12.
El PFA, desarrollado por Renato Dulbecco en 1952, es uno de los métodos más utilizados para la titulación de virus, incluido el ZIKV16. Se utiliza para determinar directamente las concentraciones virales de viriones líticos infecciosos. El método se basa en la capacidad de un virus lítico para producir efectos citopáticos (CPEs; zonas de muerte celular o placas, un área de infección rodeada de células no infectadas) en una monocapa celular inoculada después de una infección viral. Sin embargo, existen varios inconvenientes en el ensayo que afectan a su utilidad. El ensayo requiere mucho tiempo (tarda aproximadamente entre 7 y 10 días, dependiendo de los virus), depende de la EPC y es propenso a errores. En el presente estudio, presentamos una técnica inmunocolorimétrica, el ensayo de formación de foco (FFA), para detectar y cuantificar el ZIKV en formatos de placa de 24 pocillos y placa de 96 pocillos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Existen varios ensayos para determinar el título del virus; la PFA tiene un protocolo de cuantificación del virus similar al de la FFA, en el que el inóculo del virus se diluye para permitir que se distingan placas o focos individuales. Después de la tinción, cada placa o foco indica una sola partícula infecciosa en el inóculo19. El PFA se tiñe con violeta cristalino para visualizar la formación de placa causada por la lisis o muerte celular. Por lo tanto, el PFA requiere más tiempo, ya …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación recibió el apoyo del Ministerio de Educación Superior de Malasia en el marco del Programa de Becas de Investigación a Largo Plazo (LRGS MRUN Fase 1: LRGS MRUN/F1/01/2018) y la financiación del programa del Centro de Excelencia de Instituciones Superiores (HICoE) (MO002-2019). La figura 3 de este estudio, que muestra el flujo de trabajo de tinción para el ensayo de formación de focos, está adaptada de “DAB Immunohistochemistry” de BioRender.com (2022). Recuperado de https://app.biorender.com/biorender-templates/t-5f3edb2eb20ace00af8faed9-dab-immunohistochemistry.
Materials
| 0.22 µm Polyethersulfone syringe filter | Sartorius | S6534-FMOSK | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Nest | 615601 | |
| 10 mL sterile serological pipette | Labserv | 14955156 | |
| 1x Dulbecco’s phosphate-buffered saline (dPBS) | Gibco | 14190-136 | |
| 2.0 mL Screw cap tube | Axygen | SCT-200-SS-C-S | |
| 24-well plate | Corning | 3526 | |
| 25 mL Sterile serological pipettes | Labserv | 14955157 | |
| 3,3'Diaminobenzidine (DAB) peroxidase substrate | Thermo Scientific | 34065 | |
| 37 °C incubator with 5% CO2 | Sanyo | MCO-18AIC | |
| 5 mL sterile serological pipette | Labserv | 14955155 | |
| 50 mL centrifuge tube | Falcon | LAB352070 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Corning | 430725U | |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | |
| Anti-flavivirus monoclonal antibody, 4G2 (clone D1-4G2-4-15) | MilliporeSigma | MAB10216 | |
| Autoclaved 20x Phosphate buffered saline (PBS) | N/A | N/A | 22.8 g of 8 mM Na2HPO4, 4.0 g of 1.5 mM KH2PO4, 160 g of 0.14 M NaCl, 4.0 g of 2.7 mM KCl, 1 L of MilliQ H2O |
| Biological safety cabinet, Class II | Holten | HB2448 | |
| CTL S6 Universal ELISpot/FluoroSpot Analyzer | ImmunoSpot, Cellular Technology Limited (CTL) | CTL-S6UNV12 | Commercial software analyzer |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12800-017 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen | SFBS | |
| Goat anti-mouse IgG secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase (HRP) | MilliporeSigma | 12-349 | |
| Hemacytometer | Laboroptik LTD | Neubauer improved | |
| IGEPAL CA-630 detergent | Sigma-Aldrich | I8896 | Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanolIGEPAL |
| Inverted microscope | ZEISS | TELAVAL 31 | |
| Laboratory rocker | FINEPCR | CR300 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Low viscosity carboxymethyl cellulose (CMC) | Sigma-Aldrich | C5678 | |
| Multichannel micropipette (10 – 100 µL) | Eppendorf | 3125000036 | |
| Multichannel micropipette (30 – 300 µL) | Eppendorf | 3125000052 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Single channel pipettes (10 – 100 µL) | Eppendorf | 3123000047 | |
| Single channel pipettes (100 – 1000 µL) | Eppendorf | 3123000063 | |
| Single channel pipettes (20 – 200 µL) | Eppendorf | 3123000055 | |
| Skim milk | Sunlac Low Fat | N/A | Prepare 3% Skim milk in 1x PBS for blocking stage in staining |
| Sodium Hypochlorite | Clorox | N/A | To disinfect any discarded infectious liquid waste from flasks/plates |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Syringe disposable, Luer Lock, 10 mL with 21 G Needle | Terumo | SS10L21G | |
| Vero African green monkey kidney cells | – | ECACC 88020401 | Received from collaborator. However, Vero cells obtained from other suppliers should be able to be used with some optimization. |
References
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